Khảo sát một số đặc tính sinh học và đặc điểm enzyme phytase từ bacillus subtilis BC2

Nguyên liệu chính ñược sử dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi là các loại nông sản như gạo, ngô, khoai, sắn, khô lạc, khô ñậu tương và cỏ… Như chúng ta ñã biết, phospho là nguyên tố cầ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

CÙ THU HÀ

KHẢO SÁT MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ðẶC ðIỂM

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN VĂN GIANG

HÀ NỘI – 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong báo cáo này

là trung thực và chưa hề ñược sử dụng trong bất kỳ một báo cáo khoa học nào Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện báo cáo này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong báo cáo này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2013 Học viên thực hiện

Cù Thu Hà

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong phòng, ban của khoa Công nghệ sinh học trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt cho em những kiến thức vô cùng quan trọng và quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Và cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới gia ñình và bạn bè, những người ñã giúp ñỡ, ñộng viên và tạo ñiều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện ñề tài này TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!

Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2013 Học viên thực hiện

Cù Thu Hà

1.2.6 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy phân axit phytic của

1.3.4 Các ñặc tính lý hóa học của phytase từ Bacillus 23

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học của các chủng vi sinh

2.4.5 Phương pháp ñánh giá hoạt tính phân giải Na-phytate của các chủng

2.4.6 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của các ñiều kiện ñến khả năng sinh

2.4.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa ñến hoạt ñộ phytase 382.4.8 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của các ñiều kiện ngoại cảnh ñến

3.4 đánh giá khả năng phân giải phytate bởi phytase của các chủng vi

3.6 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng BC2 theo thời

3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến quá trình sinh tổng hợp phytase

3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ựến quá trình sinh

3.8.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ựộ tinh bột ựến quá trình sinh tổng hợp

3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH lên hoạt ựộ phytase của chủng BC2 60

DANH MỤC BẢNG

3.12 Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa ñến hoạt ñộ chung của phytase

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

International Union of Biochemistry

DANH MỤC HÌNH

1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 41.2 Cấu trúc hóa học của phytate 41.3 Phản ứng thủy phân phytat bởi enzyme phytase 81.4 Phản ứng thủy giải liên kết ester tại vị trí C3, 4/6, và 5 của phytases trong

vòng inositol cho cấu hình D / L tương ứng (Kerovuo và cộng sự, 2000) 111.5 Cấu trúc không gian 3 chiều của acid phosphatase 121.6 Cấu trúc không gian 3 chiều của β – propeller phytase 121.7 Cấu trúc không gian 3 chiều của purple acid phosphatase 131.8 Các con ñường thủy phân acid phytic của enzyme phytase 253.1 Các chủng vi sinh vật phân giải phytate trên môi trường LB (trái) và môi

ðẶT VẤN ðỀ

1 ðặt vấn ñề

Ngành chăn nuôi có vai trò cung cấp thực phẩm chất lượng cao cho con người, cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, cung cấp sức kéo, phân bón và thức ăn cho nuôi trồng thủy sản… Với quy mô chăn nuôi công nghiệp như hiện nay thì sản phẩm thức ăn chăn nuôi công nghiệp có ảnh hưởng rất lớn ñối với ngành chăn nuôi, là một trong những nguyên liệu sản xuất chính của ngành chăn nuôi, ảnh hưởng trực tiếp ñến chất lượng sản phẩm chăn nuôi

và hiệu quả kinh tế của người sản xuất chăn nuôi Nguyên liệu chính ñược sử dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi là các loại nông sản như gạo, ngô, khoai, sắn, khô lạc, khô ñậu tương và cỏ…

Như chúng ta ñã biết, phospho là nguyên tố cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của ñộng vật, nhưng phospho trong các nguyên liệu trên phần lớn lại tồn tại dưới dạng phân tử axit phytic hoặc phytate ðây là dạng khó hấp thụ trong hệ tiêu hóa của ñộng vật dạ dày ñơn (lợn, gà, cá…) vì trong hệ tiêu hóa của chúng thiếu enzyme phân giải phytate Không chỉ không tận dụng ñược nguồn phospho có sẵn, axit phytic còn ngăn cản sự hấp thụ một số chất khác như protein,

Fe3+, Mg2+, Ca2+, Zn2+… bởi sự tạo thành phức giữa axit phytic với các chất này, gây nên hiện tượng kháng dưỡng ðể bù ñắp cho sự thiếu hụt phospho, người ta phải bổ sung thêm phospho vô cơ vào thành phần thức ăn

Cách làm này vừa lãng phí phospho có trong tự nhiên, vừa gây ô nhiễm môi trường do lượng phospho có trong phytate không ñược hấp thụ bị ñào thải ra môi trường (Sharpley et al., 1994) ðể khắc phục tình trạng này, hướng bổ sung enzyme thủy phân axit phytic (phytase) vào thức ăn ñã và ñang ñược các nhà khoa học quan tâm

Phytase là một enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành myo-inositol và một số gốc phosphat vô cơ tự do Các chất này dễ dàng ñược hấp thụ bởi các ñộng vật dạ dày ñơn Chính vì vậy, việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi giúp tận dụng tối ña nguồn phospho trong các loại nguyên liệu chế biến, ñồng thời nó còn giúp làm giảm chi phí bổ sung lượng phospho vô cơ cần thiết vào

thức ăn chăn nuôi Hơn thế nữa, phytase còn giúp giảm thiểu ô nhiễm phospho vào môi trường do chất thải ñộng vật (Igbasan et al., 2001) Do có ý nghĩa to lớn như vậy, phytase ñã ñược thương mại hóa cách ñây hơn 10 năm (Stefan Haefner et al., 2005) Hiện nay, trên thị trường ñang có nhiều loại sản phẩm enzyme phytase thuộc

nhiều thế hệ khác nhau.Thế hệ phytase ñầu ñược sản xuất từ nấm Aspergillus, tiếp

ñó là Peniophora, thế hệ phytase mới nhất ñược sản xuất từ E Coli Kết quả nghiên

cứu ở Canada ñã cho thấy hiệu suất giải phóng P của phytase từ E Coli cao hơn rõ

ràng so với phytase sản xuất từ nấm khi sử dụng cùng liều lượng và trong cùng ñiều kiện [3] Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn ñược sử dụng cho thực phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo ñất trồng Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase ñã và hiện là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học [4] Với ñặc ñiểm là một ñất nước có khí hậu nhiệt ñới gió mùa, có sự ña dạng lớn về ñịa hình và hệ sinh thái tạo nên sự ña dạng phong phú của các loài vi sinh vật, cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại,

chúng tôi ñã tiến hành ñề tài “Khảo sát một số ñặc tính sinh học và ñặc ñiểm

enzyme phytase từ Bacillus subtilis BC 2” nhằm tìm kiếm vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là chủng an toàn, ñáp ứng nhu cầu trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm

Khảo sát các ñặc tính sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn

Khảo sát một số ñặc tính của enzyme phytase sinh từ chủng vi khuẩn tuyển chọn Nội dung nghiên cứu

• Phân lập Bacillus spp từ các nguồn khác nhau và khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của các chủng Bacillus spp., chọn chủng có hoạt ñộ phytase cao nhất

• Xác ñịnh nguồn gốc di truyền của chủng vi khuẩn phân lập ñược

• Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym phytase theo thời gian nuôi cấy

• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng sinh enzym phytase của chủng vi khuẩn tuyển chọn (nhiệt ñộ, pH, cơ chất, ion kim loại)

• Khảo sát các tác nhân tủa khác nhau ñến hoạt ñộ chung của phytase từ

chủng Bacillus tuyển chọn (ethanol, aceton, (NH4)2 SO4)

• Khảo sát các yếu tố tối ưu cho hoạt ñộng của enzyme phytase từ chủng vi khuẩn tuyển chọn (nhiệt ñộ, pH)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về acid phytic và phytate [6, 25, 26, 27]

1.1.1 ðịnh nghĩa

Acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakis dihydrogen phosphate)

là ester của rượu inositol và axit phosphoric Công thức tổng quát là C6H18O24P6)

(IUPAC – IUB, 1968)

Phytate là dạng muối của axit phytic với các cation kim loại, phytate ñược

coi là hình thức lưu trữ chính của phospho trong thực vật

1.1.2 Cấu trúc hóa học của acid phytic [6, 27]

Năm 1897, tên “inositol-phosphoric acid” ñược ñề xuất bởi Winterstein và

sau ñó ñược sửa ñổi thành “myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis dihydrogen

phosphate” bởi IUPAC-IUB vào năm 1968

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của acid

phytic [18]

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của

phytate [19]

Từ cấu trúc trên cho thấy, acid phytic có nhiều mức ñộ tích ñiện khác nhau

trong một phổ pH rộng vì mười hai nguyên tử hydro có khả năng phân ly với các

hằng số phân ly khác nhau, sáu nguyên tử có pKa 1,84 (phân ly mạnh), 2 nguyên tử

có pKa 6,3 (phân ly yếu) và 4 nguyên tử còn lại có pKa 9,7 (phân ly rất yếu) Tính

chất này khiến IP6 (inositol hexakisphosphate) là một tác nhân tạo phức rất mạnh

Các ñiện tích âm của IP6 có thể phức hợp với các thành phần tích ñiện dương của

Formatted: Font: Italic, Font color:

Blue

một số ion kim loại, peptide, protein và tinh bột

Acid phytic có khả năng kết hợp mạnh mẽ với các nguyên tố khoáng như canxi, sắt, magiê, kẽm… trở thành một phức hợp khó hòa tan, không thể hấp thụ ñược trong ñường tiêu hóa của con người hay ñộng vật dạ dày ñơn Ngoài ra acid phytic còn có khả năng gắn kết với một số chất dinh dưỡng như protein, axit amin, tinh bột và do ñó cũng làm giảm giá trị dinh dưỡng của các chất này, gây nên hiện tượng kháng dưỡng (Pallauf và Rimbach., 1996) ðây chính là nguyên nhân dẫn ñến suy dinh dưỡng, loãng xương, còi xương…

1.1.3 Sự tồn tại của acid phytic và phytate trong tự nhiên

Acid phytic và phytate ñược tìm thấy nhiều trong mô thực vật, ñặc biệt là trong các loại hạt của cây thuộc họ hòa thảo (lúa mì, lúa mạch …) và các loại hạt của cây họ ñậu Acid phytic là hình thức lưu trữ chủ yếu của phospho trong mô thực vật nhưng phospho ở dạng này nói chung là không có vai trò dinh dưỡng với con người và ñộng vật dạ dày ñơn vì thiếu enzyme tiêu hóa phytase (Mullaney EJ, Daly CB, Ullah AH 2000)

Bảng 1.1: Hàm lượng phytate và phospho trong các sản phẩm cây trồng [2]

Nguồn

Tỷ lệ phospho tổng số ( % )

Hàm lượng phospho trong muối phytate (g/100g )

Tỷ lệ % phospho trong phytate ñối với phospho tổng số ( % )

Trong thực vật, 50-80% tổng lượng phosphorus (P) tồn tại dưới dạng phytate hay acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexadihydrogenphosphate) rất khó tiêu hoá và hấp thu (Harland và Morris, 1995)

Acid phytic tập trung nhiều trong các hạt ngũ cốc ở giai ñoạn chín Trong ngũ cốc, hàm lượng phytate ñược tìm thấy cao nhất là ở ngô (0,83 – 2,22%) và ở các cây họ ñậu thì trong ñậu dolique (5,92 – 9,15%) (Reddy et al, 1989)

1.1.4 Chức năng sinh lý của acid phytic

Trong hạt ngũ cốc, axit phytic ñược biết ñến với các chức năng sinh lý sau:

là nguồn dự trữ phospho, là nguồn cung cấp năng lượng cho hoạt ñộng sống của tế bào, là nguồn chứa ñựng các cation và myo-inositol, khởi ñộng quá trình ngủ nghỉ của hạt

Axit phytic có một số vai trò quan trọng, Axit phytic ñóng vai trò như là một chất chống oxi hóa tự nhiên trong suốt quá trình ngủ của hạt giống (Graf et al., 1987) ðặc tính chống oxi hóa của axit phytic dựa trên giả ñịnh rằng, axit phytic ngăn chặn sự hình thành các gốc hydroxyl sắt

Axit phytic ñã ñược chứng minh có tác dụng chống ung thư trực tràng và ung thư vú ở một vài ñộng vật có vú Sự hiện diện của axit phytic chưa bị phân giải trong ruột kết có thể bảo vệ chống lại sự phát triển của ung thư trực tràng (Dvorakova, 1998)

Các nghiên cứu trong cuối những năm 1980 ñã xác ñịnh vai trò của inositol phosphat là chất trung gian trong vận chuyển vật liệu vào trong tế bào Vai trò của các inositol phosphat, ñặc biệt là của inositol triphosphat, có vai trò dẫn truyền tín hiệu và quy ñịnh chức năng tế bào trong tế bào thực vật và ñộng vật (Wodzinski và Ullah, năm 1996)

1.1.5 Ảnh hưởng của acid phytic [6, 24]

Theo Pallaurf và Rimbach (1996), axit phytic là một chất ñối kháng dinh dưỡng Do cấu trúc ñặc biệt của axit phytic, 6 nhóm phosphat của axit phytic ñều phân ly nên axit phytic có tổng cộng mười hai ñiện tích âm Vì vậy, axit phytic có khả năng liên kết với các cation hóa trị khác nhau hình thành phức muối phytate không hòa tan trong ñường ruột, ngăn ngừa sự hấp thụ các chất khoáng, làm giảm

giá trị dinh dưỡng của các chất khoáng ñó (Davies, 1982) Theo nghiên cứu của Rimbach và Pallauf (1992) về ảnh hưởng của axit phytic ñối với sự hấp thụ kẽm ở chuột cho thấy, bổ sung axit phytic ñã có một ảnh hưởng tiêu cực rõ ràng ñến sự hấp thụ kẽm và sự tăng trọng lượng ở chuột ñang phát triển

Axit phytic tương tác với protein tạo thành phức hợp protein phytate Phức hợp protein phytate ñược hình thành bởi liên kết giữa các nhóm phosphat của axit phytic với các axit amin tích ñiện dương của protein (De Rham và Jost,1979; Fretzdorff et al., 1995) Bằng cách liên kết với protein, axit phytic làm giảm khả năng tiêu hóa protein của cơ thể ñộng vật, do ñó cũng làm giảm giá trị dinh dưỡng của chúng

