tách dòng gen từ DNA

• Enzym giới hạn cắt đầu bằng không tự nối các đoạn ADN lại với nhau sd enzym nối ligase • Enzym giới hạn cắt đầu sole tạo đầu dính.. B-Các loại enzym khácDNA polymerase Nối các nu với

Trường hợp muốn tạo dòng

tổng hợp enzyme thì mảnh DNA định cài phải mã hóa cho gen

cấu trúc của một enzyme nào

đó.

II-Nguyên liệu1.1- DNA lạ cần tách dòng

1.2- Enzym

1.3- Vector chuyển gen

1.4- Hệ thống tế bào chủ

1- DNA cần tách dòng

• Là đoạn DNA lạ, cần nghiên

cứu

1- Enzym

• 5 nhóm enzym:

1 Các enzym làm đứt gãy liên kết photphodieste (enzym giới

hạn, enzym Mungbean nuclease)

2 Các enzym nối khung phân tử DNA(E coli ligase, T4 DNA

ligase, T4 RNA ligase)

3 Các enzym bổ sung hoặc loại nhóm phosphate

4 Các enzym tổng hợp mối liên kết phosphodieste mới trong

phân tử DNA (DNA polymerase, Reverse transcriptase)

5 Các enzyme tham gia bảo vệ, phân giải, xoắn và giãn xoắn

DNA (methylase)

A-Enzym cắt giới hạn

(RE)

• Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận.

• VT: cắt DNA ở vị trí đặc trưng

• RE cắt liên kết phosphodieste làm cho phân

tử ADN bị đứt thành nhiều đoạn nhỏ

• ADN của ký chủ không bị cắt bởi RE nhờ các

vị trí cắt đã được methyl hóa (enzyme methylase gắn nhóm –CH3 vào base A hoặc

C tại vị trí cắt)

• Có hai kiểu cắt của enzym giới hạn là kiểu cắt tạo đầu bằng

(blunt ends) và đầu sole (đầu dính - cobesive ends)

• Enzym giới hạn cắt đầu bằng không tự nối các đoạn ADN lại với nhau( sd enzym nối ligase)

• Enzym giới hạn cắt đầu sole tạo đầu dính Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo

nguyên tắc bổ sung

B-Các loại enzym khác

DNA polymerase Nối các nu với nhau theo NTBS ->

mạch DNAEnzym phiên mã ngược TH mạch DNA bổ sung với mach

khuôn RNA theo chiều 5’-3’

Enzym nối ligase Nối các đoạn acid nucleic với nhau

bằng lk phosphodiesteEnzym methylase Thay đổi tính đặc hiệu của một số

enzym giới hạn

2- Vector tách dòng

• Vector là một phân tử DNA thường có

dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong

đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và tự sao chép.

BAC (thiết kế từ một phần DNA E.colivà các plasmid) 100-300 kb

TAC (thiết kế từ một phần đoạn vir gen của Ti plasmid) 100-300 kb

BiBac (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của

PAC (bộ gen của phage P1+plasmid) 100-300 kb

YAC (thiết kế từ một phần DNA bộ gen của nấm men) 2000

2.1- Plasmid

- Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb), dạng

vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, có ở vi khuẩn.

• Ưu điểm

 Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ

 Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp

 Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh

• Nhược điểm

 Đôi khi hiệu suất biến nạp vào TBVC thấp

 Không hiệu quả khi biến nạp ở Eukaryote

 Không tách dòng được các phân đoạn DNA có

kích thước lớn (>10kb)

Thực khuẩn thể (Phage)

• Phage là thuật ngữ chỉ

các loại virut kí sinh trên

vi khuẩn.

• Có khả năng mang gen

từ tế bào vi khuẩn cho

sang tế bào chủ nhận

• Ưu điểm:

 Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh Có

thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.

 Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.

 Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở nhiệt độ

lạnh (vd 4 o C).

• Nhược điểm:

 Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn.

 Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế

bào thấp hơn số bản sao của plasmid.

Chèn anh nay vao slide

tren

NST nhân tạo của nấm men

1.4- Hệ thống TB vật chủ

• Mục đích: tạo DNA tái tổ hợp

• Có thể sử dụng cả TB nhân sơ

và nhân chuẩn làm TBVC

• Yc: Dễ nuôi cấy để giữ và nhân

giống, chấp nhận được nhiều

loại vector

III- Quy trình

Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp

cDNA từ mRNA

2- Chọn vector

• Chọn vector dựa vào kích thước và bản chất đoạn ADN

• Yêu cầu của vector tách dòng:

 Kích thước tương đối nhỏ so với NST của TB chủ

 Có thể nhân đôi độc lập trong TB chủ

 Có vùng nhận biết enzym giới hạn

 Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu

 Trình tự nu đã xác định

 Phải thích hợp với tế bào vật chủ

 Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai

(polycloning site)

3.Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ

hợp)

Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách

ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung

Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự

có mặt của enzyme DNA ligase của E

Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân

tử lai

Quy trình tạo vector tái tổ hợp

• B1: chuẩn bị nguyên liệu, gen tách

dòng tinh sạch được nhân lên bằng PCR

• B2: Nối gen cần tách dòng với

vector bằng Pư nối gen với các thành phần Pư thích hợp.

