Tìm hiểu đặc tính phân tử salmonella enterica serovar typhi

+Công việc nghiên cứu này được thực hiện nhằm khám phá đặc điểm phân tử của Salmonella enterica serovar Typhi được phân lập từ người sốt thương hàn bằng phương pháp hóa sinh, sinh học v

LOGO BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

 MỤC ĐÍCH

+Salmonella enterica serovar Typhi là 1 trong những

nguyên nhân gián tiếp gây bệnh sốt thương hàn cho loài người trên phạm vi toàn cầu

+Công việc nghiên cứu này được thực hiện nhằm khám

phá đặc điểm phân tử của Salmonella enterica serovar

Typhi được phân lập từ người sốt thương hàn bằng

phương pháp hóa sinh, sinh học và phát hiện gien độc hại dựa vào kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase

(PCR)

TỔNG QUAN

+Việc phân lập chuyên sâu cũng khám phá ra loại thuốc kháng sinh nhạy với khuôn như là một tiêu chuẩn để đánh giá trong việc quản lý.

TỔNG QUAN

 PHƯƠNG PHÁP & KẾT QUẢ

+Có tổng số 16 mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ số người bệnh như nhau (7 nam và 9 nữ) từ các quận Coimbatore, Erode, Salem của Tamil Nadu và được

xử lý bằng cách cho S.enterica serovar Typhi phát triển trên môi trường via dể nhận diện và phân lập.

+Các nghiên cứu vi sinh và hóa sinh đã phát hiện sự hiện diện của S.Typhi từ 16 mẫu bệnh phẩm

615bp), fliC-d (gien tiên mao thực khuẩn 1 sinh

kháng thể d, 750bp) và viaB (gien kháng thể Vi,

439bp) trong tất cả 16 mẫu bệnh phẩm

 KẾT LUẬN, Ý NGHĨA VÀ TÁC ĐỘNG

CỦA NGHIÊN CỨU

+Việc nghiên cứu đã xác nhận có sự liên hệ giữa giống S enterica serovar Typhi từ bệnh sốt thương hàn với con

người và cho rằng phương pháp chẩn đoán PCR sẽ

mang lại nhiều lợi ích trong việc nhận diện nhanh các mẫu phân lập S.Typhi

+Nghiên cứu cũng nhấn mạnh việc sử dụng thuốc kháng sinh như chloramphenicol hoặc kết hợp các loại thuốc kháng sinh khác nhau sẽ mang lại hiệu quả hơn trong việc chế ngự S.Typhi.

TỔNG QUAN

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

 THU THẬP MẪU

+16 mẫu máu của bệnh nhân (7 nam và 9 nữ từ các bệnh viện và các phòng khám khác nhau ở các quận Coimbatore, Erode, Salem của Tamil Nadu, Ấn Độ) được thu thập trong trong suốt tháng 1 và tháng 2

phải được vô trùng trước khi điều trị bằng kháng

sinh

+Các mẫu máu được vận chuyển trong thùng đá lạnh

và được xử lý ngay lập tức để nghiên cứu

+Các dữ liệu của mỗi bệnh nhân cũng được gửi đi

 PHÂN LẬP&NHẬN DẠNG

+Cho 3÷5ml máu vào 30ml nước thịt pha với dịch tim

óc (tỷ lệ tối thiểu huyết và nước thịt phải được duy trì với tỉ lệ 1:10)

+Máu sau khi cấy vào nước thịt sẽ được ủ ở 370C trong

7 ngày

+Tất cả các ống nghiệm đều được kiểm tra hằng ngày

và nếu quan sát thấy có sự phát triển của vi sinh vật thì cấy sang môi trường XLD trong đĩa petri và ủ tiếp

ở 370C trong 24 giờ.

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

+Nhóm vi khuẩn được chọn lọc căn cứ vào kích cỡ, hình dạng, màu sắc trên thạch XLD và sự tan máu trên

thạch máu và phải bắt màu Gram

+Vi sinh vật phân lập được nhận dạng dựa vào tiêu

chuẩn xét nghiệm hóa sinh như: thử nghiệm tính di

động, khả năng sử dụng citrate, thử nghiệm methyl red

và VP, sinh khí H2S, khả năng lên men mannitol,

arabinose, sorbitol, dulcitol, lactose, sucrose, glucose

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

 MÁY QUÉT ĐIỆN TỬ

+Các vi khuẩn được cho phân lập trên đĩa thạch dinh

dưỡng, sẽ được cố định bằng chất hãm màu Karnovsky (pH 7.3) và được ủ ở 4oC trong 4 giờ

+Mẫu được rửa 2 lần bằng dung dịch đệm Sodium

Cocodylate 0,1M (pH 7.4); mỗi lần rửa ở 40C trong 15 giây, mỗi dung dịch rửa được ổn định trong 12 giờ ở