Ngoài ra, axit phytic còn tương tác với các enzyme tiêu hóa như trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, kết quả là làm giảm sự hoạt ñộng của các enzyme này, kéo theo ñó làm giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng mà các enzyme này phân giải.(Deshpande and Cheryan, 1984; Singh and Krikorian, 1982; Inagawa

Phản ứng thủy phân phytate của phytase:

Myo – inositol hexakisphosphat + H2O → D-myo-inositol 1,2,4,5,6- pentakisphosphat + phosphat

Bổ sung phytase vào thức ăn cho vật nuôi có thể làm giảm nhu cầu bổ sung nguồn phospho vô cơ vào thức ăn chăn nuôi và giảm thấp sự bài tiết phospho vào trong phân, từ ñó hạn chế ñược ô nhiễm phospho vào trong ñất và nước ngầm Ô nhiễm phospho vào trong ñất và nước ngầm là vấn ñề ñang ñược các nhà môi trường học trên thế giới rất quan tâm và tìm nhều biện pháp ñể khắc phục

Hình 1.3 Phản ứng thủy phân phytat bởi enzyme phytase [17]

1.2.2 Các nguồn thu nhận enzyme phytase [30, 34, 35]

1.2.2.1 Nguồn vi sinh vật

Năm 1968, Sheh và Ware ñã tiến hành phân lập từ ñất hơn 2000 chủng vi sinh vật có khả năng sinh phytase Hầu hết các chủng ñược phân lập cho sản phẩm enzyme nội bào, chỉ có khoảng 30 chủng ñã phân lập cho sản phẩm phytase ngoại bào Tất cả các phytase ngoại bào ñều là sản phẩm của vi nấm, 28 chủng thuộc

Aspergillus, một chủng thuộc giống Penicillium và một chủng thuộc giống Mucor Các nghiên cứu ñã khẳng ñịnh A niger sinh tổng hợp phytase ngoại bào

tốt nhất

Các nghiên cứu của Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy

Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào ðến năm 1998, Kim

và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh Bacillus amyloliquefaciens cũng có khả

năng sinh tổng hợp phytase

Một số nấm men cũng có khả năng sinh tổng hợp phytase, trong ñó các

chủng như Schwanniomyces castellii, Arxula adenivorans, Picchia spartinae và

Pichia rhodannesis cho sản phẩm phytase ngoại bào Ngược lại, Saccharomyces

cerevisiae và Pichia anomala sinh tổng hợp phytase nội bào

1.2.2.2 Nguồn thực vật

Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ các loại ñậu như ñậu nành, ñậu trắng,… Phytase cũng ñược tìm thấy trong mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998) Trong hạt ñang nảy mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin (Greene

và cộng sự, 1975) Suzuki và cộng sự (1907) là những người ñầu tiên sản xuất chế phẩm phytase từ cám gạo và lúa mì

Một số nghiên cứu ñã tiến hành tinh sạch và xác ñịnh các ñặc tính của phytase chiết tách từ hạt bắp vàng ñang nảy mầm Rễ cây của một số loại thực vật cũng có chứa phytase , tuy hàm lượng thấp nhưng cũng ñã ñược nghiên cứu, xác ñịnh

1.2.2.3 Nguồn ñộng vật

Collum và Hart (1908) ñã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase cũng phát hiện trong máu các ñộng vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển (Rapoport et al, 1914) Vì phytate hoạt ñộng như một nguyên tố kháng dưỡng trong cơ thể ñộng vật nên các nhà khoa học ñã quan tâm và khảo sát hoạt ñộng của phytase trong ñường tiêu hóa của nhiều loài ñộng vật Phytase ñược tìm thấy trong ñường ruột (Patwaradha, 1937) của heo, cừu, bò (Spitzer và Phillip, 1972) Tuy nhiên, phytase trong hệ ñộng vật không ñóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa phytate (Williams và Taylor, 1985)

Phytase ruột người có hoạt tính thấp 30 lần so với phytase từ ruột chuột và cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hóa phytate, phytate ñược tiêu hóa trong hệ tiêu hóa người nhờ lượng phytase trong thực phẩm (Frolich, 1990) ðộng vật nhai lại tiêu hóa ñược phytate nhờ hoạt ñộng của phytase ñược sản xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ Lượng phosphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt ñộng của phytase lên phytate ñược cả hệ vi sinh vật ñường ruột và vật chủ sử dụng (Kerovuo et al., 2000)

Bảng 1.2: Các nguồn cung cấp phytase Nguồn Vị trí enzyme Tài liệu tham khảo

Nấm mốc

Nấm men

Vi khuẩn

Thực vật

Dịch nhờn trong ruột loài

gặm nhấm

ðộng vật

IN: enzym nội bào 2: trong lưới nội chất

1.2.3 Phân loại [22]

1.2.3.1 Dựa trên vị trí của nhóm phospho ñầu tiên bị enzyme tác ñộng

Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB, IUPAC-IUB, JCBN ñã chia phytase thành 3 loại:

EC 3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase

(myo-inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase), Enzyme loại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphat, cho sản phẩm là D-myo-inositol 1,2,4,5,6 – pentakisphosphat và orthophosphate ðây là dạng thường gặp ñối với các phytase

có nguồn gốc vi sinh vật

EC 3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase

(myo-inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase) Enzyme loại này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphat cho sản phẩm là D-myo-inositol 1,2,3,4,5 – pentakisphosphat và orthophosphate 6-phytase là dạng thường gặp ñối với phytase

có nguồn gốc thực vật

EC 3.1.3.72: tên thông thường 5-phytase là các phytase kiềm từ phấn hoa

lily Enzyme này thủy giải liên kết ester tại vị trí thứ 5 của myo - inositolhexakisphosphat

Hình 1.4: Phản ứng thủy giải liên kết ester tại vị trí C3, 4/6, và 5 của phytases trong vòng inositol cho cấu hình D / L tương ứng (Kerovuo và cộng sự, 2000)

1.2.3.2 Dựa trên sự khác biệt trình tự aminoacid thủy phân của phytase

Các nhà khoa học ở một số tổ chức nghiên cứu như Trung tâm thông tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney và Ullah (2007) ñã phân loại phytase thành 4 nhóm:

Nhóm thứ 1 (HAP):axit phosphatase hoặc axit histidin phosphatase ðặc

ñiểm chung có trung tâm hoạt ñộng là RHGXRXP và quá trình thủy giải

hosphomonoester gồm các bước giống nhau Enzyme nhóm HAP ñược tìm thấy

trong bactertia như E coli và một số loại nấm như Aspergillus niger và A.fumigatus

Hình 1.5: Cấu trúc không gian 3 chiều của acid phosphatase

Nhóm thứ 2 (BPP) là các β-propeller phytase, chủ yếu là các enzyme của

Bacillus Không có trung tâm hoạt ñộng là RHGXRXP.Cho ñến nay, việc phân lập, xác ñịnh các gen ñiều khiển hoạt ñộng của phytase thuộc nhóm này chưa ñầy ñủ

Các nghiên cứu cho thấy, hiện có hai loại phytase của Bacillus ñã ñược xác ñịnh, ñó

là phyC do Kerovuo và các cộng sự phát hiện vào năm 1998 và TS-phy do Kim và các cộng sự phát hiện năm 1998

