Tìm hiểu đặc tính và phân tích sự đặc trưng của tiểu phần nhân tố phiên mã nuclear factor YA ở họ đậu

Các nghiên cứu đã chứng minh r ng, NF-Ykhông chỉ có chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự tăng trưởng vàphát triển của cây trồng mà còn tham gia vào cơ chế đáp ứng lại các yếu tố

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ THU THỦY

TÌM HIỂU ĐẶC TÍNH VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐẶC TRƯNG CỦA TIỂU PHẦN NHÂN TỐ PHIÊN

MÃ NUCLEAR FACTOR-YA Ở HỌ ĐẬU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ THU THỦY

TÌM HIỂU ĐẶC TÍNH VÀ PHÂN TÍCH SỰ ĐẶC TRƯNG CỦA TIỂU PHẦN NHÂN TỐ PHIÊN

MÃ NUCLEAR FACTOR-YA Ở HỌ ĐẬU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền - Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: ThS Phạm Phương Thu

TS Chu Đức Hà

Hà Nội, 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Chu Đức Hà

-người thầy đã định hướng những bước đi đầu tiên và cũng là -người luôn theosát, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS Phạm Phương Thu, Khoa

Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã động viênchỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn ban chủ nhiệm Khoa Sinh - Kỹthuật nông nghiệp và cán bộ của bộ môn Di truyền - Công nghệ sinh họctrường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện hỗ trợ khoa học - kĩthuật và hướng dẫn tôi để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ nghiên cứu Cảm

ơn sự chỉ bảo nhiệt tình đầy trách nhiệm của tập thể cán bộ nghiên cứu trong

bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi trongquá trình thực hiện

Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới gia đình,bạn bè đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về thời gian, cổ vũ tinh thần để tôihoàn thành tốt luận văn của mình và kết thúc chương trình học đúng thời hạn.Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thu Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu, kết quả trong luận văn này hoàn toàntrung thực, không trùng lặp với các đề tài nghiên cứu khác Tôi đã trực tiếpthực hiện các nghiên cứu trong khóa luận này

Công trình nghiên cứu này chưa được công bố trên bất kì một tư liệunào Tôi cũng xin cam đoan r ng mọi sự giúp đỡ, tạo điều kiện cho việc thựchiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin, số liệu trích dẫn trongluận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thu Thủy

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, VIẾT TẮT

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích của nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

4.1 Ý nghĩa khoa học 2

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Lĩnh vực nghiên cứu 3

1.2 Tổng quan về họ Đậu 3

1.2.1 Tổng quan về đậu tương 4

1.2.2 Tổng quan về đậu gà 7

1.2.3 Tổng quan về lạc 8

1.2.4 Tổng quan về đậu côve 10

1.2.5 Tổng quan về đậu xanh 12

1.2.6 Tổng quan về cỏ linh lăng 15

1.3 Tổng quan về yếu tố phiên mã NF-YA 16

1.3.1 Cấu trúc của NF-Y và tiểu phần NF-YA 16

1.3.2 Vai trò của NF-YA đối với thực vật 16

1.4 Tình hình nghiên cứu hiện nay 17

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

Chương 2: DỮ LIỆU, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Dữ liệu nghiên cứu 20

2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian 20

2.1.1 Phạm vị nghiên cứu 20

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 20

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Phương pháp xác định NF-YA ở lạc và đậu xanh 21

2.4.2 Phương pháp phân tích đặc tính NF-YA ở các cây họ Đậu 22

2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc gene mã hóa NF-YA ở cây họ Đậu 23

2.4.4 Phương pháp xây dựng cây phân loại cho NF-YA ở các cây họ Đậu 24

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả xác định tiểu phần Nuclear factor-YAở cây lạc và đậu xanh 25 3.2 Kết quả xây dựng cây phân loại của NF-YA ở các cây họ Đậu 31

3.3 Kết quả phân tích đặc tính của NF-YA ở các cây họ Đậu 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

Kết luận 41

Kiến nghị 41

DANH MỤC C NG TRÌNH Đ C NG B C LI N QUAN ĐẾN LU N VĂN 42

Tài liệu tham khảo 43 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3 1: Thông tin về họ gene mã hóa NF-YA ở cây lạc 28 Bảng 3 2: Thông tin về họ gene mã hóa NF-YA ở cây đậu xanh 28 Bảng 3 3: Tóm lược về họ NF-YA ở các loài cây trồng 30 Bảng 3 4: Các thành viên thuộc sáu họ NF-YA của sáu loài Đậu trong

nghiên cứu 32

Bảng 3 5: Kết quả phân nhóm của 61 gene NF-YA được xét đến trong nghiên

cứu 35

Bảng 3 6: Đặc tính của các NF-YA ở nhánh 1 38 Bảng 3 7: Đặc tính của các NF-YA ở nhánh 2 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 2: Vai trò của các cây họ Đậu (Nguồn: Wikipedia) 4