40C, khử nước từ 30÷100% ở nhóm acetone, mỗi lần khử trong 15 giây ở 4oC

+Các mẫu được làm khô bằng dung dịch tetra methyl

silane trong 15 giây ở 4oC và bao kín không khí khô

trong 15 giây

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

+Các mẫu được cho vào khung nhôm, mẫu sẽ bám vào

và phủ lớp carbon trong 5 giây, và được máy quét điện tử phân tích bằng tia polaron

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

 PHÁT HIỆN GIEN ĐỘC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

+Gien độc của vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách

phát hiện gien xâm chiếm (invA), gien tiên mao thực khuẩn 1 của kháng nguyên d (fliC-d), gien đồng tâm lập thể tyvelose (tyv) và gien kháng nguyên Vi (viaB)

bằng phương pháp PCR

+Gien invA được phát hiện bằng gien đơn PCR, ngược

lại nhiều thành phần PCR được sử dụng để phát hiện

fliC-d, tyv và gien viaB.

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

+Các gien xuôi và gien ngược luôn đi đôi với nhau như

gien invA của 244bp là 5’-acagtgctcgttacgacctgaat-3’

và 5’-agacgactggtactgatcgataat-3’; các gien fliC-d

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

+S enterica serovar Typhi (MTCC 733) và Aeromonas

hydrophila (MTCC 646) được dùng để nhận biết

dương tính hay âm tính

+ Cho vi sinh vật phát triển trong 200µl nước cất vô

trùng trong 1 ống ly tâm nhỏ, sẽ được ly tâm nhẹ và đun sôi 10 giây trong bể nước

+Các vi sinh vật sẽ xuất hiện trên bề mặt sau khi ly tâm

ở 10000rpm trong 5 giây và sẽ được dùng như là 1 mẫu DNA

(viaB-F và viaB-Lane P: đối chứng khẳng định (S

enterica serovar Typhi MTCC 733)) và 2,5µl mẫu

DNA

+Các phản ứng PCR sẽ được thực hiện trong một chu kỳ nhiệt

+Gien invA sau khi được biến tính ban đầu ở 94oC trong

4 giây sẽ được khuếch đại trong 1 chu kỳ gồm các

bước: biến tính ở 94oC trong 30 giây, lai ở 56oC trong

30 giây, tổng hợp ở 72oC trong 2 giây

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

+Đối với gien fliC-d, tyv và viaB, sau khi được biến tính

ban đầu ở 95oC trong 4 giây thì được khuếch đại trong

1 chu kỳ gồm các bước: biến tính ở 95oC trong 30 giây, lai ở 55oC trong 60 giây, tổng hợp ở 72oC trong 90

giây

+Cuối cùng là tổng hợp ở 72oC trong 10 giây

+Mẫu sản phẩm PCR (5µl) được điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE (Tris-acetic acid-

EDTA, pH 8) bị đổi màu bởi dung dịch ethidium

bromide và được quan sát bằng máy gel doc system

 THỬ NGHIỆM THUỐC KHÁNG SINH

NHẠY CẢM

+Thử nghiệm kháng sinh nhạy cảm được thực hiện bằng phương pháp đĩa khuếch tán ánh sáng với biến đổi nhỏ +Vi sinh vật được cấy vào dung dịch đệm peptone sẽ được trải mỏng trên môi trường thạch dinh dưỡng trong đĩa

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP

+Thành phần của đĩa kháng sinh gồm có các chất sau:

Gentamycin 10g), Cefuroxime (30g), Penicillin-G

(2U/ml), acid nalidixic (30g), Clindamycin (10g),

Carbenicillin (100g), Cephalothin (30g), Kanamycin (30g), Nitrofurantoin (100g), Tetracylin (30g),

Ampillicin (10g) và Chloramphenicol (30g).

+Mức độ kháng được đưa ra bởi Ủy ban Quốc gia về tiêu

chuẩn phòng thí nghiệm được sử dụng như là 1 tiêu

chuẩn để đối chứng Gram âm của S enterica serovar Typhi (MTCC 733) và A hydrophila (MTCC 646).

 PHÂN LẬP&NHẬN DẠNG

+Sự phát triển của vi sinh vật có thể quan sát thấy được

trong môi trường BHI ở ngày thứ 7 giai đoạn ủ

+Chất không tan máu được tìm thấy trong mẫu trên môi

trường thạch XLD xuất hiện các quầng màu hồng, tâm đen

+Các vi sinh vật phân lập đều lên men glucose, mannitol ,

L-arabinose và sorbitol

KẾT QUẢ

Ký hiệu

hiệu phân lập

bắt đầu bệnh

Nơi lấy mẫu Biotyp e Phát hiện

gien độc bằng

PCR

(Nam)

Sốt thương hàn

Salem

IV

Đều dương tính với gien

invA, tyv, fliC-d, viaB

KẾT QUẢ

+Trên môi trường thạch nghiêng, ở góc nghiêng xuất hiện 2 màu vàng và đỏ riêng biệt, cho thấy chỉ có glucose lên

men và tạo môi trường acid

+Sinh ra khí H2S trên thạch XLD nhưng trên thạch TSI thì lại không sinh khí H2S.