Hình 1.6: Cấu trúc không gian 3 chiều của β – propeller phytase

Nhóm thứ 3 (CP): CysCystein phosphatses có chuỗi acid amin khác nhau

ñó là HCXXGXXR (T / S) enzyme có thể ñược tìm thấy trong vi khuẩn kỵ khí ở dạ

cỏ như Selenomonas ruminantium

Nhóm thứ 4 (PAP): Có chứa các chuỗi acid amin khác nhau ñược DXG

GDXXY GNH (E, D) VXXH GHXH trong trung tâm hoạt ñộng Bao gồm các purple axit phosphatase Gm-phy ñược chiết tách từ lá mầm của ñậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzyme này

Hình 1.7: Cấu trúc không gian 3 chiều của purple acid phosphatase

1.2.4 Các ñặc tính lý, hóa của phytase [7, 34]

1.2.4.1 Cấu tạo và trọng lượng phân tử

Hầu hết các phytase ñã ñược xác ñịnh là các enzyme ñơn phân tử Ví dụ như phytase của vi nấm (Wyss và cộng sự, 1999, Ullah và Gibson, 1987; Dvorakova et

al, 1997), E.coli và Klebsiella terrigena (Greiner và cộng sự, 1993; Greiner và cộng sự, 1997), Bacillus subtilis (Shimizu, 1992) Tuy nhiên, phytase của một số

ñộng, thực vật ñược hình thành từ nhiều tiểu ñơn vị Phytase ñược hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp ñược xác ñịnh là một enzyme gồm hai tiểu ñơn vị có trọng lượng 38kDa (Laboure và cộng sự, 1993) Phytase ñược tinh sạch từ ruột của chuột, qua kết quả ñiện di cho thấy có hai loại protein với kích thước là 70 và 90kDa (Yanget al.,1991b)

Phytase của Klebsiella aerogenes có hai dạng khác nhau, một là dạng

enzyme tự nhiên, có kích thước khá lớn, 70kDa, dạng còn lại cũng có ñầy dủ các phần ñẳm bảo cho hoạt ñộng của enzyme và có trọng lượng phân tử rất thấp, chỉ từ

10 – 13 kDa (Tambe và cộng sự,1940) Phytase của vi nấm hầu hết có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của nấm Theo tính toán lý thuyết, phytase của nấm có trọng

lượng phân tử khoảng 50 Kda, kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho kết quả trong khoảng 65 – 70 kDa, trong ñó phần nặng nhất là các gốc glycosyl hóa (Ullah., 1988) Trọng lượng và kích thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein hoàn chỉnh và số lượng các tiểu ñơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau ñược trình bày trong bảng sau:

Bảng 1.3: trọng lượng phân tử một số phytase [31]

Nguồn phytase

Trọng lượng theo lý thuyết (kDa)

Trọng lượng thực nghiệm (kDa)

Số lượng tiểu ñơn

Xác ñịnh bằng ñiện di trên gel SDS

(-): chưa xác ñịnh

1.2.4.2 Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ có ảnh hưởng ñến hoạt tính của enzyme Enzyme có bản chất là protein nên không bền dưới tác dụng của nhiệt ñộ Mỗi enzyme có một nhiệt ñộ tối thích khác nhau, phần lớn nhiệt ñộ tối thích của mỗi enzyme phụ thuộc vào nguồn cung cấp enzym ñó Nhiệt ñộ thích hợp cho các enzyme hoạt ñộng thường ở trong khoảng từ 40-60oC, cũng có enzyme có nhiệt ñộ tối thích rất cao như enzyme của những chủng ưa nhiệt ða số các enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt ñộ hơn 70oC (Lê Ngọc Tú, 2004)

Nhiệt ñộ tối ưu của phytase ở các nguồn khác nhau sẽ khác nhau Nhiệt ñộ tối ưu của phytase dao ñộng từ 45–77oC Khi nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của

Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, các nhà khoa học ñã xác ñịnh phytase của

A.niger không có khả năng chịu nhiệt Ở nhiệt ñộ khoảng 50–55oC, phytase của

A.niger bị biến tính, kết quả là làm giảm 70–80% hoạt ñộ enzyme Phytase của

A.fumigatus bền với nhiệt, có khả năng hồi tính, ñảm bảo ñầy ñủ hoạt ñộ sau khi biến tính ở 90oC (Wyss và cộng sự, 1999)

1.2.4.3 pH [2, 7, 8, 30]

Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng ñến hoạt tính xúc tác của enzyme Enzyme rất nhạy cảm với sự thay ñổi pH của môi trường Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt ñộng mạnh nhất ở một vùng pH xác ñịnh gọi là pH tối thích

ðộ pH ảnh hưởng ñến hoạt tính của enzyme do pH làm thay ñổi trạng thái ion hóa của enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng ñến ñiện tích và khả năng tích ñiện của enzyme và

cơ chất, có thể làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme, do ñó hoạt tính của enzyme sẽ bị giảm hoặc thậm chí mất hẳn

pH tối ưu (pHop) của phytase từ các nguồn khác nhau sẽ khác nhau pHop của phytase dao ñộng trong một biên ñộ khá lớn, từ 2,2-8,0 Hầu hết phytase của vi sinh vật, ñặc biệt là của nấm, pH tối ưu trong khoảng 4,5-5.6 Phytase của

A.fumigatus có phổ pH tối ưu khá rộng, hoạt ñộ cao nhất ñược xác ñịnh ở trị số pH

từ 4,0-7,3 pH tối ưu của phytase từ các hạt thực vật dao ñộng từ 4,0-7,5, pHoptrong khoảng 4,0-5,6 Hai phytase của thực vật có tính kiềm (hạt ñậu và phấn hoa lily) có pHop là 8,0 Phytase từ ñộng vật ña số hoạt ñộng ở pH kiềm, từ 7,4 - 8,7

Bảng 1.4: Nhiệt ñộ và pH tối ưu của một số phytase

Aspergillus oryzae 5,5 50 Shimizy (1993)

A.niger 2.2; 5,0-5,5 58 Ullah and Gibson (1987)

Klebsiella sp 6 37 Shah and Parekh (1990)

K.terigena 5 58 Greiner et al (1997)

Citrobacter freundii 2,7; 5,0 52 Delucca et al (1992)

Escherichia coli 4,5 55 Greiner et al (1993)

Bacillus subtilis (nato) 6,0-6,5 60 Kim et al (1998)

Typha latifolia (Hạt

phấn)

(-): chưa xác ñịnh

1.2.4.4 Ion kim loại và một số chất hóa học [2, 30]

Các ion kim loại ñược xem là các tác nhân ảnh hưởng trực tiếp ñến hoạt ñộ phytase Tuy nhiên, rất khó ñể xác ñịnh rõ các ảnh hưởng khác nhau của các kim loại ñến hoạt ñộ phytase vì axit phytic liên kết trực tiếp với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng phức chất không hòa tan, do ñó làm giảm mức ñộ hoạt ñộng của cơ

chất Phytase của Enterobacter sp.bị ức chế bởi các ion Zn2+, Ba2+, Cu2+ và Al3+

(Yoon et al., 1996) Phytase của B subtilis N-77 bị ức chế bởi các ion kim loại như

Zn2+, Ba2+, Cu2+, Cd2+, Fe2+ và Al3+ (Shimizu., 1992)