Hình 1 3: Cây đậu tương (Nguồn: Hồ Đình Hải - 4/2/2014) 6

Hình 1 4: Cây đậu gà (Nguồn: Jovina Cooks - 14/9/2012) 7

Hình 1 5: Cây lạc (Nguồn: Hồ Đình Hải - 5/2/2014) 9

Hình 1 6: Cây đậu côve (Nguồn: Bùi Thụy Đào Nguyên – 20/8/2013) 11

Hình 1 7: Cây đậu xanh (Nguồn: eminhatban - 2018) 13

Hình 1 8: Cây cỏ linh lăng (Nguồn: Ninjatacoshell - 14/4/2019) 15

Hình 2 1: Công cụ tìm kiếm BLAST 21

Hình 2 2: Công cụ tìm kiếm BlastP 22

Hình 2 3: Thông tin về gene 22

Hình 2 4: Trang GSDS 23

Hình 2 5: Phần mềm MEGA6.0 24

Hình 3 1: Cây phân loại gene mã hóa NF-YA ở 6 loài nghiên cứu 34

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Họ Đậu (Fabaceae) là một trong những họ có ý nghĩa quan trọng trong

sản xuất nông nghiệp hiện nay Các cây họ Đậu được sử dụng phổ biến nhưnguồn thực ph m giàu dinh dưỡng, nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc,nhiên liệu sinh học và cải tạo đất [7,15] Hạt đậu dễ dàng bảo quản trongnhiều tháng mà không mất đi nguồn sử dụng các sản ph m từ đậu như mộtloại thực ph m thiết yếu trong hàng thế kỉ Các giống hạt đậu có sự đa dạng ditruyền cao do đó có thể lựa chọn ra loài phù hợp với điều kiện biến đổi khíhậu Cây đậu sản sinh ít carbon do đó gián tiếp làm giảm khí thải nhà kính.Tính chất cố định đạm của đậu làm đất thêm màu mỡ, giúp tăng cường và kéodài năng suất của đất Việc trồng các cây họ Đậu giúp làm giảm lượng phátthải oxit nito khoảng 20 - 30% và giảm sử dụng phân bón từ 25 - 40% tùytừng trường hợp [38]

Yếu tố hạt nhân-Y (Nuclear factor-Y, NF-Y) là nhân tố phiên mã đượctìm thấy ở hầu hết các loài thực vật, có vai trò quan trọng trong điều hòa vàđáp ứng với tác nhân bất lợi Các nghiên cứu đã chứng minh r ng, NF-Ykhông chỉ có chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự tăng trưởng vàphát triển của cây trồng mà còn tham gia vào cơ chế đáp ứng lại các yếu tốbất lợi đối với cây trồng [12] NF-Y bao gồm 3 tiểu phần: NF-YA, NF-YB,NF-YC trong đó có chứa các vùng bảo thủ để tạo ra sự liên kết giữa DNA vàtương tác với các tiểu phần khác để hình thành nên phức hợp NF-Y [27,36]

Khoa học hiện đại đã đạt được nhiều thành tựu trong việc giải mãgenome các loài cây trồng, những nhóm Transcription factor (TF), trong đó

có NF-Y đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới.Ngoài ra, ở nhiều cây họ Đậu người ta nhận thấy có sự lặp các gene quy định

gene lặp này sẽ tạo cơ sở dữ liệu sử dụng trong nghiên cứu cũng như cải tạo

sức chống chịu của cây họ Đậu Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài T m

hiểu đ c tính và ph n tích sự đ c trưng của tiểu phần nh n t phi n m Nuclear factor- A ở họ Đậu”.

2 Mục đích của nghiên cứu

Bố sung dữ liệu cơ sở khoa học về việc đánh giá sự tương đồng của các

gene trong họ đa gene NF-YA ở cây họ Đậu.

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định NF-YA ở lạc và đậu xanh

Nội dung 2: Phân tích đặc tính NF-YA ở các cây họ Đậu

Nội dung 3: Xác định cấu trúc gene mã hóa NF-YA ở các cây họ Đậu

Nội dung4: Xây dựng cây phân loại cho NF-YA ở các cây họ Đậu

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu này nh m cung cấp những thông tin về đặc tính đặc

trưng, mức độ tương đồng giữa các gene NF-YA ở họ Đậu.

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu này sẽ tạo cơ sở dữ liệu sử dụng trong nghiên cứucũng như cải tạo sức chống chịu của cây họ Đậu

NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lĩnh vực nghiên cứu

Tự nhiên đang biến đổi theo hướng ngày càng khắc nghiệt đối vớinhiều loài sinh vật Để cải thiện khả năng chống chịu của thực vật đối với cácđiều kiện bất lợi của môi trường, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nh mđưa đến sự hiểu biết rõ ràng hơn về các gene quy định tính chống chịu Đặcbiệt được quan tâm là các TF, trong đó có NF-Y đã thu hút được sự quan tâmcủa nhiều nhà khoa học trên thế giới Cụ thể, NF-Y đã được xác định và phântích trên một số đối tượng cây trồng quan trọng như: cây mô hình 2 lá mầm

Arabidopsis thaliana [27]; các loài một lá mầm như kê (Foxtail millet) [12],

ngô (Zea mays) [33,52], lúa (Oryza sativa) [48,49], các gene mã hóa cho nhóm NF-Y cũng được ghi nhận ở cải dầu (Brassica napus) [29], cam ngọt (Citrus sinensis) [3,4,17], sắn (Manihot esculenta Crantz ) [2,5].