+Các vi khuẩn phân lập cho kết quả: dương tính với thử

nghiệm oxy, methyl red; âm tính với thử nghiệm sinh

indol, sinh ure và khả năng sử dụng citrate.

+Tất cả các phân lập được tìm thấy là Gram âm , có tiên mao

di động.

+Theo nhiều chi tiết trong nghiên cứu vi sinh vật dựa vào

thử nghiệm hóa sinh, thì 16 mẫu thí nghiệm được nhận

biết là S.Typhi.

KẾT QUẢ

Hình 1: S.Typhi trên môi trường thạch XLD xuất

hiện các quầng màu hồng có tâm đen

KẾT QUẢ

+Các nghiên cứu phi cấu trúc của S.Typhi bằng máy

quét quan sát được cho thấy có dạng hình que

+Các vi khuẩn hình que quan sát được cho thấy có sự

thay đổi chiều dài, đôi khi xuất hiện chồi đơn hoặc

chồi đôi và thỉnh thoảng cũng xuất hiện chuỗi xoắn

PCR

+Trong phân tích PCR, sự khuếch đại các gien độc từ 16

mẫu thí nghiệm bằng các mồi của gien invA, tyv,

viaB, fliC-d tạo các vạch riêng biệt tại 244bp, 615bp,

439bp, 750bp

Hình 2: Siêu cấu trúc của S.Typhi dưới kính quét điện tử

Phát hiện gen invA (244bp)

bằng PCR Phát hiện gen tyv (615bp), fliC- d (750bp) và viaB (439bp) bằng

mPCR

Cột N: đối chứng âm (A.hydrophila MTCC 646)

Cột 1÷5: khu vực dương tính với gien độc

Cột M: dãy DNA gốc

Hình 3: Phát hiện các gen độc từ S.Typhi bằng

phương pháp PCR

 Thử nghiêm tính nhạy cảm kháng sinh

+Trong nghiên cứu này, tất cả 16 mẫu (100%) đều kháng

với ampillicin, nhạy vừa phải với acid nalidixic,

nitrofurantoin, carbenicillin, chloramphenicol,

clindamycin, gentamycin, kanamycin và tetracycline +13 mẫu (81,25%) kháng cefuroxime, 3 mẫu (18,75%) là

nhạy vừa phải với cefuroxime

+11 mẫu (68,75%) kháng penicillin-G và cephalothin, 5

mẫu còn lại (31,25%) nhạy vừa phải với penicillin-G và cephalothin

KẾT QUẢ

Hình 4: Độ nhạy kháng sinh của S.Typhi

C: Chloramphenicol (30µg), Cu: Cefuroxime (30µg), A: Ampillicin (10µg), Na: Nalidixic acid (30µg), Ch: Cephalothin (30µg), T: Tetracycline (30µg), Cb: Carbenicillin (100µg), Cd: Clindamycin (10µg), G: Gentamycin (10µg), Nf: Nitrofurantoin (100µg), P: Penicillin-G (2 Units), K: Kanamycin (30µg)

NHẠY CẢM KHÁNG NHẠY CẢM VỪA

20

60

80

100

C: Chloramphenicol (30µg), Cu: Cefuroxime (30µg), A: Ampillicin (10µg),

Na: Nalidixic acid (30µg), Ch: Cephalothin (30µg), T: Tetracycline (30µg),

Cb: Carbenicillin (100µg), Cd: Clindamycin (10µg), G: Gentamycin (10µg), Nf: Nitrofurantoin (100µg), P: Penicillin-G (2 Units), K: Kanamycin (30µg)

Hình 5: Kết quả thử nghiệm tính nhạy kháng sinh của S enterica serovar

Nhạy Kháng Nhạy vừa

40

100

0

60

BÀN LUẬN

+Trong nghiên cứu này, các mẫu máu được thu thập từ

16 bệnh nhân tuổi từ 12 đến 50 từ các quận

Coimbatore, Erode, Salem của Tamil Nadu, Ấn Độ

+Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được thu thập trong suốt tháng 1, tháng 2 và cuối mùa khô, được xem là mùa

cao điểm của sốt thương hàn

+ Các nguồn gốc gây bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe

gồm 5 chữ F: food (thực phẩm), fingers (các ngón tay), flies (ruồi), fomites (mầm bệnh), faeces (phân) đóng vai trò quan trọng trong việc lây bệnh