Theo nghiên cứu của Wyss và các cộng sự (1999), ion Cu2+ ñược xác ñịnh là

có khả năng làm giảm hoạt ñộ của enzyme phytase có nguồn gốc từ

Emericella nidulans và Aspergillus terrus Phytase của Aspergillus fumigatus bị

ức chế bởi một số ion kim loại thông thường

Vai trò của ion kim loại ñối với phytase phải ñược xem xét trên từng loại ñối tượng cụ thể Ion Ca2+ ñóng một vai trò quan trọng ñối với hoạt ñộ của phytase Khi thêm tác nhân Ca2+ vào phytase của Bacillus, phytase có nguồn gốc phấn hoa

Typha latifolia và phytase của một số loại thực vật khác thì hoạt ñộ có thể ñạt ñến giá trị tối ưu (Hara et al., 1985; Gibson và Ullah., 1988; Labour et al., 1993; Scott

và Loewus., 1986) Ngoài Ca2+, một số kim loại khác cũng có khả năng làm tăng hoạt ñộ của enzyme, ví dụ như ion Zn2+, ở nồng ñộ 20-80µM, có thể làm tăng 40% hoạt ñộ phytase ở chuột; ion Fe2+ cũng có tác dụng làm tăng hoạt ñộ của phytase

1.2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng khác

Nồng ñộ cơ chất:

Nồng ñộ cơ chất khoảng 300µM (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakis dihydrogen phosphate) cũng có khả năng ức chế phytase và các enzyme có chức

năng gần giống phytase ở Paramecium (Freund et al., 19920) Phytase của

Klebsiella sp và Rhizopus oligosporus cũng bị ức chế bởi cơ chất (Shah và

Parekh, 1990; Sutardi và Buckle, 1988), nhưng chỉ trong trường hợp nồng ñộ cơ chất cao Hoạt ñộ phytase nấm bị ức chế bởi cơ chất ở nồng ñộ trên 1mM (Ullah, 1988) Phytase ở rễ bắp và ñậu nành bị ức chế ở nồng ñộ cơ chất 300µM và 20mM (Hubel và Beck, 1996; Sutardi và Buckle, 1986)

Các chất có cấu tạo tương tự cơ chất:

Một chất có cấu tạo tương tự cơ chất như myo- inositol hexasulfat, cho thấy

có khả năng cạnh tranh hiệu quả, trở thành tác nhân ức chế của cả phyA và phyB

của A.ficuum

1.2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase ở vi sinh vât

Phytase là sản phẩm ñược vi sinh vật tổng hợp trong quá trình sinh trưởng Ở

một số vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn Bacillus…) phytase ñược tiết vào môi trường

nuôi cấy, một số vi sinh vật khác, phytase chỉ ñược tích trữ trong tế bào của chúng Phytase thực chất là protein nên cơ chế tổng hợp của phytase tương tự như những protein khác Operon ñiều hòa phytase là operon cảm ứng, gen mã hóa cho enzyme phytase gọi là gen appA Hoạt ñộng của appA tùy thuộc vào nhân tố sigma σs - mã hóa bởi gen rpoS Khi môi trường thiếu phospho và có nhiều phytate, rpoS ñược cảm ứng biểu hiện mạnh, theo sau ñó là sự tổng hợp phytase (Janne Kerovuo, 2000) Một số nghiên cứu cho thấy phytase ñược tổng hợp trong pha ổn ñịnh, sau pha tăng trưởng

Ngoài phytate là cơ chất cảm ứng cho sinh tổng hợp phytase, các yếu tố dinh dưỡng khác như nguồn carbon, nitơ, khoáng cũng có ảnh hưởng ñến mức ñộ

sinh tổng hợp phytase Ví dụ như, vi khuẩn Raoultella terrigena tổng hợp nhiều

phytase khi môi trường thiếu nguồn carbon Trong khi ñó, nồng ñộ carbon và nitơ

không ảnh hưởng ñến sự tổng hợp phytase của E.coli, sự tổng hợp phytase của

E.coli chỉ chịu ảnh hưởng bởi sự thiếu phospho vô cơ Hàm lượng phospho vô cơ ảnh hưởng ñến sự tổng hợp phytase của ña số nấm mốc, nấm men, vi khuẩn trừ

Raoultella terrigena và các vi khuẩn trong dạ cỏ của ñộng vật nhai lại [32]

1.2.6 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy phân axit phytic của phytase

Axit phytic có 6 nhóm phosphat có thể ñược giải phóng bằng phytase với tỷ

lệ và trình tự khác nhau Nghiên cứu của Wyss và các cộng sự năm 1999 về ñộng học quá trình giải phóng phosphat và ñộng học của các phản ứng trung gian, ñã chứng minh rằng tất cả các phytase của nấm ñã nghiên cứu ñều giải phóng 5 hoặc 6 nhóm phosphat, sản phẩm cuối là myo - inositol 2 - monophosphat Trong một số trường hợp hiếm có ñã phát hiện sự tồn tại của các myo-inositol 1-monophosphat ở dạng tự do

Có một thực tế là các sản thu ñược từ sự thủy phân axit phytic về cơ bản ñều giống nhau 3-phytase bắt ñầu thủy phân các liên kết ester của phosphat ở vị trí D -

3 tạo thành D - inositol (1,2,4,5,6) pentakisphosphat như là sản phẩm thứ cấp 6- phytase bắt ñầu thủy giải ở vị trí L - 6 hoặc D - 4 tạo thành L - Inositol(1,2,3,4,5) pentakisphosphat như là sản phẩm thứ cấp ñầu tiên Alkaline phytase của phấn hoa Lily thì bắt ñầu thủy phân axit phytic ở vị trí D - 5, với 2 bước tiếp theo là dephosphoryl hóa tạo thành Inositol (1,2,3) triphosphat như là sản phẩm cuối cùng Inositol triphosphat cũng là sản phẩm cuối của axit phytic ñược thủy phân bởi

phytase của phấn hoa Typha latifolia

1.2.7 ðộng học của phystase [2, 34]

Cho ñến nay, hầu hết các phytase ñược nghiên cứu tuân theo ñộng học

Michaelis–Menten, ngoại lệ có phytase của Myceliophthora thermophie và

Emericella nidulans hoạt ñộng không theo ñộng học trên Ở ñiều kiện thích hợp, chỉ có một tỉ lệ của phản ứng từ myo-inositol hexakisphosphat thành pentakisphosphat ñược xác ñịnh Ullah và Philippy (1994) ñã xác ñịnh các thông số ñộng học của phytase Aspergillus ficuum và hai axit phosphatase với cơ chất là myo-inositol hexa-, penta-, tetra-, và triphosphat Phytase có trị số Km thấp nhất trong 3 loại enzyme Các nhà nghiên cứu kết luận rằng cả hai enzym phytase và axit phosphatase ñều có khả năng thủy phân ñối với myo–inositol phosphat

Các hoạt ñộ riêng của phytase của nấm với cơ chất là axit phytic hầu hết từ trên 23 ñến 198UI/mg Hoạt ñộ ñặc hiệu của phytase vi khuẩn có trị số biến thiên trong khoảng 100 lần, từ 8,7-811UI/mg

1.2.8 Ứng dụng của enzyme phytase [9, 10, 31, 34]