truncatula) Trong đó, đậu tương là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị

kinh tế cao, sản ph m của nó làm thực ph m cho con người, thức ăn cho giasúc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất kh u và là cây cải tạo đất tốt [1].Đậu gà có thành phần dinh dưỡng cao và là nguồn cung cấp thực ph m chongười, gia súc, bên cạnh đó còn có vai trò cố định nito trong đất, làm nhiênliệu [41] Lạc, đậu côve và đậu xanh đều được trồng rộng rãi trên thế giới vàđược sử dụng như một nguồn cung cấp nguồn thực ph m phổ biến Cỏ linh

lăng được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi gia súc từ lâu đời, gần đây chúngcòn được con người sử dụng như một loài cỏ chữa bệnh Chính vì vậy, chúngtôi tiến hành nghiên cứu trên 6 đối tượng này.

Hình 1 1: Vai trò của các cây họ Đậu (Nguồn: Wikipedia [62])

Ở họ Đậu đã có các công bố ở cây đậu tương (Quach và cs., 2015), đậu

côve [39] và đậu gà [16] Cụ thể, 21 gene GmNF-YA đã được xác định trên hệ

gene đậu tương (2015) Trước đó, Carolina và cộng sự đã ghi nhận 9 gene

NF-YA ở đậu côve (2014) Gần đây, 8 gene CaNF-YA đã được công bố trên

đậu gà (2018) Tuy nhiên, thông tin về NF-YA trên đối tượng lạc, đậu xanh và

cỏ linh lăng thì chưa có kết quả và chưa có sự so sánh độ tương đồng Chính

vì vậy, câu hỏi được đặt ra là, NF-YA ở họ Đậu có đặc tính đặc trưng như thế

nào, mức độ tương đồng giữa chúng ra sao

1.2.1 q ậ tươ

Đậu tương hay còn thường gọi là đậu nành (Soybean), tên khoa học là

Glycine max (L ) MERRILL Thuộc bộ Phaseoleae, họ Đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae, chi Glycine Tuy nhiên theo một số quan điểm

hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu tương trồng

Glycine max L Merill [1] Có tổ tiên là loài đậu nành hoang (Glycine ussuriensis/ Glycine soja) được tìm thấy ở Triều Tiên, Thái Lan, Nhật bản,

thung lũng Yangtze của miền Trung Trung Quốc, các tỉnh miền Đông BắcTrung Quốc và các khu vực giáp giới nước Nga Chủng hoang dại này tương

tự nhưng không phải là đậu tương được trồng hiện nay và chúng có thể lai tạođược với nhau vì đồng nhất về mặt di truyền nên thường được sử dụng trongchương trình lai tạo Đậu tương được trồng đầu tiên ở nửa phần phía Đôngcủa miền Bắc Trung Quốc vào thế kỷ XI trước công nguyên Phương thứctrồng đậu tương được du nhập vào Triều Tiên từ miền bắc Trung Quốc và vàoNhật Bản khoảng từ năm 200 trước công nguyên đến năm 300 sau côngnguyên Từ đó lan sang nhiều nước khác ở Châu Á như Việt Nam, Đông Nam

Á, Ấn Độ Châu Âu mới biết đến đậu tương từ thế kỷ XVIII, trong thế kỷ thứXIX đậu nành phát triển mạnh ở Châu Mỹ Đậu tương lần đầu tiên đến ChâuPhi qua Ai Cập năm 1857 [42]

Đậu tương là cây thân thảo đứng, sống h ng niên Thân cao 0,5 - 1,5 m,phân cành mạnh, trên thân, cành, lá và quả có lông cứng màu vàng Rễ cáithô, từ gốc tương đối ngắn với nhiều rễ phụ bên lan rộng và sâu khoảng 2 m

Lá mọc cách, gân lá hình lông chim, 2 lá đầu tiên mọc đối, lá kép gồm 3 láphụ hình trái xoan không đều nhau, hoặc hình bầu dục dạng hình thoi hayhình xoan gần như tròn, thon dài 3 - 12 cm, lá bẹ 3 đến 7 mm Chùm hoa hìnhbàn chải, mọc ở nách lá, dài 1 - 2 cm, hoa nhỏ, mỗi chùm gồm 5 - 26 hoa,không mùi, tràng hoa có vành hoa giống hình bướm, dày, màu tím hoặc trắng,dài 5 mm có 5 răng với 2 răng trên dính nhau, có 10 nhụy trong số có 9 nhụydính nhau và 1 tiểu nhụy rời Quả dài 5 - 6 cm, hơi cong hình lưỡi liềm,phẳng, có nhiều lông mềm, màu từ xám sáng đến xám tối Số lượng quả trênmột cây tùy thuộc vào mật độ cây, nguồn cung cấp chất dinh dưởng và độ m

Hình 1 2: Cây đậu tương (Nguồn: Hồ Đình Hải - 4/2/2014 [57])

Trong những ruộng trồng dày đặc, số quả trên mỗi cây từ 10 - 15, trênruộng trồng thưa và đất đai màu mỡ có thể lên đến 300 - 400 quả/cây Mỗiquả có từ 1 đến 4 hạt, thường là 3 hạt Hạt hình cầu hay bầu dục, phẳng có hạtgiống như quả thận Màu hạt thay đổi khác nhau từ vàng nhạt đến nâu Trọnglượng 1000 hạt từ 100 đến 400g [45]

