Thực vật chuyển gen

Năm 1989, không những thành công trong việc chuyển các gen mã hóa các kháng thể vào thực vật, mà người ta còn tạo nên các sản phẩm gen này như mong muốn, mở ra một khả năng hoàn toàn mới

Trường Đại học Sư Phạm Tp.HCM

Đề tài: THỰC VẬT CHUYỂN GEN

GVHD: Cô Dương Thị Bạch Tuyết

SVTH: Mai Hoàng Diễm

Đỗ Thanh Trang

Phan Thanh Huy

MỞ ĐẦU

Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng.

Giảm chi phí sản xuất

Tăng lợi nhuận nông nghiệp

Cải thiện môi trường

Bằng cách nào người ta tạo được các giống cây trồng ấy?

Thực vật chuyển gen còn được phát triển theo những hướng nào khác?

MỞ ĐẦU

NỘI DUNG

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

1 Khái niệm thực vật chuyển gen

2 Lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật

II CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH CHUYỂN GEN

III CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG LĨNH VỰC TẠO THỰC VẬT CHUYỂN GEN

1 Các hướng nghiên cứu

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

1 Khái niệm thực vật chuyển gen

a Khái niệm

Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) của một sinh vật được gọi là quá trình biến nạp (transformation) Những cây được biến nạp được gọi là cây biến đổi gen (genetically modified plant-GMP)

b Mục đích

 Tạo các giống cây năng suất cao, chất lượng tốt

 Không làm mất tính đa dạng sinh học của muôn loài

 Nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu đối với nông nghiệp và môi trường

 Tăng thu nhập, giảm đói nghèo ở các nước đang phát triển

 Cho phép các nhà tạo giống thực vật đưa ra giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của tạo giống truyền thống

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

2 Lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật

Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) được chuyển vào thực vật nhờ VK đất

Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên, T-DNA (Ti-plasmid của VK đất) vẫn chưa được thay đổi.

Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

Năm 1984, biến nạp bằng tế bào trần (protoplast) ở ngô được thực hiện nhờ polyethylene glycol (PEG) hoặc xung điện (electroporation).

Năm 1986, tạo được thực vật kháng virus

Năm 1987, phương pháp biến nạp phi sinh học được sử dụng

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

Năm 1989, không những thành công trong việc chuyển các gen mã hóa các kháng thể vào thực vật, mà người ta còn tạo nên các sản phẩm gen này như mong muốn, mở ra một khả năng hoàn toàn mới mẻ cho việc sản xuất vaccine và cả khả năng chống bệnh ở thực vật.Năm 1990, thành công trong việc tạo ra cây biến đổi gen bất dục đực, không có khả năng tạo hạt phấn Loại cây trồng này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất hạt giống.

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

Năm 1994, lần đầu tiên cà chua biến đổi gen được bán trên thị trường.

Năm 1998, trên thế giới đã có 48 giống cây trồng biến đổi gen và sản phẩm được thị trường hóa

Năm 1999, cây lúa biến đổi gen được đưa ra với 7 gen được biến nạp

I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN

II CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH CHUYỂN GEN

1 Nguyên tắc

Đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào thực vật Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua dòng mầm Vì vậy, mọi tế bào kể cả tế bào mầm sinh sản đều chứa vật chất di truyền đã được sửa đổi như nhau

Một số điểm cần lưu ý khi chuyển gen:

 Không phải tất cả các tế bào đều thể hiện tính toàn năng

 Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai

 Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome

 Chỉ có một số tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây

 Thành phần của các quần thể TB được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.

 Thành TB ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai Vì vậy, cho đến nay chỉ có thể chuyển

gen vào TB có cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bằng bắn gen hoặc phải phá bỏ

thành TB để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu âm và vi tiêm

 Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của TB vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome.

 Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào DNA của cây chủ lại không liên kết với

genome mà chuyển từ TB này sang TB khác ngoại trừ mô phân sinh

2 Nguyên liệu

TB thực vật riêng lẻ, các mô hoặc cây hoàn chỉnh

Hạt phấn được coi là nguyên liệu lý tưởng để gây biến nạp

1.Tách DNA plasmid và DNA tế bào cho nhờ enzym

cắt.

