Phân tích cây chuyển gen

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được thử nghiệm tuy nhiên hiện nay 2 phương pháp được sử dụng rộng rãihơn cả là chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học hiện đại sử dụng kỹ thuật di truyền đã đóng góp đáng

kể trong việc cải tạo năng suất chất lượng cây trồng Hiện nay có rất nhiều câytrồng là sản phẩm của công nghệ sinh học được thương mại trên thế giới đãkhẳng định tiềm năng và khả năng phát triển của lĩnh vực này Trong các kỹthuật ứng dụng công nghệ sinh học vào nâng cao năng suất, chất lượng giốngcây không thể không kể đến kỹ thuật chuyển gen thực vật

Ngày nay kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng rộng rãi trong việcchuyển các gen hữu ích vào cây trồng tạo ra các cây trồng có nhiều ưu điểmvượt trội hơn hẳn so với loài ban đầu Trong khoảng thời gian từ năm 1996 đếnnăm 2005, tỷ lệ diện tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển đềutăng hàng năm, từ 1,7 triệu hecta (1996) lên 90 triệu hecta (2005) chiếm hơn 1/3diện tích đất trồng cây nông nghiệp Điều này cho thấy ngày càng có nhiều nôngdân tại các nước phát triển và đang phát triển chấp nhận và trồng cây chuyểngen Số nước trồng cây biến đổi gen đã tăng gấp 3 lần trong vòng 9 năm (từ 6nước năm 1996 đến 21 nước năm 2005) (James, 2007)

Kỹ thuật chuyển gen thực vật cho phép đưa một hoặc nhiều gen có đặcđiểm ưu việt từ những loài có thể rất khác nhau về di truyền vào bộ gen của câynhận trong một thời gian ngắn Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật

đã được thử nghiệm tuy nhiên hiện nay 2 phương pháp được sử dụng rộng rãihơn cả là chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefacien Chuyển gen thông qua vi khuẩn có ưu điểm

dễ tiến hành, khả năng chuyển nạp cao và tiết kiệm chi phí vì vậy nó được tiếnhành ở hầu khắp các phòng thí nghiệm Có nhiều quy trình chuyển gen đã đượcxây dựng cho rất nhiều các loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoaitây, mía, sắn… Một quy trình chuyển gen thực vật bao gồm các bước chính sau:(1) Phân lập gen mong muốn từ một sinh vật bất kỳ; (2) Tạo dòng và thiết kếvector chuyển gen mang đoạn gen mong muốn đó; (3) Biến nạp vector chuyểngen vào thực vật nhận và (4) Chọn lọc, phân tích biểu hiện của gen chuyển

Chuyển gen được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải đượcdung hợp vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bàochủ; (iii) gen chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau, trong mỗi thế hệ

sản phẩm của gen chuyển cũng phải được biểu hiện; và (iv) sản phẩm biểu hiệncủa gen chuyển phải thể hiện được chức năng sinh học Chính vì vậy quá trìnhchọn lọc, phân tích cây chuyển gen trong mỗi thế hệ có thể được thực hiện theo

ba nội dung sau:

(1) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ (cây mang genchuyển);

(2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểuhiện là mRNA và protein;

(3) Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển

Mỗi nội dung có các phương pháp, kỹ thuật phân tích tương ứng, phù hợp

và trong thực tiễn có thể tiến hành các phương pháp trong phòng thí nghiệm, nhàlưới hoặc đồng ruộng Qua các thế hệ, cần phân tích, đánh giá và xác định đặcđiểm di truyền của gen chuyển (sự di truyền, sự phân ly), phân tích đặc tính ditruyền của cây chuyển gen

Hình 1 Mô tả các bước tiến hành và phương pháp phân tích cây chuyển gen

1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN Ở MỨC ĐỘ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Việc xác định nguyên liệu thu được từ hệ thống tái sinh sau biến nạp gen

có phải là cây chuyển gen hay không là rất cần thiết và phải tiến hành đầu tiên.Trước hết, chọn lọc các mô, cây chuyển gen bằng các chỉ thị chọn lọc dựa vàocác gen chỉ thị phải được tiến hành Sau đó, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồiđặc hiệu của gen chuyển để xác định sự có mặt của gen trong tế bào cây chuyểngen Muốn xác định số copy được đưa vào genome cây tái sinh phải thực hiệnphép lai phân tử Southern mà mẫu dò là đoạn gen chuyển được đánh dấu huỳnhquang còn DNA nhân cao phân tử được tách từ cây chuyển gen Xác định genchuyển có được phiên mã sang mRNA hay không có thể thực hiện bằng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen chuyển và khuôn là cDNA từ RNA tổng sốcủa cây cần kiểm tra hoặc lai Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánhdấu huỳnh quang và RNA toàn phần của mô cây chuyển gen Và bước cuối cùng