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, sản ph m của nó đượcdùng làm thực ph m cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu trongcông nghiệp làm hàng xuất kh u và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt Đậutương được xem là ông hoàng trong các cây họ Đậu vì giá trị chất toàn diệncủa nó [1]

Trong đậu tương có hàm lượng protein cao hơn thịt, cá, cao gấp 2 lần

so với các loại đậu đỗ khác và hàm lượng protein có thể chiếm tới 50% phụthuộc vào giống và điều kiện chăm sóc, không tạo cholesteron và dễ tiêu hóahơn protein trong thịt, cá Ngoài ra có khoảng 18% là các chất béo gồm cácaxit béo không no là nguồn cung cấp dầu thực vật quan trọng Các loại

vitamin nhóm B, E; các nguyên tố như sắt, canxi, photpho và thành phần chất

xơ rất cần thiết cho cơ thể [53]

mùa khô

Hình 1 3: Cây đậu gà (Nguồn: Jovina Cooks - 14/9/2012 [56])

Đậu gà có chiều cao trung bình khoảng 20 - 100 cm Bộ rễ lan rộng,thân cây phân nhánh, thẳng hoặc uốn cong, bề mặt thân được bao phủ bởi 1lớp lông, thân có màu xanh lá cây Lá dài 5cm, lá chét hình bầu dục đến hình

elip Đậu gà có hai loại chính đó là kabuli và desi Ở desi, có nhiều màu sắc

hoa khác nhau từ màu hồng đến màu đỏ hoặc màu xanh vân đến màu tím, hạt

desi có kích thước nhỏ, tối màu Đối với kabuli, hoa thông thường có màu

kem và màu trắng, hạt có kích thước lớn hơn so với desi, màu sáng [30].

Cho đến nay, cây đậu gà được xem là một cây họ Đậu quan trọng thứhai sau đậu tương Đậu gà được sử dụng làm thực ph m cho con người, thức

ăn chăn nuôi, làm nhiên liệu và giúp cố định nito trong đất do kết hợp với các

chủng Rhizobium trong các nốt sần ở rễ [41] Đậu gà thường được sử dụng để

khôi phục độ phì nhiêu của đất trước khi trồng các cây lương thực hoặc cácloài hạt có dầu, nó còn được sử dụng như một công cụ đê phá vỡ chu kỳ bệnh

và giúp giảm sử dụng thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ

Các nghiên cứu cho thấy trong đậu gà chứa thành phần gồm: lipit,carbohydrate, các vitamin và khoáng chất là những dinh dưỡng thiết yếu,ngoài ra còn có thành phần chất xơ cao hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa ở người

và động vật Đặc biệt protein trong đậu gà chứa nhiều amino acid nhưcysteine, methionine, tyrosine và lysine đồng thời chứa arginine và asparticacid

1.2.3 q ạc

t hu ộ c c h i Ar a c h i s , phân họ Fab o i d e ae Loài này có thể đã được thần hóa đầu

tiên ở phía Tây Bắc Argentina hoặc ở các vùng thung lũng của g u ayPara h oặc

B

o li vi a ( Nam Mỹ), nơi mà các chủng hoang dã nhất của chúng còn phát triểncho đến ngày nay [25] Ở Per u , các nhà khảo cổ đã tìm thấy mẫu vật lâu đờinhất của cây lạc khoảng 7.600 năm [10] Người Bồ Đào Nha và Tây Ban Nhaphát hiện cây lạc ở các thuộc địa vùng Nam và Trung Mỹ, từ đó cây lạc đượclan truyền trên toàn thế giới bởi các thương nhân châu Âu Vào thế kỷ XVI,người Bồ Đào Nha đã mang lạc từ Brazil đến Tây châu Phi và sau đó là TâyNam Ấn Độ Và sau đó là T r un g Q u ố c v à các nước ở Tây Thái Bình Dươngnhư Indonesia, Madagascar vào thế kỷ XVII và sau đó lan rộng ra khắp châu

Á Ở Việt Nam, cây lạc có thể từ Trung Quốc nhập vào nước ta khoảng cuốithế kỷ XVII [24].

Hiện nay có khoảng 1000 giống lạc khác nhau được trồng khắp cácnước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.Do ít mẫn cảm với thời gian chiếu sáng

và có tính chịu hạn tốt cho nên lạc được trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới

từ 40 vĩ độ Bắc đến 40 vĩ độ Nam [8,9]

Hình 1 4: Cây lạc (Nguồn: Hồ Đình Hải - 5/2/2014 [58])

Lạc là cây thân thảo đứng, sống h ng niên Thân phân nhánh từ gốc, cócác cành toả ra, cao 30 - 50 cm tùy theo giống và điều kiện trồng Rễ cọc, cónhiều rễ phụ, rễ cộng sinh với vi khu n tạo thành nốt sần Lá kép mọc đối,kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 4 - 7 cm và rộng 1 -