• B3: Hỗn hợp các TP phản ứng

được ủ qua đêm ở 16oC -> tiến hành điện di với thang DNA chuẩn kiểm tra KQ tạo vector TTH ->giữ

ở nhiệt độ lạnh sâu -80 đến -85oC

4 Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ

Mục đích : sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành 1 số lượng lớn bản sao.

• Có 2 phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào TB chủ:

- Biến nạp

- Tải nạp

Các phương pháp chuyển DNA

1 Biến nạp

.Là hiện tượng chuyển vật chất di truyền

trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận

.Không cần sự tiếp xúc giữa 2 tế bào hoặc

các nhân tố trung gian ( phage hoặc virut )

.Được thực hiện với vector chuyển gen là

plasmit

A- Biến nạp

• Biến nạp là quá trình ở đó 1 cơ thể chủ có thể tiếp nhận 1 phân

tử DNA ngoại lai từ môi trường bên ngoài

• Có nhiều phương pháp biến nạp: sử dụng súng bắn gen, biến nạp

TB trần, vi tiêm, xung điện (nấm men), sốc nhiệt (vi khuẩn),…

• Vi khuẩn có khả năng biến nạp tự nhiên gọi là các vi khuẩn khả biến di truyền (E.coli có thể khả biến khi được xử lý với ion Ca2+)

• Sau khi biến nạp , thường chỉ có 1 phần nhỏ tế bào chủ có vector tái tổ hợp

B- Tải nạp

 là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận

 phải có nhân tố trung gian là virus.

 được thực hiện với vector chuyển gen có

nguồn gốc là vius như phage, comid.thực

khuẩn thể )

5 Phát hiện dòng cần tìm

Kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn.

Các dòng vi khuẩn mọc lên theo 3 khả năng

 tế bào vi khuẩn không nhận plasmit tái tổ hợp

Tế bào nhận plasmit nhưng không có gen lạ

 tế bào vi khuẩn nhận được plasmit tái tổ hợp -> việc lựa chọn các chủng như ý muốn là không đơn giản

Phương pháp lai axit nucleic

Phương pháp sử dụng kháng thể

Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn

Phương pháp phát hiện do thay đổi kiếu hình

Các phương pháp xác định dòng cần tìm

Phương pháp lai axit nucleic

• Khái niệm đầu dò: các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu , có khả năng nhận biết 1 chuỗi

DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa

• Đặc điểm: là 1 đoạn axit nucleic (DNA , RNA) sợi

đơn Đầu dò phải bổ sung các bazo nito, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ

• Các loại đầu dò: cDNA, mRNA, oligonucleotide

Phương pháp sử dụng kháng thể

Nguyên tắc

• dựa vào phản ứng đặc trưng của 1 số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu , phản ứng kết tủa

Cách tiến hành

• Chọn kháng thể đặc trưng cho protein

• Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng

• ủ protein với kháng thể đặc trưng

• Tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể

Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì

xen đoạn

• Nguyên tắc

Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh

Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình

Nguyên tắc

• Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng khuẩn lạc đó chứa gen lạ

Cách tiến hành

• Chuẩn bị 2 mẫu thử nghiệm mà plasmit tạo dòng có chứa gen lacZ , 1 mẫu để

so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ

• Nuôi cấy cả 2 mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal 3indolyl D- galactopynoside) chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzim β-

(5-brom-4chloro-galactosidase tạo ra galactose và X ( dẫn xuất indol) dẫn xuất này cho màu xanh đậm

• Qua quan sát t thấy , plasmit không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh, còn plasmit thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng -> chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng

IV-Mục đích của sự tách dòng

• Thiết lập ngân hàng bộ gen.

• Thiết lập ngân hàng cDNA

• Sản xuất protein, enzyme

• Sản xuất vaccine.

• Sản xuất kháng sinh

nghiên cứu.

- Ý nghĩa : Ngân hàng hệ gen có ý nghĩa quan trọng trong việc lập bản đồ di truyền, giải mã trình tự hệ gen.

2-Ngân hàng cDNA ( cDNA library)

-Là tập hợp các bản sao cua cDNA từ mDNA

-Mang tính tế bào cao

-Mục đích:

hiện của một gen xác định cùng những vấn đề liên quan điều hòa gen.

giữa các gen trong một quá trình sống