là xác định gen chuyển có biểu hiện và tạo sản phẩm cuối cùng của nó bằng kỹthuật lai Western giữa protein của cây chuyển gen và kháng thể đặc hiệu vớiprotein đó được tinh sạch từ nguồn khác

1.1 ĐÁNH GIÁ CÂY CHUYỂN GEN BẰNG TÍNH KHÁNG CHẤT CHỌNLỌC

Hầu hết các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống gen chọn lọckèm theo gen đích cho phép sàng lọc các mô, cây mang gen ở giai đoạn sớmbằng biểu hiện kháng của gen đó với các chất chọn lọc Các gen chọn lọc có thể

là các gen kháng kháng sinh, kháng thuốc diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc genchuyển hóa các cơ chất chọn lọc

Thực chất phân tích tính kháng của chất chọn lọc (kháng sinh, chất diệtcỏ) là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng với chất chọn lọc thông quahoạt động của gen chuyển Chất chọn lọc có thể là kháng sinh như kanamycine

khi dùng gen nptII hay hygromycine khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi

biến nạp từ trạng thái đơn bào đến mô sẹo, chồi tái sinh cây hoàn chỉnh hay câynon gieo từ hạt Cách thức tiến hành đơn giản: chỉ bổ sung chất theo nồng độnhất định vào môi trường nuôi cấy rồi quan sát ảnh hưởng của chất chọn lọc lên

mô hoặc cây Biểu hiện thường thấy đối với mô không mang gen là mất khả

năng tạo lục lạp rồi sau đó chuyển nâu đen và chết (hình 2.1(B)) Còn chồi sẽkhông thể tạo rễ nếu không mang gen chuyển mặc dù được chuyển sang môitrường có nồng độ chất kích thích ra rễ cao vì bộ rễ rất nhạy cảm với chất chọnlọc.

Hình 1.1 Mô sẹo của cây cao lương chuyển gen (A) và đối chứng (B) trên môi

trường có chất chọn lọc (Tuong Van Nguyen, 2008)

Phương pháp thử tính kháng đối với các chất chọn lọc còn được phát triểnthành phương pháp tạo vết cháy trên lá Chất chọn lọc được sử dụng với nồng

độ cao hơn khoảng 2 – 5 lần so với thử in vitro và thường bổ sung thêm Twin 20

để tăng khả năng bám dính bề mặt sau đó dùng bút lông quét lên lá của cây cầnthử, cũng có thể dùng một sợi chỉ bông kích thước lớn hơn chỉ bình thường,thấm dịch thuốc rồi vắt sợi chỉ qua nhiều lá của nhiều cây Sau 3 – 5 ngày có thểthấy nơi bôi thuốc hoặc sợi chỉ vắt qua trên các cây không mang gen khángthuốc hình thành các vết trắng hoặc nâu trên mặt lá do bị mất diệp lục Để đảmbảo chính xác phương pháp này thường được tiến hành lặp lại 2 – 3 lần

Hình 1.2 Thử tính kháng kanamycin của bông chuyển gen bằng tạo vết cháy trên

lá (Lê Trần Bình, 2008) (a) bông chuyển gen; (b) đối chứng

Ngoài ra, Việc đưa một gen chỉ thị mã hóa cho một enzyme trong vectorchuyển gen cho phép dễ dàng nhận biết mẫu mang gen khi nhuộm bằng chất

màu Hệ thống GUS (gus, gusA và uidA) mã hóa cho protein βglucuronidase một phân tử homotetramer lần đầu tiên được phân lập từ E coli (Jefferson et al.,

-1986) β-glucuronidase

thường được sử dụng làm chỉ

thị chọn lọc để nhận biết cây

chuyển gen bởi ưu điểm dễ

nhận biết thông qua nhuộm

màu, phản ứng có độ nhạy và

ổn định cao đồng thời dễ tiến

hành định lượng Ngày nay,

việc sử dụng GUS trong

chuyển gen thực vật ngày

càng được tiến hành rộng rãi

Nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một giống

cây mới (Đỗ Tiến Phát và cs, 2008; Lopez et al., 2004)