3 cm Có 2 lá kèm làm thành bẹ bao quanh thân, hình dải nhọn Cụm hoa mọcthành chùm ở nách, gồm 2 - 4 hoa nhỏ Dạng hoa đậu điển hình màu vàng cóđiểm gân đỏ, cuống hoa dài 2 - 4 cm Sau khi thụ phấn, cuống hoa dài ra, làm

cho nó uốn cong cho đến khi quả chạm mặt đất, phát triển thành một dạng quảđậu (củ) trong đất dài 3 - 7 cm, hình trụ thuôn, không chia đôi, thon lại giữacác hạt, có vân mạng Quả chứa từ 1 đến 4 hạt, thường là 2 hạt, hạt hìnhtrứng, có rãnh dọc Cây lạc có thời gian sinh trưởng khoảng 120 - 150 ngàysau khi gieo hạt Nếu được thu hoạch quá sớm, quả sẽ chưa chín Nếu đượcthu hoạch muộn, cuốn quả sẽ đứt khỏi cây và sẽ ở lại trong đất.[22,24,25,31,40].

Lạc là cây trồng phổ biến, đem lại năng suất và giá trị kinh tế cao do cókhả năng thích nghi tốt Cây lạc cũng có khả năng cải tạo đất trồng b ng cốđịnh đạm từ nguồn nito không khí hoặc trở thành phân xanh giúp tăng độ phìnhiêu cho đất Ngoài ra cây lạc còn có nhiều ứng dụng trong đời sống như sảnxuất dầu thực vật, thực ph m, trong y học

Theo nghiên cứu của y học hiện đại, thành phần hóa học có trong các

bộ phận của lạc bao gồm hạt chứa 3 - 5% nước, chất đạm 20 - 30%, chất béo

40 - 50%; chất bột 20%, chất vô cơ 2 - 4% Nhân lạc chứa dầu lạc gồm cácglycerid của acid béo no, không no, acid oleic, acid linoleic, acid palmitic,acid stearic, acid hexaconic Lạc chứa hơn 30 chất dinh dưỡng thiết yếu vàdinh dưỡng thực vật, là một nguồn cung cấp niacin, folate, chất xơ, vitamin E,magiê và phốt pho Đặc biệt, đậu phộng chứa hợp chất resveratrol có tínhchống oxy hóa mạnh, làm tăng cholesterol tốt HDL giúp hệ tuần hoàn khỏemạnh, máu huyết lưu thông tốt, da dẻ hồng [54]

Hình 1 5: Cây đậu côve (Nguồn: Bùi Thụy Đào Nguyên - 20/8/2013)

Đậu côve là cây trồng chịu ấm nên canh tác được trong điều kiện ấm ápcủa vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, đậu không chịu được giá rét Đậu côve làcây trồng hàng năm, thân thảo có 2 dạng: thân hữu hạn (cao trung bình 50 -60cm), thân vô hạn (có thể cao tới 2,5 - 3m) Lá kép, có 3 lá phụ với cuống ládài, mặt lá rất ít lông Rễ chính mọc sâu nên có khả năng chịu hạn tốt Rễ phụ

có nhiều nốt sần chủ yếu tập trung ở độ sâu khoảng 20 cm Hoa lưỡng tính, tựthụ khoảng 95% nên việc để giống dễ dàng Chùm hoa mọc ở nách lá trungbình có từ 2 - 8 hoa Đài hoa hình ống, 5 cánh, trong đó 1 cánh cờ, 2 cánhbên, 2 cánh thìa, 2 bó nhị đực dính liền và 1 nhị tách rời tạo thành hình ốngbao quanh nhị cái Số quả trên chùm thay đổi từ 2 đến 20 quả có thể tới 400quả/ cây Màu sắc quả có thể xanh hoặc vàng Sau khi trồng 35 - 40 ngày đã

có hoa nở Trái đậu ăn tươi thu hoạch từ 10 - 13 ngày sau khi hoa nở Hạt lớn,trọng lượng 1000 hạt đạt 250 - 450g [49]

Đậu côve được sử dụng như một loại thực ph m phổ biến trong bữacơm gia đình Đây là thực ph m dồi dào các chất dinh dưỡng thực vật, chất

chống oxy hóa, vitamin K, canxi, silic, giúp tăng cường hệ thống miễn dịchcủa cơ thể, tăng cường sức khỏe xương, phòng chống bệnh tim mạch Ngoài

ra chất quercetin và kaempferol trong đậu côve có khả năng tiêu diệt gốc tự

do có hại do đó có thể phòng chống một số loại bệnh Hàm lượng chất xơ caogiúp điều hòa và giảm bớt glucose trong máu, tốt cho hệ tiêu hóa cũng nhưthích hợp với chế độ ăn giảm cân Các phần phụ của cây cũng được sử dụngnhư một loại thức ăn cho gia súc Ngoài ra đậu côve còn được báo cáo là đã

cố định tới 125kgN/ha

1.2.5 q ậu xanh

Đậu xanh (Mung bean) có tên khoa học là Vigna radiata thuộc chi

Vigna, phân họ Faboideae, họ Fabaceae có nguồn gốc ở Ấ n Đ ộ v à Trung

Á, từ đó lan sang nhiều khu vực khác của châu Á Ở Ấn Độ, các nhà khoa học

đã phát hiện vết tích cây đậu xanh được trồng ở khu vực nền văn minh cổHarappan ở Punjab và Haryana có niên đại khoảng 4.500 năm b ng phươngpháp carbon phóng xạ Các b ng chứng khảo cổ cũng đã kết luận cây đậuxanh được trồng rộng rãi ở Ấn Độ cách nay khoảng 3.500 - 3.000 năm ỞThái Lan, vết tích cây đậu xanh trồng đã được xác định cách nay khoảng 2200năm tại khu vực Khao Sam Kaeo ở miền Nam Thái Lan Ở Châu Phi, trên đảoPemba đã phát hiện các vết tích của đậu xanh để lại Nhờ các b ng chứngkhảo cổ đã xác định khoảng trong thời đại của thương mại Swahili, thế kỷ thứ