2.Trộn chung DNA plasmid với đoạn DNA TB

cho, thêm enzym Nối ligaza tạo DNA tái tổ hợp

hoàn chỉnh

3.Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (VK

E.coli)

4.Chọn lọc và tạo dòng vi khuẩn mang gen lạ Sau

đó tạo điều kiện để gen bểu hiện tạo ra sản phẩm.

3 Các bước

 Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở thực vật là thành TB => phá vỡ thành TB, để tạo ra

TB trần

 Ở thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối cùng thường là một cơ thể biến nạp hoàn toàn

 Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô TB Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn

 Từ một TB duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gen, trong đó mỗi TB mang DNA ngoại lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau khi nở hoa và tạo hạt

4 Một số phương pháp chuyển gen

4 1 Chuyển gen gián tiếp

a Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens

 Thiết kế vector: cắt bộ gen điều hòa sinh trưởng cục bộ, gắn thêm gen chỉ thị ( kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển phù hợp để chọn các thể biến nạp và gắn vào gen biến nạp.

VK Agrobacterium tumefaciens

Tạo cà chua biến đổi gen

(1) Sao chép một đoạn gen từ cà rốt

(2)Chèn đoạn gen vào một plasmid

(3) Plasmid này lại được đưa vào Agrobacterium

(4) Agrobacterium chuyển đoạn gen của cà rốt vào các TB cà chua nằm trên đĩa petri.

(5)TB cà chua này tiếp tục sinh trưởng và chuyển sang môi trường có chứa hormone kích thích sự mọc

rễ và chồi

(6) Gen từ cà rốt đã làm biến đổi sắc tố của cà chua thành màu của beta – carotene, tạo ra cà chua có giá trị cao

Ưu điểm

Gen ít bị đào thải.

Số lượng bản sao ít hơn => Tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau.

Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật.

Nhược điểm

Khả năng biến nạp giới hạn.

Nguyên lý

 Hệ gen của virus phải là DNA

 Virus có khả năng di chuyển từ TB này sang TB khác qua các lỗ ở vách TB

 Có khả năng mang được đoạn DNA mới, sau đó chuyển vào TB thực vật

 Có phổ kí chủ rộng

 Không gây tác hại đáng kể cho thực vật

b Chuyển gen gián tiếp nhờ virus

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

Chuyển gen bằng vi tiêm

Chuyển gen bằng xung điện

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

4.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

a Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Nguyên lý

 Ngâm những vi đạn với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển

 Các vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng

 Đĩa này được gắn vào đầu một viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen

 Khi bắn, viên đạn lớn bị giữ lại còn vi đạn xuyên vào TB

 Sau khi bắn, tách các mô, TB và nuôi cấy invitro để tái sinh cây

Súng bắn gen Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn

gen

Ưu điểm

 Thao tác dễ dàng, bắn một lần được

nhiều TB.

 Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn,

TB nuôi cấy, TB mô hóa và mô phân

sinh).

Nhược điểm

Tần số biến nạp ổn định thấp

b Chuyển gen bằng xung điện

Xung điện ngắn

Tế bào

Màng TB

Xuất hiện lỗ tạm thời

DNA chui vào trong TB

Sau khi biến nạp, tách những enzym phân giải và để cho TB phát triển, thành TB mới được tạo nên.

Các TB này được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp kích thích sinh trưởng tạo nên cây hoàn chỉnh.

Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích genome để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen.

Nhược điểm: chưa chắc chắn có sự biến nạp

c Chuyển gen bằng vi tiêm

Sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đưa DNA những TB nhất định nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ

protoplast (TB trần) và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.

Nguyên lý

Tối ưu lượng DNA đưa vào TB.

Quyết định được đưa DNA vào loại TB nào.

Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và

có thể quan sát được

Có thể nuôi riêng lẻ các TB vi tiêm và biến nạp được vào

mọi giống cây.

Mỗi lần tiêm chỉ được một phát và một TB.

Thao tác đòi hỏi độ chính xác cao.

Ưu điểm

Nhược điểm

Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù khoảng 3mm.

Đem TB trần nuôi cấy trong môi trường thích hợp và chọn ra TB trần được chuyển gen

Tạo TB trần Plasmid tái tổ hợp

(mang gen mong muốn)

d Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

Nguyên lý

Dung dịch huyền phù

Nguyên lý

e Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

Polyethylen glycol (PEG).

Khi có mặt PEG màng của TB trần bị thay đổi và TB trần có thể thu nhận DNA

Nguyên lý

Ưu điểm

 Tần số chuyển gen cao

Thời gian chuyển gen tốt nhất khi quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn và cho hợp

tử chưa phân chia.

Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau.

Hợp tử

Nhược điểm

 Khó xác định được thời điểm chuyển gen

f Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

III CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG LĨNH VỰC TẠO THỰC VẬT CHUYỂN GEN

III CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG LĨNH VỰC TẠO THỰC VẬT CHUYỂN GEN

1 Các hướng nghiên cứu

a Chuyển gen kháng nấm gây bệnh

Chuyển hai gen chitinase và glucanase (làm thoái hóa các thành phần chính của

vỏ TB nấm) giúp tăng tính kháng nấm gây bệnh

Thuốc lá

Cà chua

Gen mã hóa α- thionin – cystein được chuyển vào cây thuốc lá cũng

phòng trừ được VK Pseudomonas syringae

Dùng gen mã hóa enzym làm thoái hóa thành TB

=> Phòng trừ VK Erwina

carotovora

c Chuyển gen kháng virus gây bệnh

Có nhiều cách tạo cây kháng virus: chuyển gen mã hóa protein vỏ của virus, chuyển gen tạo enzym phân giải virus hoặc chuyển gen có trình tự đối bản (antisens) với ARN của virus

=> virus không nhân lên được

VD: đu dủ kháng với virus gây bệnh đốm vòng, cây thuốc lá kháng với virus khảm dưa

chuột , cây thuốc lá kháng với virus khảm alfa, khoai tây kháng với virus X, virus Y, cam, quýt kháng bệnh virus gây tàn lụi tristeza…

Lá cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV và đối chứng

Cây thuốc lá chuyển gen kháng virus CMV và

đối chứng

Đu đủ chuyển gen kháng virus

Cà chua chuyển gen kháng vật kí sinh (phải) và cà chua đối chứng (trái)

d Chuyển gen kháng côn trùng phá hoại

Cry

Côn trùng

Kiềmđộc tố

hoạt độngcác receptor đặc trưng

Chết

Các cây trồng như bông, ngô, khoai tây đã được chuyển gen này để tạo ra tính kháng với côn trùng loại nhai – nghiền

Ngô (Bt corn) mang gen Bt (chống sâu hại)

Thuốc diệt cỏ glyphosat là thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt nhất và ít gây ô nhiễm môi trường Thuốc kìm hãm sự hoạt động của enzym enol pyruvat sikimat phosphat (EPSPS).

Enzym này chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành acid sikimic

Acid sikimic không được hình thành sẽ làm rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất của cỏ và làm

EPSPS Acid sikimic Cỏ

Tạo ra các dòng gen ở cây đậu tương hoặc ngô mà các gen này mã hóa cho protein giàu các acid amin (lysine, methionine, threonine và tryptophan).

VD: chuyển gen mã hóa cho một loại protein chứa các acid amin có lưu huỳnh cao bất

thường vào cây đậu lupin với mục đích biểu hiện ở hạt Kết quả làm tăng 100% hàm lượng

protein trong hạt Hạt này dùng để nuôi cừu tăng trọng 7% và sản lượng lông tăng 8% so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường

f Chuyển gen cải tiến các protein hạt

Những gen mã hóa cho protein được gắn với một promotor và đảm bảo cho protein chỉ được tổng hợp ở rễ Tiếp theo, protein tạo thành có một hệ thống tín hiệu đảm bảo cho nó được vận chuyển vào một vị trí xác định trong TB Trong trường hợp đặc biệt, protein được vận chuyển vào mạng lưới nội chất (ER).

Protein đi vào có thể được thải ra bên ngoài và chỉ ở vùng rễ, vì promoter chỉ đặc hiệu cho vùng này Người ta dùng một số dung dịch muối để tách protein một cách dễ dàng với giá thành hợp lý

g Chuyển gen sản xuất các loại protein mới

Chuyển gen mã hóa protein động vật vào thực vật để sản xuất protein thực vật.