Ngay sau khi GUS được đưa vào thử nghiệm trong nhận biết cây chuyểngen, nó nhanh chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho nhiều đối tượng

chuyển gen thực vật (Jefferson et al., 1987) vì ngoài tính nhạy và bền của

enzyme nó còn dễ dàng thực hiện bằng các kỹ thuật khối phổ, so màu và phântích tế bào học Hơn nữa hầu như không có hoặc rất ít hoạt động của GUS được

ghi nhận ở hầu hết mô thực vật bậc cao (Jefferson et al., 1987, Hu et al., 1990; Kosugi et al., 1990; Muhich, 1998)

Trong thực vật GUS hoạt động như một gen hỗn hợp nhờ một promoter

khởi động quá trình sao mã của trình tự uidA và điều chỉnh biểu hiện gen Sự

biểu hiện của gen sẽ được nhận diện bởi một chất có tên là indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) hoặc 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG) trong thời gian ngắn Một vài hạn chế đã được ghi nhận trong và sau khi

5-bromo-4-chloro-3-xác định hoạt động của GUS trong mô chuyển gen đó là: hoạt tính nền (Hu et

al., 1990; Thomasset et al., 1996), thường do sự khuếch tán các sản phẩm phản

ứng hoặc hoạt động của chất nội sinh; Tính tự phát sáng (Thomasset et al., 1996), dập tắt hoặc im lặng (Serres et al., 1997) hoặc sự nhiễm khuẩn

Hình 1.3 Biểu hiện gen GUS trong mô bông

chuyển gen (A) và đối chứng không chuyển gen (B) (Đỗ Tiến phát và cs., 2008)

Gần đây, một hệ thống chọn lọc khác được xem là “tích cực” có thể thaythế hệ thống chọn lọc dựa trên kháng sinh, chất diệt cỏ… bởi chất được sử dụngtrong chọn lọc bản thân không gây độc cho thực vật và hoàn toàn không có hoạtđộng sinh học Trong hệ thống chọn lọc tích cực, gen mã hóa một hoặc một sốenzyme sẽ được đưa vào vector chuyển gen và cho phép các thực vật chuyểngen sử dụng các hợp chất chọn lọc trong môi trường để sinh trưởng, những tếbào không mang gen không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất chậm trên môitrường có chất chọn lọc Một ví dụ về hệ thống chọn lọc tích cực được cung cấpbởi Joersbo và Okkels Nghiên cứu này đã thử nghiệm với cây thuốc lá chuyển

gen mã hóa β-glucuronidase bằng biến nạp gen vào lá thông qua Agrobacterim

tumefaciens Chất cytokinin glucuronide được cung cấp dưới dạng một cơ chất

và bổ sung vào môi trường nuôi cấy Chỉ những tế bào biểu hiện GUS mới cóthể chuyển hóa cytokinin glucuronide, những tế bào này có thể tăng sinh và biệthóa thành rễ trong khi những tế bào không có hoạt động của GUS không có hiệntượng này (Joersbo & Okkels, 1996) Rất nhanh sau đó, hệ thống chọn lọc tíchcực trong chuyển gen được phát triển không chỉ sử dụng cơ chất liên quan đếnhormone thực vật mà cả những chất như nguồn carbonhydrate và nitơ, nhữngchất cần thiết trong nuôi cấy mô

Hệ thống chọn lọc sử dụng carbonhydrate là một trong những hệ thốngchọn lọc tích cực phổ biến và dễ dàng nhất bởi vì thực vật sinh trưởng trên môitrường nuôi cấy đòi hỏi sự có mặt của nguồn carbon Hơn nữa, hầu hết nguồncarbon thường dễ kiếm, rẻ và có thể thu nhận từ nhiều nguồn như sucrose,glucose và maltose Nếu đưa một nguồn carbon thay thế cho carbon thực vật vẫn

sử dụng vào trong môi trường, trong phần lớn các trường hợp nghiên cứu, tế bàothực vật sẽ không có khả năng phát triển và chết do các hợp chất sẽ được chuyểnhóa và tạo sản phẩm trung gian làm thực vật nuôi cấy không thể sử dụng để pháttriển Ví dụ khi manose được dùng làm chất chọn lọc nó sẽ nhanh chóng đượcchuyển hóa thành manose-6-phosphate (M6P), một chất thực vật không thể hấpthụ chuyển hóa, bởi hoạt động của hexokinase Trong trường hợp này, nếu thực