IX hoặc thứ X [28]

Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thíchnghi với các vùng có điều kiện khắc nghiệt Ở châu Á cây đậu xanh đượctrồng nhiều ở các quốc gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka,Nepal, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, Lào,Philippines, Malaysia và Indonesia Sau này cây đậu xanh còn được trồng ởTrung Phi, các vùng khô và nóng ở N am  u , phía Đông Bắc châu Úc, Nam

nhiệt đới, độ cao từ vùng đồng b ng đến 1.850 mét [28] Là cây đậu đỗ quantrọng đứng hàng thứ ba sau đậu nành và lạc (2 loại cây công nghiệp ngắnngày).

Hình 1 6: Cây đậu xanh (Nguồn: eminhatban - 2018 [55])

Đậu xanh là cây thân thảo nhỏ, mọc đứng, sống h ng niên Thân cao 40

- 80 cm tùy thuộc vào giống và cách trồng Trong điều kiện canh tác tốt câyđậu càng cao cho năng suất càng tốt (nếu không bị đổ ngã) Rễ gồm 1 rễ cái

và nhiều rễ phụ Đất xốp thoáng rễ có thể mọc sâu đến 40 cm Từ 15 ngày saukhi gieo, rễ đã có các nốt sần hữu hiệu cho cây Từ thân chính phát triển ranhiều cành cấp 1, một số cành cấp 1 phát triển thêm cành cấp 2 Đa số hoa vàquả phát triển trên thân chính và cành cấp 1, rất ít quả trên cành cấp 2 Khimới mọc, cây có 2 lá đơn nhỏ, sau đó là các lá kép Mỗi lá kép có 3 lá đơn, cólông ở cả hai mặt

Nụ hoa phát triển từ các chùm hoa mọc ở kẻ lá, mỗi chùm có 16 - 20hoa màu vàng lục, nhưng thường chỉ đậu 3 - 8 quả Hoa nở từ 35 - 40 ngàysau khi gieo Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ thẳng, dạng mảnh

nhưng có số lượng nhiều, có lông Từ lúc nở, quả bắt đầu phát triển và chínsau 18 - 20 ngày Quả non có màu xanh, nhiều lông tơ, khi già có màu xanhđậm và khi chín có màu nâu đen hay vàng và ít lông Mỗi quả có khoảng 5 -

10 hạt Hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, đường kính khoảng 2 2,5mm, màu xanh, ruột màu vàng, có mầm ở giữa Các giống thường có hạtmàu xanh mỡ (bóng) hay mốc (có những giống hạt vàng, nâu hay đen), 1000hạt nặng 30 - 70g Các giống hạt xanh bóng, có trọng lượng 1000 hạt nặnghơn 55g thích hợp để xuất kh u

-Ở Việt Nam đậu xanh được trồng trong khắp cả nước từ Bắc vào Nam.Đây là loài cây rau và thực ph m quan trọng và là một loại đậu có giá trị đặcbiệt trong văn hóa m thực Việt Nam Nó được sử dụng làm nguyên liệu trong

cả các món ăn mặn và ngọt Ngoài ra còn là nguyên liệu của công nghiệp chếbiến, một vị thuốc được sử dụng ở cả đông y và tây y Đậu xanh có thể được

sử dụng làm cây che phủ trước hoặc sau khi trồng ngũ cốc, làm phân xanhcho nông nghiệp Cũng như các loài cây họ Đậu khác, đậu xanh có khả năng

cố định nito (30 ~ 251Kg/ha) và cung cấp một lượng sinh khối lớn (7,16 tấnsinh khối/ha) [7,20]

Trong 100g ăn được, hạt đậu xanh có chứa khoảng 62 - 63%carbohydrate và 16% chất xơ, 24% protein, 1% béo, và cung cấp khoảng340kcal Carbohydrate trong hạt đậu xanh gồm chủ yếu là tinh bột (32 - 43%),với lượng amylose chiếm khoảng 19,5 - 47% Nguồn tinh bột dồi dào trongđậu xanh đã được ứng dụng rộng rãi vào thực tiễn sản xuất [34] Ngoài ra,trong đậu xanh còn chứa nhiều loại đường, chủ yếu là saccharose, trong đóhàm lượng glucose chiếm ưu thế hơn so với fructose, và một số đường khácnhư raffinose, arabinose, xylose, galactose Đậu xanh có nguồn vitamin đadạng như A, B1, B2, C, niacin và muối khoáng tập trung chủ yếu ở phần vỏhạt gồm có Na, K, Ca, P, Fe, Cu Ngoài ra trong hạt đậu xanh còn chứa cácenzym như lipase, transferase, hydrolase, lipoxygenase