1.2.8.1 Ứng dụng của phytase trong sản xuất thức ăn gia súc, gia cầm

ðộng vật nhai lại tiêu hóa phytate thông qua hoạt ñộng của các phytase ñược tạo thành bởi các vi sinh vật trong dạ cỏ Vi khuẩn và nấm sinh trưởng kị khí trong ruột là các vi sinh vật cơ bản tham gia vào quá trình phân giải phytate trong dạ cỏ Các ion phospho thu nhận ñược từ sự thủy phân phytate bởi phytase ñược chính

cơ thể ñộng vật nhai lại và hệ vi sinh vật trong dạ dày của ñộng vật nhai lại sử dụng Khác với ñộng vật nhai lại, heo, gia cầm và cá ñều không có khả năng hấp thụ axit phytic, bởi chúng không có enzym phytase trong dạ dày và ruột Vì thế, ion phospho ñược thêm vào thức ăn của chúng ñể bổ sung nhu cầu phosphat

Theo nghiên cứu của S.E.Scheldeler năm 2002, khi bổ sung vào khẩu phần

ăn của gà Broiler mái sẽ nâng cao khả năng tăng trọng trong khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện chất lượng xương chân; ñối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng chuyển hóa thức ăn và sức sống

Việc bổ sung vào thức ăn của ñộng vật một hàm lượng phytase thích hợp sẽ tạo khả năng ñồng hóa phosphat trong quá trình tiêu hóa thức ăn và làm giảm bớt hàm lượng phospho trong phân, ñiều ñó có lợi cho môi trường Tác ñộng của thức

ăn có phytase ñối với ñộng vật trong vấn ñề ô nhiễm môi trường ñã ñược xác ñịnh Nếu sử dụng phytase trong thức ăn gia súc cho tất cả các ñộng vật ở Mỹ với một lượng phù hợp, nó sẽ giải phóng một lượng phospho trị giá 68 triệu USD, tương ứng với 8,23.104 tấn phosphat thải ra môi trường mỗi năm Việc sử dụng phytase như là một chất bổ sung vào thức ăn gia súc ñã ñược áp dụng ở 22 nước Tổ chức FDA (The Food and Drus Administration) ñã chấp thuận phytase ñạt tiêu chuẩn là chất không gây ñộc hại

1.2.8.2 Ứng dụng của phytase trong sản xuất thực phẩm

Với một chế ñộ ăn uống giàu ngũ cốc, ñậu, ñậu nành sẽ làm tăng lượng phytate vào cơ thể Phytate không ñược tiêu hóa sẽ ảnh hưởng xấu ñến việc hấp thụ

Zn2+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, làm giảm khả năng chuyển hóa protein Theo Simell và cộng

sự (1989), phytate ñược tách từ protein ñậu nành tăng khả năng hòa tan tại pH thấp (pH 3) Anno và cộng sự (1985) ñã tiến hành loại bỏ phytate từ sữa ñậu nành bằng cách sử dụng phytase lúa mì Tuy nhiên, cần tiến hành nhiều nghiên cứu về vấn ñề này trước khi chấp nhận phytase như một chất phụ gia thực phẩm

1.2.8.3 Ứng dụng của phytase trong sản xuất myo – inositol phosphat

Myo- inositol phosphat và phospholipid ñóng vai trò quan trọng trong vận chuyển tín hiệu qua màng và tăng sự tập trung ion Ca2+ nội bào (Billington, 1993) ðồng thời Inositol (1,2,5) triphosphat hoạt hóa các enzym phụ thuộc ion

Ca2+ trong ñó protein kinase C là yếu tố kích thích quá trình chuyển hóa nhóm phosphat từ ATP ñến nhiều loại protein trong tế bào chất và hoạt hóa chúng ðặc biệt là các inositol triphosphat ñã chứng tỏ là có khả năng ngăn chặn hoặc giảm bớt bệnh trầm cảm, làm giảm bớt các trường hợp liên quan ñến sự khác

thường của neuropeptid Y (NPY) Trong số ựó bao gồm các bệnh như viêm khớp và các bệnh về ựường hô hấp như bệnh hen suyễn Việc sử dụng inositol triphosphat như thuốc giảm ựau ựã ựược nghiên cứu và ựề nghị cho sử dụng đáng chú ý, ester của inositol triphosphat có khả năng ức chế ngược trở lại các virus gây nhiễm trùng bao gồm cả HIV

Các ứng dụng trong y học kể trên của myo-inositol phosphat ựã thu hút nhiều công trình nghiên cứu, sản xuất hợp chất này Việc sản xuất myo-inositol phosphat bằng con ựường hóa học khá phức tạp, ựòi hỏi nhiệt ựộ và áp suất cao [35] Trong khi ựó, việc sản xuất myo-inositol phosphat bằng cách sử dụng phytase

là một phương pháp ựược chọn lựa thay cho việc tổng hợp hóa học Ngoài ra, inositol phosphat còn có thể ựược sử dụng cho việc nghiên cứu các ựặc tắnh sinh hóa và quá trình trao ựổi chất

myo-1.2.8.4 Gia tăng ựộ phì của ựất trồng

Findenegg và Nelemans (1993) nghiên cứu phytase trên hàm lượng phospho

dễ tiêu trong ựất trồng bắp (ngô) Kết quả cho thấy, hàm lượng phytase ựược bổ sung vào ựất tỉ lệ thuận với lượng phytate ựược phân giải, cây bắp phát triển tốt Nghiên cứu này cũng cho thấy sự gia tăng hàm lượng phytase trong rễ bắp có thể gia tăng hàm lượng phospho trong rễ cây Idriss et al.(2002) nhận thấy, phytase tiết

ra từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefacien FZB45 kắch thắch sự phát triển của cây bắp

con trồng trong môi trường có sự kiểm soát hàm lượng phospho bởi phytate Kết quả này một lần nữa chứng minh vi sinh vật ựất tổng hợp phytase rất có

ý nghĩa ựến dinh dưỡng phospho của cây(Richardson et al., 2001)

1.3 Bacillus và phytase của Bacillus

1.3.1 Vài nét về Bacillus

Trong các giống vi khuẩn, Bacillus là giống có mức ựộ phổ biến cao và có

nhiều công trình nghiên cứu về ựặc ựiểm, sinh lý cũng như khả năng cảm ứng, sinh

tổng hợp các loại enzyme Bacillus là vi khuẩn gram dương, hình que, sống hiếu

khắ, có khả năng sinh bào tử và khi sinh bào tử thì không làm biến dạng hình thái tế bào (Lương đức Phẩm, 2004)

đây là những vi khuẩn phân bố rất rộng trong tự nhiên, nhất là trong ựất, nơi

chúng tham gia tích cực vào sự phân hủy chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinhnhieeuf loại enzym ngoại bào [11] Chính vì Bacillus thường xuyên có mặt trong ñất mà Winogradsky ñã gọi chúng là các vi khuẩn của ñất

Hầu hết các chủng Bacillus ñều có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ

như ñường, amino acid, các acid hữu cơ Trong một số trường hợp, chúng cũng có thể sử dụng các hợp chất carbonhydrat trong một hỗn hợp phản ứng có sản phẩm là

glycin và các dẫn xuất butanol Một số chủng như Bacillus megaterium, không cần

thiết có sự tham gia của các nhân tố hữu cơ trong quá trình phát triển; một số chủng khác thì cần các amino acid, vitamin B hoặc cả hai Phần lớn các chủng trong giống

Bacillus có nhiệt ñộ sinh trưởng ở mức trung bình, với nhiệt ñộ tối ưu từ 300C ñến