BÀN LUẬN

+Tất cả 16 bệnh nhân được chẩn đoán dương tính với bệnh thương hàn bắt đầu bệnh từ 5 đến 8 ngày, trong

đó có 14 mẫu (87,5%) bị tấn công cao gồm những

người dưới 30 tuổi

+Tương tự với báo cáo này thì những trường hợp tần số xảy ra bệnh thương hàn cao ở những bệnh nhân dưới

30 tuổi cũng được phát hiện trước báo cáo của Tamil Nadu

BÀN LUẬN

+Tất cả các mẫu vi sinh vật phân lập đều tạo vùng màu hồng và tâm đen trên đĩa XLD và cho kết quả dương tính khi lên men mannitol, L-arabinose, sorbitol,

glucose, thử nghiệm methyl red, thử nghiệm indol, thử nghiệm sinh khí H2S, khả năng sử dụng citrate, thử

nghiệm oxy, thử nghiệm tính di động và thử nghiệm urease

+Nghiên cứu vi sinh cũng đã xác nhận việc phân lập để thăm dò S.Typhi từ các trường hợp bệnh thương hàn của người bệnh đã có trước báo cáo

BÀN LUẬN

+Tất cả 16 mẫu được xếp vào biotype IV đều lên men arabinose nhưng không lên men xylose

L-+Biotype này được thêm vào dữ liệu nghiên cứu bệnh

dịch dựa vào hệ thống sắp xếp theo khả năng lên men đường và dựa trên các thuộc tính hóa sinh khác

+Trong PCR thì gien invA, tyv, fliC và viaB được xem là

mục tiêu cho gien độc, từ đó làm cơ sở cho việc nhận dạng S.Typhi, sẽ bộc lộ 100% điều cần khám phá trên các gien độc của mẫu bệnh phẩm phân lập từ người

bệnh thương hàn

+Nghiên cứu này cũng chứng minh gien invA chiếm ưu

thế so với 3 gien còn lại trong phân lập S.Typhi, gien này có thể sử dụng như là 1 gien nổi bật để phát hiện nhanh S.Typhi bất chấp trong mẫu có nhiều loại vi

sinh vật khác nhau

+Trong nghiên cứu mPCR, kháng nguyên O được mã

hóa bởi gien tyv, kháng nguyên H được mã hóa bởi fliC-d, kháng nguyên Vi được mã hóa bởi gien độc

viaB được sử dụng làm nền tảng cho việc nhận dạng

S.Typhi từ trường hợp người bệnh thương hàn

BÀN LUẬN

+Kết quả mPCR được mô tả trong thí nghiệm này là thiết lập được 3 loại gien có tính bảo tồn cao giữa các mẫu phân lập S.Typhi và có thể trở thành các gien trọng

điểm để phát hiện nhanh S.Typhi phân lập

+Kết quả thử nghiệm kháng sinh nhạy cảm đã bộc lộ các S.Typhi phân lập kháng ampicillin (100%),

cefuroxime (81,25%), penicillin-G (68,75%),

cephalothin (68,75%)

+Kết quả hiện tại cũng cho thấy rõ xu hướng các S.Typhi phân lập kháng nhiều loại thuốc

+Nhìn chung, các nhà nghiên cứu ở miền Nam Việt Nam

đã báo cáo 90% S.Typhi phân lập kháng nhiều loại

kháng sinh như ampicillin, chloramphenicol và

co-trimoxazole

+Ở Ấn Độ, báo cáo S.Typhi kháng lại 29,47% ampicillin

và 28,42% chloramphenicol

+Mặc dù các nhà nghiên cứu đã nhiều lần báo cáo

chloramphenicol là chất kháng S.Typhi nhưng trong nghiên cứu này lại cho thấy 100% chloramphenicol

cùng với kanamycin, clindamycin, carbenicillin,

gentamycin, tetracycline nhạy với S.Typhi phân lập

BÀN LUẬN

+Trong sự thích hợp, 100% tính nhạy cảm của S.Typhi phân lập chống lại chloramphenicol, gentamycin,

tetracycline cũng đã được phát hiện sớm hơn

+Trong nghiên cứu của chúng ta, acid nalidixic và

nitrofurantoin được thấy là nhạy vừa đủ

+Gần đây nhất, 76% mẫu máu cấy vào S.Typhi được báo cáo là kháng acid nalidixic

+Dù chloramphenicol và những thuốc kháng sinh khác

cho thấy 100% đạt độ nhạy, nhưng vẫn cần có những đánh giá về độ nhạy – độ kháng của S.Typhi là rất cần thiết cho việc sử dụng thuốc kháng sinh ở mức vừa

phải trong việc quản lý sốt thương hàn trong tương lai

THE END

CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN

ĐÃ LẮNG NGHE….