1.2.6 q ỏ i h ă

Cỏ linh lăng có tên khoa học là Medicago truncatula thuộc chi

Medicago, họ Fabaceae Có nguồn gốc ở khu vực Địa Trung Hải, tức là khu

vực phía Nam và Đông Âu, Bắc Phi, Macaronesia, Tây Á và Caucasus Nó

thích hợp của chúng là các đông cỏ nội địa Địa Trung Hải và các vùng câybụi, sườn núi khô c n, đồng cỏ, cánh đồng và ở các vùng đất đá vôi, phù sa[6,46]

Hình 1 7: Cây cỏ linh lăng (Nguồn: Ninjatacoshell - 14/4/2019 [63])

Medicago truncatula là một cây họ Đậu nhỏ, sống h ng niên Cây cao

khoảng 10 - 60 cm, có 3 lá trong một cuống lá, mỗi lá dài 1 - 2 cm Hoa mọcđơn lẻ hoặc thành cụm nhỏ từ 2 đến 5 bông, màu vàng nhạt Quả nhỏ, có gai.Loài này được sử dụng như một mô hình lâu đời để nghiên cứu các đặc tínhsinh học cho các cây họ Đậu vì nó có bộ gene lưỡng bội nhỏ và có thể tự sinhsản, có vòng đời ngắn, có thể chuyển đổi gene và bộ gene của nó đã được giảitrình tự ~ 94% [51] Nó được sử dụng làm thức ăn gia súc và góp phần cải tạođất đai, chống xói mòn [44,46]

1.3 Tổng quan về yếu t phiên mã NF-YA

1.3.1 Cấu trúc của NF-Y và tiểu phần NF-YA

Người ta đã tìm thấy NF-Y ở nấm men [18,32], thực vật [11,42] và ởmột số loài sinh vật nhân chu n gồm Mus (chuột nhắt), Rattus (chuột cống)

và Homo sapiens (loài người) Yếu tố này có chức năng hoạt hóaheterotrimeric (HAP) hoặc yếu tố CCAAT kết hợp (CBF), được xác định r ng

có ít nhất ba tiểu phần: NF-YA (HAP2 hoặc CBF-A), NF-YB (HAP3 hoặcCBF-B) và NF-YC (HAP5 hoặc CBF-C) Đây là một trong các nhóm TF cóvai trò quan trọng đặc biệt với thực vật [27], điều hòa các quá trình phát triển

và đáp ứng với các nhân tố bất lợi [37]

Gene NF-YA ở thực vật là tiểu đơn vị thuộc họ gene TF Trong tất cảcác loài sinh vật nhân chu n được kiểm chứng cho đến nay, NF-YA proteinđược đặc trưng bởi hai vùng bảo thủ mạnh mẽ và ở thực vật thì chúng cònđược thể hiện sự đa dạng qua chiều dài và cấu trúc

1.3.2 Vai trò của NF-YA ối với thực vật

Gene mã hóa TF chiếm khoảng 7% trong hệ gene thực vật, trong đóphần lớn các gene liên quan đến đáp ứng với các điều kiện bất lợi và mộttrong những yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất là NF-YA Các gene chứcnăng điều hòa nhanh các biểu hiện giúp cho thực vật có thể thích nghi với môitrường sống, quá trình này đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự đáp ứngcủa thực vật với các điều kiện bất lợi của môi trường cả về các yếu tố sinh học

và phi sinh học Phần lớn các công bố liên quan đều chỉ ra r ng các gene

NF-YA ở thực vật đóng vai trò trong viêc đáp ứng lại các điều kiện bất lợi, ví dụnhư khả năng chịu nhiệt, đáp ứng với điều kiện hạn hán

Cho đến gần đây, từ một số b ng chứng trực tiếp và giàn tiếp thông qua

NF-YA trong các phản ứng bất lợi sinh học Các TF NF-YA các chức năngnhư là một thành phần quan trọng trong các tín hiệu đáp ứng với bất lợi phisinh học của thực vật.

1.4 Tình hình nghiên cứu hiện nay

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1995, tiểu đơn vị NF-YA ở thực vật được tìm thấy lần đầu

tiên ở cải dầu (Brassica napus) đã tìm thấy 33 BnNF-Y được cho là có liên

quan đến các đáp ứng giúp cây thích nghi với yếu tố bất lợi liên quan đến độmặn, hạn hán hay ABA Năm 2007 các nhà khoa học đã tìm thấy tất cả 35