450C, tuy nhiên, cũng có một số chủng có mang các gen chịu nhiệt với nhiệt ñộ tối

ưu khá cao, khoảng 650C Trong ñiều kiện phòng thí nghiệm, với các ñiều kiện tối

ưu cho quá trình phát triển, các chủng Bacillus có thời gian sinh trưởng khá ngắn, khoảng 24 giờ

Các chủng Bacillus ñược nghiên cứu khá nhiều, ñặc biệt là trong việc sử dụng

ñể tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau: amylase, protease, phytase….Một vài nghiên cứu (Idriss và cộng sự, 2002 ; Richardson và cống sự 2001) cho thấy một số

chủng Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens ñóng vai trò tích cực

trong quá trình phát triển của thực vật trong ñiều kiện môi trường ñất có nhiều phytat

Sự hiện diện của thực vật thông qua việc tạo nên các ñều kiện thuận lợi cho quá tình dinh dưỡng của thực vật Một số thực vật có khả năng tạo phytase tuy nhiên với một lượng rất ít, không ñủ ñể phân giải phytat trong ñất, do ñó sự xuất hiện của các chủng

Bacillus có khả năng sinh tổng hợp phytase có ý nghĩa quan trọng

1.3.2 Phân loại phytase của Bacillus

Phytase sinh tổng hợp từ Bacillus có hai loại là phyC (Kerovuo, 1998) và TS – phy (Kim, 1998) Cả hai loại này ñều thuộc nhóm β-propeller phytase (BPP) Sự phụ thuộc vào liên kết với ion Ca2+ cho tính ổn ñịnh nhiệt và hoạt dộ xúc tác của enzyme ñể phân biệt phyC với các nhóm phụ khác của phytase

BPP có hai vị trí gắn với phosphat, vị trí “bẻ gãy” và và vị trí “ái lực” Sự thủy giải cơ chất xảy ra tại vị trí “bẻ gãy”, còn vị trí “ái lực” thì có thể làm tăng ái

lực kiên kết với cơ chất Ion Ca2+ tạo liên kết dễ dàng với cơ chất bởi tạo ra một môi

trường tĩnh ñiện thích hợp

1.3.3 Cơ chất ñặc hiệu

PhyC ñặc hiệu cao với cơ chất là acid phytic, hoạt ñộ ñạt 100%, ngoài ra nó còn ñặc hiệu với ATP (hoạt ñộ ñạt 50%) và ADP (hoạt ñộ ñạt 75%) Tính ñặc hiệu

của phytase ở Bacillus rất cao, tuy nhiên hiệu quả ñặc hiệu thấp, so với phytase sinh

tổng hợp từ các nguồn khác Hoạt ñộ ñặc hiệu thấp làm cản trở việc sử dụng phytase

của Bacillus trong sản xuất công nghiệp

1.3.4 Các ñặc tính lý hóa học của phytase từ Bacillus

1.3.4.1 Trọng lượng phân tử

Phytase Bacillus là enzyme ñơn phân tử Bằng phương pháp ñiện di trên gel

SDS, các nhà khoa học ñã xác ñịnh phytase của Bacillus có trọng lượng phân tử

trong khoảng 36,5 – 44 kDa, trong ñó phytase của Bacillus subtilis có trọng lượng

là 44 kDa (Yang Mun Choi, 2001)

1.3.4.2 Thành phần acid amin trong phytase từ Bacillus

Trong phytase của Bacillus subtilis có hầu hết các loại acid amin Trong 1

mol phytase có chắ 3 mol tryptophan và 12 mol tyronsin, còn lại là các loại khác, trong ñó cao nhất là acid aspartic, 1,6µmol/mg enzyme, tiếp ñó là acid glutamic chiếm 1,08 µmol/mg enzyme, các acid amin còn lại dao ñộng từ 0,08 – 0,09 µmol/mg enzyme

1.3.4.3 Nhiệt ñộ, pH

Nhiệt ñộ tối ưu cho phytase của Bacillus sp là 400C khi không có Ca2+ và hoạt

ñộ có thể tăng lên khi ở 600C khi có bổ sung CaCl2 (Yang Mun Choi et al, 2011)

pH tối ưu của phytase Bacillus sp khá rộng, trong khoảng 6,0 -9 (R.Bawane

et al, 2011) Trong ñó, B.subtilis có pHop ở 7,5 và nhiệt ñộ tối ưu là 550C (Wang Y

et al, 2001)

1.3.4.4 Các tác nhân ảnh hưởng ñến hoạt ñộ phytase của Bacillus

Phytase từ Bacillus subtilis (natto) N-7 bị ức chế bưởi các ion kim loại như

Zn2+, Cd2+, Ba2+, Fe2+ và Al3+

Các tác nhân ức chế β-mercaptoethanol, dithioreitol…không ảnh hưởng nghiêm

trọng ñến hoạt ñộ enzyme phyC, do phyC không chứa bất kì phân tử cystein nào

Sự ức chế bởi cơ chất ở nồng ñộ tương ñối thấp tì phổ biến ở các phytase ðiều này có thể do sự kìm hãm cạnh tranh bởi sản phẩm, thể hiện rõ ở phytase của

vi khuẩn, nấm… Với nồng ñộ cơ chất là 16mM, hoạt ñộ phyC chỉ giảm khoảng 30% ðiều này là do enzyme tách ba nhóm phosphat tử acid phytic, nồng ñộ phospho vô cơ ở phản ứng cuối tại nồng dộ cơ chất 16mM sẽ gần với 48mM Chính

vì vậy, phyC khổng thể bị kìm hãm cạnh tranh bởi sản phẩm

1.3.4.5 Vai trò của Ca 2+ ñối với cấu trúc và chức năng của phytase từ Bacillus

Ca2+ có vai trò quan trọng ñối với phytase của Bacillus Phytase hoàn toàn bị

ức chế bởi các tác nhân ức chế (như EDTA) ở nồng ñộ phân tử vượt trội nồng ñộ

Ca2+ Sự ức chế có thể xảy ra do việc loại ion Ca2+ từ enzyme Phần apoenzyme có thể phục hồi hoạt ñộng chỉ với Ca2+ (42% hoạt dộ ban ñầu ñược phục hồi) ðiều này chứng tỏ các ion kim loại khác không thể hoặc chỉ có thể thay thế ion Ca2+ một phần nhỏ ñể enzyme hoạt ñộng

Tính bền nhiệt của enzyme cũng phụ thuộc rất lớn vào Ca2+ Enzyme phục hồi ơn 90% hoạt ñộ của nó sau 10 phút nuôi cấy ở 600C khi có sự hiện diện của 5mM Ca2+, trong khi không có mặt của ion Ca2+ thì hoạt ñộ enzyme bị mất sau nuôi cấy Sau 10 phút nuôi cấy ở 1000C khi có 5mM Ca2+ thì enzyme vẫn còn lại 20% hoạt ñộ Ngoài ra, enzyme có thể hồi phục 44% hoạt ñộ ở 250C trong một giờ sau khi ñã làm biến tính ở 1000C