VD: chuyển gen tổng hợp lactoferrin (protein trong sữa động vật) vào khoai tây, lúa làm

chúng có khả năng tổng hợp lactoferrin

Chuyển gen để sản xuất “thực phẩm chức năng”: chuyển các gen tổng hợp các protein có tác dụng như các kháng nguyên vào cây trồng (rau, đậu, cây ăn quả) => Các cây này tạo được

vaccin

=> Ăn cây trồng chuyển gen tạo vaccin thay thế cho việc tiêm vaccine phòng bệnh

g Chuyển gen sản xuất các loại protein mới

Thực phẩm chức năng

Chuyển một phức hợp gồm gen rolC của A tumefaciens và promoter CaMV 35S (cauliflower

mosaic virus: virus gây bệnh khảm ở súp – lơ) vào cây thuốc lá và đã thu được cây chuyển gen bất thụ

Kết quả này đang được nghiên cứu và áp dụng trên nhiều cây khác

h Chuyển gen mang tính bất thụ đực

Gần đây, các nhà nghiên cứu của ĐH Bristol (Anh) đã thông báo về việc sản xuất hai chuỗi dài acid béo không tạo cholesterol với số lượng lớn ở thực vật bậc cao.

VD: chuyển gen vào cây Arapidopsis thaliana tạo ra được các acid béo thiết yếu như

arachidonic acid và eiconsapentaenoic acid

i Chuyển gen để sản xuất các acid béo thiết yếu

Cây mù tạt Ấn Độ (Brassica juncea) vốn có khả năng kháng và hấp thụ selen (độc với thực vật ở

hàm lượng cao) Khi chuyển thêm gen tạo enzym đói selen vào làm cây này hấp thụ selen cao 3,4 lần.Tuy nhiên, khả năng cây chuyển gen này sẽ lai với các loại hoa màu khác là một điều đáng lo ngại

k Làm sạch đất ô nhiễm

Chuyển gen vào đậu tương và ngô làm cây có:

Hàm lượng dầu cao hơn, cung cấp nhiều năng lượng hơn cho bò, lợn và gia cầm.

Hàm lượng các loại amino acid không thay thế cao hơn

Tăng hàm lượng phosphore trong thức ăn chăn nuôi

l Làm thức ăn chăn nuôi

Các sắc tố tạo màu sắc hoa được chứa trong mô của cánh hoa nhất là TB biểu bì.

Có 3 nhóm anthocyanin cơ bản tạo ra màu sắc hoa: dẫn xuất của các chất pelargonidin, cyanidin và delphinidin

Trên cơ sở biết gen mã hóa cho các enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta đã chuyển gen mã hóa hoặc gen ức chế hoạt động của các enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố tạo ra hoa có nhiều màu sắc khác nhau

m Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc

Đa dạng màu hoa

Bông cải chuyển gen

Ngoài ra, còn có các hướng khác:

Chuyển gen chịu lạnh

Một loại gen chống giá rét lấy từ cá nước lạnh đã được cấy vào một số cây trồng

=> cây trồng có thể chịu được nhiệt độ thấp

Bông chuyển gen chống lạnh

Chuyển gen chịu hạn/chịu mặn

Tạo ra cây trồng có khả năng chịu đựng thời kỳ hạn hán dài ngày hoặc lượng muối cao trong đất và nước ngầm sẽ giúp ích rất nhiều cho nông dân

Lúa biến đổi gen trồng trên đất mặn cho năng suất cao

2 Một số thành tựu

2 Một số thành tựu

a Các cây trồng quan trọng đã được phát triển

Giống lúa vàng giàu vitamin A

“ Siêu cà chua” đẩy lùi ung thư Cây thuốc lá có thể làm nhiên liệu

Ở Việt Nam hiện có 3 cây biến đổi gen đang tồn tại là lúa, ngô, bông Từ năm 2002 đã chuyển hướng sang cải tạo những cây lấy củ (khoai, sắn) Đi xa hơn có các công trình như cây bông kháng sâu, cây đu đủ kháng bệnh đốm vòng, chuyển gen tổng hợp carotene vào cây lúa hay công trình lúa kháng sâu.

b Các loại cây trồng đang được phát triển

3 Tình hình sản xuất thực vật chuyển gen trên thế giới

Từ năm 1996 đến năm 2003, diện tích cây trồng biến đổi gen tăng 40 lần ( từ 1,7 triệu

ha/1996 lên 67,7 triệu ha/2003) Trong đó, diện tích các nước đang phát triển chiếm 1/3 diện tích trồng cây biến đổi gen của thế giới

Năm 2003, hai cây trồng giữ vị trí hàng đầu là đậu tương kháng thuốc diệt cỏ ( 41,4 triệu ha)

và ngô Bt với diện tích 9,1 triệu ha