gene Y ở lúa mì (T aestivum) trong đó có 10 YA, 11 YB và 14

NF-YC Các gene này được tìm thấy phân bố trong tất cả các mô của cây và cả 3

tiểu phần đều có các thành viên có sự tăng cường biểu hiện ở nội nhũ Sự có

mặt của các gene NF-Y trong lúa mì được chứng minh là liên quan đến sự

tăng cường về khả năng chống chịu với các bất lợi về nguồn nước [47] Một

nghiên cứu khác trong Canola (dầu hạt cải) chứng minh r ng khuôn DNA thể

hiện độ dài đầy đủ cấu trúc của BnCBF này (tiểu đơn vị CBF-B; các vị trí

tương đồng gần nhất trong Arabodopis là AtNF-YA9) dưới sự kiểm soát của

một promoter cụ thể dẫn đến sự thoái hóa của tế bào [43] Trên các vùng mắt

và mô phân sinh của M truncatula đã xác định được 8 gene mã hóa NF-YA

trong đó có MtNF-YA1 có vai trò quan trọng đối với sự phát triển các nốt sần

và chức năng của mô phân sinh và không gây ảnh hưởng đến các quá trìnhkhác trong rễ Điều này cho thấy NF-YA có sự chuyên môn hóa để thích ứngvới cơ quan chỉ có riêng trên các cây họ Đậu Gần đây các nghiên cứu nhận ra

một tiểu đơn vị NF-YA của Arabidopsis là AtNF-YA4 có liên quan tới các

phản ứng mở protein, lưới nội chất, sự tích tụ của các protein xoắn trong lướinội chất dẫn đến sự giảm của dịch protein để ngăn ngừa tích tụ thêm cácprotein gây nên cơ chế stress nội chất Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy 59

gene NF-Y trên cây cà chua (Solanum lycopersicum) b ng phương pháp tin sinh học và đã tiến hành so sánh với A thaliana để kiển tra mối quan hệ tiến

hóa và đự đoán mức độ tương đồng về chức năng Kết quả cho thấy có 13/59gene có vai trò trong sự điều chỉnh quá trình chín ở quả Năm 2018, Chu Đức

Hà và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bộ genome của đậu gà (C Arietinum)

và xác định được 8 gene NF-YA, 21 gene NF-YB và 11 gene NF-YC Cũng

trong nghiên cứu này các tác giả đã tiến hành phân tích đặc tính và dự đoán

18 gene CaNF-Y (gồm 8 NF-YA, 7 NF-YB và 3 NF-YC) có vai trò trong phản

ứng lại với các yếu tố bất lợi sự mất nước trong cây đậu gà Trong đó, 15/18gene được xác định r ng sự có mặt của chúng trong các mô ở rễ hoặc lá giúpphản ứng với điều kiện mất nước và 12/18 gene có vai trò chức năng trongphản ứng với hormone gây bất lợi là ABA [16]

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của NF-YA cóthể kể đến như tác giả Wen-xue Li đã tiến hành các nghiên cứu và chỉ ra r ngyếu tố phiên mã NF-YA5 có vai trò thúc đ y cơ chế kháng hạn trên mô hình

Arabidopsis Ở cây ngô (Z may) cũng tìm được yếu tố phiên mã ZmNF-YB2

ảnh hưởng tới sự tăng khả năng chịu hạn và thích nghi với bất lợi môi trường

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tro ước

Những nghiên cứu về yếu tố phiên mã NF-Y mới được các nhà khoahọc trong nước quan tâm tới thời gian gần đây nên kết quả thu được còn hạnchế Tuy nhiên, nổi bật có thể kể đến nghiên cứu của Chu Đức Hà và cộng sự

đã xác định và phân tích cấu trúc gene mã hóa NF-YB trên đối tượng cam

ngọt (Citrus sinensis) Kết quả nhiên cứu đã xác định được 19 gene mã hóa

tiểu phần NF-YB và các gene này n m rải rác trên bộ NST của cam ngọt [3]

Trên đối tượng cây sắn (Manihot esculenta Crantz), dựa vào bộ genome được

giải mã gần đây các nhà khoa học đã tiến hành xác định các gene mã hóa cho

chiều dài và sự sắp xếp của các đoạn exon/intron phân bố rải rác trên hệ genecủa sắn [3].

Đối với NF-YA đã tìm thấy 6 gene mã hóa TF NF-YA trên hệ gene cam ngọt (Citrus sinensis) và các gene này hầu hết đều có cấu trúc chứa 5 exon/4 intron Tất cả các gene CsNF-YA đều được tăng cường phiên mã tại ít nhất 1

mô hoặc cơ quan chính Hai gene, CsNF-YA1 và CsNF-YA6 đều được tăng cường biểu hiện ở callus, trong khi CsNF-YA4 được huy động nhiều tại quả.

Ba gene còn lại đều có xu hướng được tăng cường phiên mã ở cả 4 mô và cơ

quan [17] Và trên sắn (Manihot esculenta Crantz) nhóm tác giả cũng đã xác

định tổng cộng 12 thành viên thuốc họ gene NF-YA n m trên 18 NST với cáctần số khác nhau và có cấu trúc chứa 5 exon/4 intron [5]

Chương 2: DỮ LIỆU, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Dữ liệu nghiên cứu

Hệ gen và hệ protein của A hypogaea và V radiata trên Phytozome

2.1.2 Đị iểm nghiên cứu

Phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp - Viện Khoa họcNông nghiệp Việt Nam

Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 3/2018 đến tháng 04/2019

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định NF-YA ở lạc và đậu xanh

Nội dung 2: Phân tích đặc tính NF-YA ở các cây họ Đậu

Nội dung 3: Xác định cấu trúc gene mã hóa NF-YA ở các cây họ ĐậuNội dung 4: Xây dựng cây phân loại cho NF-YA ở các cây họ Đậu