Ca2+ cũng góp phần hình thành cấu trúc enzyme phyC Có tất cả sáu ion

Ca2+, ba trong số ñó có ái lực cao và cần cho ñộ bền vững của enzyme, ba ion còn lại có ái lực thấp giúp ñiều hòa hoạt ñộ xúc tác của enzyme Những ion này phần lớn tập trung xung quanh một cái ‘khe cạn” mang ñiện âm tạo ra một trường tĩnh ñiện thuận lợi cho việc gắn của acid phytic Ha và cộng sự (2000) ñề nghị rằng ba ion Ca2+ ở trung tâm hoạt ñộng tham gia chính xác trong sự xuacs tác bằng việc gắn với các nhóm phosphat của cơ chất và bằng sự tạo ổn ñịnh cho trạng thái trung gian hóa trị 5

1.3.4.6 Sản phẩm cuối của sự thủy phân acid phytic của phytase từ Bacilllus

PhyC thủy phân acid phytic ở những thời ñiểm khác nhau tạo sản phẩm rất

phong phú gồm inositol hexa-, penta-, tetra- và triphosphate ( lần lượt là InsP6, InsP5, InsP4 và InsP3) Acid phytic (InsP6) ñược thủy phân thao từng nấc ðầu tiên, InsP6 ñược phân cắt nhanh thành InsP5 rồi sau ñó thành InsP4 Sự chuyển chậm từ InsP5 thành InsP4 thành InsP3 cho thấy rằng những myo-inositol chứa ít phosphat hơn thì ít thích hợp với enzyme hơn so với acid phytic Sau 30 phút, hơn 50% sản phẩm phản ứng ñược hình thành là InsP4, trong khi chỉ 10% là InsP3 Phản ứng không tiếp tục tạo những inositol chứa ít phosphat hơn khi nuôi cấy thời gian dài, ñiều này cho thấy InsP3 là sản phẩm cuối của sự thủy giải acid phytic bới phC

ðối với phytase của Bacillus subtilis, theo Powar và Jaganathan thì sản phẩm cuối là myo-inositolophosphat, vị trí cắt hiện chưa xác ñịnh ñược

Con ñường thủy phân acid phytic thành InsP3 bởi enzyme phyC ñược thể hiện sau:

Hình 1.8: Các con ñường thủy phân acid phytic của enzyme phytase [36]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước [7, 9, 10]

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Với những lợi ích to lớn mà phytase mang lại, hiện nay trên thế giới, ñặc biệt là ở Châu Âu, Mỹ và Nhật ñã có nhiều công trình nghiên cứu về phytase, các vi sinh vật trổng hợp phytase và ñã cho thấy hiệu quả to lớn của việc ứng dụng chế phẩm phytase vào ñời sống

Nghiên cứu ñầu tiên về phytase ñã ñươc Suzuki và các cộng sự thực hiện cách ñây 90 năm Năm 1968, Sheh và Ware ñã tiến hành phân lập từ ñất hơn 2000 chủng vi sinh vật có khả năng sinh phytase Trong ñó có 30 chủng cho sản phẩm phytase ngoại bào Tất cả các phytase ngoại bào ñều là sản phẩm của vi nấm, 28

chủng thuộc Aspergillus, một chủng thuộc giống Penicillium và một chủng thuộc giống Mucor

Theo như nghiên cứu của các nhà khoa học V.C Nair và Z Duvnjak,

1990 ñã chứng minh, khi bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi ñã làm tăng lượng phospho dễ hấp thụ và các chất khoáng cho vật nuôi, nâng cao khả năng tăng trọng của vật nuôi lên 10-12%, giảm lượng phospho vô cơ gây ô nhiễm môi trường từ 20-25%

Năm 1990, E.Ferrari, A S Jarnagin, và B F Schmidt, ñã nghiên cứu sản xuất thương mại enzyme phytase ngoại bào từ các vi khuẩn Gram dương Kết quả

ñã chọn ra chủng Bacillus subtillis có khả năng sản xuất phytase ngoại bào tốt Năm

1994, tại Châu Âu, Gist-Brocades mới chính thức thử nghiệm việc sản xuất enzyme phytase thương phẩm

S.E.Scheldeler ñã nghiên cứu bổ sung phytase vào khẩu phần ăn của gà Broiler mái sẽ nâng cao tăng trọng trong khoảng 7 tuần tuổi, cải thiện chất lượng xương chân; ñối với gà trống giúp tăng trọng nhanh, nâng cao khả năng chuyển hóa thức ăn và sức sống

Năm 2006, Greiner và Konietzny ñã nghiên cứu việc bổ sung phytase từ

Aspergillus Niger ñể cải thiện chất lượng của bánh mì Kết quả là khi bổ sung phytase vào bột mì làm gia tăng khả năng hấp thụ sắt, làm cho bánh mì giàu sắt, hospho, protein dễ tiêu, gia tăng thể tích bánh

Noura Raddadi, Ameur Cherif, Abdellatif Boudabours và Daniele

Daffonchio cho thấy một số chủng Bacillus như Bacillus subtilis, Baciillus

amyloliquefaciens ñóng vai trò tích cực trong quá trình sinh trưởng của thực vật trong ñiều kiện môi trường ñất có nhiều phytate Sự hiện diện của các vi khuẩn này trên bề mặt rễ của thực vật ñã giúp ích cho sự phát triển của thực vật thông qua việc tạo nên các ñiều kiện thuận lợi cho quá trình dinh dưỡng của thực vật

Kết quả nghiên cứu mới nhất của Neeraj Kumar Aggarwal (2010) ñã chỉ ra

rằng, chủng Klebsiella sp có khả năng tổng hợp phytase ưa nhiệt ñể ứng dụng

trong sản xuất thức ăn cho ñộng vật dạ dày ñơn, ñặc biệt là trong thức ăn cho gia cầm ñể cải thiện tình trạng dinh dưỡng phospho trong thức ăn cho vật nuôi và chống lại vấn ñề ô nhiễm môi trường

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhằm mục ñích phát triển kinh tế nông nghiệp sinh thái bền vững, Việt Nam cũng ñã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải phytate và ứng dụng của chúng trong vấn ñề làm tăng cường hàm lượng chất dinh dưỡng phospho trong thức

ăn chăn nuôi

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thành, Phạm Minh Anh và Lê Thành Hùng (1997) về ảnh hưởng của việc bổ sung phytase so với ñi canxi- phosphate trong thức ăn lên sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và phospho của cá tra Kết quả của nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung phytase ở nồng ñộ 750 FTU/kg và 1500 FTU/kg thức ăn so với bổ sung di-canxi-phosphate (1,0-1,5%) không ảnh hưởng ñến tỷ lệ sống nhưng lại giúp cải thiện tốc ñộ tăng trưởng của cá tra, cải thiện hiệu quả sử dụng thức ăn, hiệu quả sử dụng protein và phospho của cá tra Kết quả của nghiên cứu cũng cho thấy, phytase cũng có vai trò trong việc cải thiện khả năng tiêu hóa phospho của cá tra Việc bổ sung phytase vào thức ăn cho cá tra ñạt hiệu quả cao nhất ở nồng ñộ là 1500 FTU/kg thức ăn

Năm 2006, Mai Thị Hằng, Ngô Thanh Xuân ñã thực hiện nghiên cứu ñề tài

tuyển chọn chủng Aspergillus niger ñể sản xuất phytase dùng cho chăn nuôi Kết

quả ñã tuyển chọn ñược 24 chủng nấm mốc có hoạt tính phytase, trong ñó chủng

Aspergillus Niger Tiegh XP có khả năng sinh phytase mạnh (0,05IU/ml) trên môi