vật có mang gen manA của E.coli mã hóa cho phosphomanose isomerase (PMI)

thì PMI sẽ chuyển hóa M6P thành fructose-6-phosphate Hệ thống chọn lọcPMI đã được triển khai hiệu quả khi tiến hành chuyển gen vào củ cải đường,

ngô, lúa, lúa mì, Arabidopsis (Joersbo et al., 1998; Negrotto et al., 2000; Wang

et al., 2000; Wringht et al., 2001; Lucca & Potrykus, 2001) và rất nhiều thực vật

hai lá mầm cũng như một lá mầm khác Hiện nay, cả hai hệ thống chọn lọc tíchcực và không tích cực đều được sử dụng trong chuyển gen thực vật (Brasileiro

& Aragao, 2001)

Phương pháp chọn lọc, phân tích cây chuyển gen bằng các chất chọn lọcmặc dù dễ thực hiện, chi phí thấp tuy nhiên đây chỉ là phương pháp sử dụng banđầu để loại bớt những cây không mang gen trong quần thể cây tái sinh sau nuôicấy vì phương pháp này không cho biết các gen cần chuyển đã được đưa vào câyhay chưa, các gen đưa vào có hoạt động không… Chính vì vậy cần phải cónhững phân tích sâu hơn ở mức độ phân tử

1.2 PHÂN TÍCH CÂY CHUYỂN GEN BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ

Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tạitrong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dàidưới dạng một thể plasmid độc lập tự nhân và (3) ổn định như một đoạn DNAcủa genome trong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay khôngtương hợp Đây là trạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bềnvững của thể biến nạp, nhưng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp.Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiệntượng nhân không tương hợp đối với gen lạ khi hòa đồng vào DNA nhân do vịtrí đoạn gen lạ được ghép nối ảnh hưởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủgần đó Chính vì thế, các phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định sự cómặt của gen và biểu hiện của gen đó trong tế bào là bước làm rất cần thiết

1.2.1 Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm

1983 Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặchiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNAquan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biếntính 2 mạch DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi Kỹ thuật PCR đơngiản dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR.Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần

sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xácđịnh làm khuôn là có thể tiến hành PCR Sử dụng plasmid mang gen chuyển làmđối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến vàbằng với đối chứng thì mẫu phân tíc được coi là dương tính Tuy nhiên, PCRdương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để

giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A tumefaciens

mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào củamẫu phân tích Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi làdương tính giả Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức

đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ (2) Gen chuyển tồn tại tự

do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính) (3) Gen chuyểnkhông hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năngsinh học Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR mới chỉ có giá trị địnhhướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen

Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích pháthiện các mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (genetic modify origanism-GMO) Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ

thuật multiplex PCR (MPCR) (Matsuoka et al., 2001) Với việc sử dụng đồng

thời nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter, terminator, gen chọnlọc, gen đích…) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiềutrình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó Thông thường các cặp mồi được sửdụng trong multiplex PCR là mồi P35S, TNOS, NPT-II, GUS, EPSPS Nếu kếtquả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác định rất có thể đã đượcchuyển gen

1.2.2.Phương pháp xác định số copy trong cây chuyển gen

Lai Southern để xác định số copy trong cây chuyển gen là phương pháp tin cậy

và thông dụng nhất Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển tronggenome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu

dò nó còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây Mẫu dò chính là mộtđoạn của gen chuyển có kích thước từ 100 – 300 bp được đánh dấu phóng xạhay huỳnh quang Các bước chính trong kỹ thuật Southern bao gồm: (1) táchchiết DNA tổng số của mẫu cần phân tích; (2) Xử lý DNA tổng số với 1 – 2enzyme giới hạn mà điểm cắt không nằm trên gen; (3) Điện di trên gel agarose;(4) chuyển lên màng nitrosocellulose hay còn gọi là blotting; (5) Tổng hợp sợiDNA mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang bằng PCR với mồi ngẫunhiên; (6) Lai mẫu dò với màng DNA và (7) Hiển thị trên phim X quang vàphân tích kết quả

Hình 1.4 Mô tả các bước trong kỹ thuật lai

southern

Hình 1.5 Kết quả lai Southern

hai dòng cao lương chuyển gen SB1 và SB4 (Tuong Van Nguyen, 2008)

Hình 1.5 hiển thị kết quả lai southern hai dòng cao lương chuyển gen SB1

và SB4 (Tuong Van Nguyen, 2008) cho thấy cây dòng SB4 xuất hiện một vạchcòn SB1 xuất hiện nhiều vạch sản phầm lai điều đó có nghĩa dòng SB4 có mộtbản sao gen chuyển trong genome, đây là kết quả mong muốn trong chuyển genvào thực vật

Gần đây, một kỹ thuật thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern trong

việc phát hiện số copy trong cây chuyển gen là Quantitave real-time PCR

(Q-PCR) Q-PCR có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu cần phân tích, ngoài ra còn

dễ thực hiện, tiết kiệm nguyên liệu, chi phí và công sức (James et al., 2002; Bubner et al., 2004) Real-time PCR là khuếch đại DNA diễn ra theo từng chu

kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: (1) Khuếchđại DNA bằng PCR và (2) Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạnDNA được tạo thành Nguyên lý chủ yếu của real-time PCR là dựa trên cơ sởphát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang Hàm lượng sản phẩm PCRbắt đầu được tăng cao lên từ chu kỳ ngưỡng tương quan chặt chẽ với hàm lượngDNA khuôn ban đầu Có nhiều chất huỳnh quang đã được tìm ra và sử dụngrộng rãi Một trong số chất được sử dụng rộng rãi nhất là TaqMan TaqMan real-time PCR là một kỹ thuật trong đó sự tích lũy sản phẩm PCR đã được kiểm trabởi sự có mặt của phát sáng huỳnh quang trong mỗi phản ứng Tức là, trong thínghiệm TaqMan, một mẫu dò đánh dấu 2 đầu (TaqMan) được thiết kế để lai vớiđoạn trình tự giữa hai mồi Mẫu dò này được tổng hợp với đầu 5’ phát quang và

đầu 3’ có hoạt tính dập tắt huỳnh quang Khi các mẫu dò còn nguyên vẹn thìchất phát ra từ những chất phát huỳnh quang sẽ bị dập tắt bởi đầu dập tắt và hiệuứng huỳnh quang sẽ thấp không nhận biết được Trong mỗi chu kỳ phản ứngPCR, các polymerase kéo dài từ một mồi bắt gặp đoạn lai và phân cắt mẫu dò từ

5’-3’ nhờ hoạt động exonuclease của Taq polymerase Mẫu dò giải phóng ra

chất huỳnh quang và phát quang Kết quả là sự phát quang có thể định lượng saumỗi phản ứng có liên quan đến lượng sản phẩm PCR được tích lũy

Hình 1.6 Mô tả phương pháp TaqMan định lượng sản phẩm PCR

Để sử dụng real-time PCR trong xác định số copy của cây chuyển genngười ta dựa vào mối tương quan giữa giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) và số copytrong DNA mẫu ban đầu Có nhiều phương pháp khác nhau đã được thửnghiệm, có thể dựa vào Ct đo được với đường chuẩn thu được từ các nồng độpha loãng khác nhau của một plasmid mang trình tự gen chuyển mà đã biết trọnglượng phân tử và nồng độ DNA chính xác từ đó tính tương đối số copy của mẫucần kiểm tra Hoặc một phương pháp tương đối hiệu quả trong việc xác định sốcopy bằng real-time PCR là phương pháp dựa vào giá trị Ct tương đối (2-ΔΔCt)

(Ingham et al., 2001; Bubner et al., 2004) Phương pháp này dựa vào ΔCt là độ

chênh lệch giữa Ct của cây chuyển gen (Ctt) và Ct của mẫu chuẩn là mẫu manggen nội sinh mà đã biết chắc chỉ có một copy (Cte) Trong cùng một phản ứngvới hiệu suất như nhau bằng cách làm chuẩn nồng độ DNA ban đầu đưa vàophản ứng, tất cả các mẫu có cùng giá trị ΔCt với mẫu chuẩn sẽ chứa một bản saocủa gen chuyển

1.2.3.Phân tích biểu hiện gen

Nghiên cứu biểu hiện của gen chuyển là rất cần thiết vì đây chính là mụcđích của chuyển gen, nếu gen được đưa vào genome mà không được biểu hiệnthì coi như không có giá trị Biểu hiện gen trong sinh học phân tử là quá trình