Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hóa protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Baccillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NGUYỄN VĂN NAM TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG Baccill

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

NGUYỄN VĂN NAM

TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN

DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG

Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT

THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

NGUYỄN VĂN NAM

TÁCH DÒNG GEN cry4A, cry4B MÃ HOÁ PROTEIN

DIỆT CÔN TRÙNG BỘ HAI CÁNH TỪ CÁC CHỦNG

Baccillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT

THUỘC THÀNH PHỐ NHA TRANG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

THÁI NGUYÊN - 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong công trình nghiên cứu khác

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012

Nguyễn Văn Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều

sự giúp đỡ, hỗ trợ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả những tình cảm quý báu đó

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Ngô Đình Bính, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN Đặng Văn Tiến cùng toàn thể cán

bộ phòng Di truyền Vi sinh, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời thời gian dài thực tập

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Vũ Thanh Thanh, các giảng viên cùng các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường và hoàn thành tốt luận văn của mình

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng

hộ tôi trong suốt thời gian qua!

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 10 năm 2012

Nguyễn Văn Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về Bacillus thuringiensis 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis 3

1.1.2 Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis 4

1.1.3 Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus 6

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7

1.1.5 Protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 7

1.1.6 Đặc điểm phân loại của Bacillus thuringiensis 8

1.1.7 Đặc điểm phân loại loài phụ Bti 8

1.1.8 Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8

1.2 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bti 15

1.2.1 Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var israelensis 16

1.2.2 Cấu trúc phân tử nhân độc tố của Bti 17

1.2.3 Hoạt tính diệt côn trùng của Bti 18

1.2.4 Tác động của Bti đến các sinh vật khác 19

1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng trong nước và trên thế giới 19

1.3.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới 19

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

1.4 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm 21

1.4.1 Phân loại khoa học của muỗi 21

1.4.2 Vòng đời của muỗi 23

1.4.3 Khả năng gây bệnh của muỗi 24

1.4.4 Sơ lược về côn trùng thử nghiệm: 24

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Sinh phẩm 29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.1.2 Hoá chất và môi trường 29

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis 32

2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ bào tử 33

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 34

2.2.4 Kỹ thuật định typ huyết thanh 35

2.2.5 Khuyếch đại gen mã hóa độc tố bằng phản ứng PCR 35

2.2.6 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 37

2.2.7 Phương pháp điện di trên gel agarose 38

2.2.8 Phương pháp thôi gel 39

2.2.9 Phương pháp tách dòng gen cry4A, cry4B 40

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu lá 43

3.2 Sự đa dạng tinh thể của các chủng phân lập 44

3.3 Phân loại dưới loài của các chủng Bacillus thuringiensis 45

3.4 Thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của các chủng Bacillus thuringiensis 46

3.4.1 Xác định nồng độ bào tử 46

3.4.2 Thử nghiệm hoạt tính 46

3.5 Phát hiện gen mã hóa protein diệt ấu trùng muỗi của chủng Bacillus thuringiensis phân lập 49

3.6 Tách dòng, đọc trình tự gen cry4A và cry4B 52

3.6.1 Tách dòng gen cry4A và gen cry4B 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chƣ̃ viết tắt Chƣ̃ viết đầy đủ

1 Bp Base pair – Cặp Base

3 dH2O Deion water – Nước khử ion

4 DNA Deoxyribonucleotide acid – Axit Nucleic

9 OD Optical density – mật độ quang học

10 PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi trùng

hợp

11 SDS Sodium dodecyl sulphate

12 Sol Solution – Dung dịch tách triết DNA plasmid

14 X-gal 5-Bromo-4 Cloro-3 indolyl β-D galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus 6

Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng 11 Bảng 1.2 Đặc điểm của một số protein độc tố Cry 13 Bảng 3.1 Thống kê số lượng chủng Bt phân lập được và hình dạng tinh thể

của chủng phân lập 44

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus của

các chủng phân lập sau các khoảng thời gian khác nhau, ở các

nồng độ khác nhau 46

Bảng 3.3 Kết quả khuếch đại gen độc tố thuộc nhóm cry4 của các chủng

phân lập 50 Bảng 3.5 So sánh trình tự ĐNT5.4-4B1 với các trình tự đã công bố trên

ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm Blast 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 1.6 Muỗi Anopheles trưởng thành(A) và vòng đời của muỗi Anopheles(B) 25 Hình 1.7 Ấu trùng(A) và muỗi Aedes trưởng thành (B) 26 Hình 1.8 Muỗi Culex trưởng thành 27 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng Bacillus thuringiensis phát triển

trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy 43 Hình 3.2 Hình thái bào tử và tinh thể của chủng ĐNT8.1 chụp dưới kính

hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 5000 lần 44

Hình 3.3 Phản ứng ngưng kết của Bacillus thuringiensis var israelensis

với kháng huyết thanh 45

Hình 3.4 Hình ảnh thử hoạt tính diệt ấu trùng muỗi Culex quinquefasciatus

của các chủng phân lập 49 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho

gen Cry4A trên gel agarose1% 51 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho

gen cry4B trên gel agarose1% 51

Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc xanh – trắng trên môi trường LBA 53 Hình 3.8 Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng

khuẩn lạc biến nạp gen cry4A trên gel agarose 0,8 % 54

Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt DNA plasmid trên gel agarose 0,8 % 55

Hình 3.10 Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen cry4A

và cry4B từ các dòng plasmid tái tổ hợp: 56

Hình 3.11 Kết quả so sánh trình tự gen cry4A 59 Hình 3.12 Kết quả so sánh trình tự gen cry4B 62

MỞ ĐẦU

Muỗi là l oài côn trùng truyền nhiều bệnh rất nguy hiểm Các bệnh sốt rét, sốt xuất huyết , viêm não Nhật Bản , sùi chân voi , giun chỉ do muỗi truyền thực sự đã và đang đe dọa sinh mạng của hàng triệu người Hằng năm

có khoảng 270 triệu người mắc bệnh sốt rét , làm chết hàng triệu người Hàng triệu mắc bệnh sốt xuất huyết và các bệnh khác Ở Việt Nam, theo số liệu của Tổng cục Thống kê, 9 tháng đầu năm 2012 cả nước có 51,3 nghìn trường hợp mắc bện h sốt xuất huyết , trong đó 42 ca tử vong , 16 nghìn trường hợ p mắc bệnh sốt rét , 554 trường hợp mắc bệnh viêm não Nhật Bản , trong đó 15 trường hợp tử vong (64)

Có rất nhiều biện pháp hoá học và sinh học được áp dụng để khắc phục tình trạng trên Tuy nhiên các biện pháp hoá học lại thường gây ra tính kháng thuốc trên côn trùng, cứ sau một khoảng gian rất ngắn thì thuốc hoá học lại không còn tác dụng đồng thời thuốc hoá học còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và góp phần làm mất cân bằng sinh thái Vì vậy, các biện pháp sinh học được khuyến khích sử dụng Một trong các vi sinh vật được quan

tâm và sử dụng nhiều nhất là vi khuẩn Bacillus thuringiensis Sở dĩ như vậy là

do đặc tính sinh protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng gây hại như:

Côn trùng bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng Vi khuẩn Bacillus

thuringiensis được ứng dụng để diệt côn trùng gây hại theo phương pháp:

thuốc diệt trừ sinh học Bt

Việc nghiên cứu các hoạt tính diệt côn trùng của các chủng Bt phân lập

ở Việt Nam đặc biệt là hoạt tính diệt muỗi, ruồi là hết sức cần thiết nhằm tìm

ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ cho việc diệt ruồi, muỗi Protein tinh thể độc Cry4A, Cry4B là hai trong nhiều protein có hoạt tính chống lại côn trùng bộ hai cánh Xuất phát từ mục đích này chúng

tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá

protein diệt côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc thành phố Nha Trang”

Mục tiêu của đề tài

- Sàng lọc các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng

bộ hai cánh

- Tách dòng gen cry4A, cry4B của các chủng Bacillus thuringiensis

phân lập có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh

- Đọc trình tự gen, so sánh với trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế

Nhiệm vụ của đề tài:

- Phân lập các chủng Bccillus thuringiensis từ các mẫu đất thuộc thành

phố Nha Trang

- Sàng lọc các chủng Bt có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh

- Phát hiện gen cry4A, cry4B bằng phương pháp PCR

- Tách dòng gen cry4A, cry4B mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng bộ

hai cánh

- Đọc trình tự gen cry4A, cry4B và so sánh với trình tự trên ngân hàng

gen quốc tế

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về Bacillus thuringiensis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis

Trong hơn một trăm năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)

được coi là vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng

Lịch sử nghiên cứu ứng dụng của Bacillus thuringiensis được bắt

nguồn ngay từ những năm đầu tiên của thế kỉ 20 Nó được đánh dấu bằng những phát hiện đầu tiên của một nhà khoa học người Nhật Bản

có tên là Ishiwata khi ông này phát hiện ra một loài vi khuẩn có khả năng gây chết ở những con tằm vào năm 1901 Phát hiện thấy những con tằm chết trước khi loài vi khuẩn này phát triển, ông nhận định ban đầu những con tằm chết là do độc tố chứ không phải là nhiễm khuẩn và

đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus sotto, tên căn bệnh tằm dâu mà

ông đang nghiên cứu

Mười năm sau (1911), loài vi khuẩn này được nhà khoa học người Đức là E Berliner phân lập được từ xác ấu trùng bướm Địa Trung Hải,

Anagasta kuhniella và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn

đất, tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử này Đến tận năm 1915, vi

khuẩn này mới mang tên Bacillus thuringiensis do nó được phân lập tại

một nhà máy bột vùng Thuringen của Đức Về sau chủng này bị thất lạc

và được Mattes và cộng sự phân lập lại từ A kuhniella vào năm 1927

Chế phẩm Bt được sử dụng lần đầu tiên là vào năm 1930 để kiểm

soát loài côn trùng hại có tên là Angasta kuehnella, một loài sâu đục thân

ở Châu Âu Chế phẩm thương mại đầu tiên được tung ra thị trường vào năm 1938 để diệt loài côn trùng hại mùa màng ở Pháp[7]

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein 1956, Angus đã chứng minh được hoạt tính diệt sâu là do tinh thể độc tách ra từ tế bào và bào tử [16]

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân

loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp

huyết thanh [11]

Năm 1977, phát hiện ra dưới loài Bacillus thuringiensis var

israelensis tại Israel và người đầu tiên phân lập và nghiên cứu là

Goldberg và Margarit Loài này được kiểm nghiệm là có khả năng diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh [4]

Từ đó đến nay, việc phân lập, phân loại và nghiên cứu Bacillus

thuringiensis trên cả hai lĩnh vực (ứng dụng và cơ bản) không ngừng phát

triển và được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Ở Việt Nam, Bt đã được nghiên cứu và ứng dụng là thuốc trừ sâu đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm 1971 Năm 1973, Nguyễn Công Bình và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bt tại Viện Sinh Vật với môi trường đặc, giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền sẵn có như bã khô lạc, bột đậu tương… Trong mười năm trở lại đây thì việc nghiên cứu Bt đã được tiến hành ở nhiều nơi như Viện Công nghệ Sinh học, Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Công nghệ Sau thu hoạch… chủ yếu là phân lập, phân loại để tìm ra các chủng mới có phổ hoạt tính rộng cũng như nghiên cứu sinh học phân tử của chủng cũng đã được tiến hành [16]

1.1.2 Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis

Hình 1.1 Hình thái tế bào vi khuẩn

Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis thuộc chi

Bacillus Nhóm này gồm hơn 20

loài khác nhau, ngoài Bt còn có vi

khuẩn B subtilis, B cereus (vi

khuẩn gây bệnh tiêu chảy), vi

khuẩn B anthracis (vi khuẩn gây

bệnh than) Các vi khuẩn thuộc chi

Bacillus thường được coi là vi

khuẩn đất Chúng sống trong môi

trường đất, bề mặt thực vật, côn

trùng [31] Bacillus thuringiensis hình que (Hình 1.1), Gram dương, hô

hấp hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sinh bào tử, kích thước tế bào khoảng 0,8-1,4m x 2,5-10m Đặc điểm chung là bào tử hình oval, kích thước 0,5 - 1,2 x 1,5 - 2,6 m, quá trình hình thành bào tử không làm thay đổi hình dạng tế bào Một đặc điểm quan trọng là trong quá trình hình

thành bào tử hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis đều tổng hợp

protein tinh thể Protein tinh thể ở mỗi chủng khác nhau sẽ có hình dạng, kích thước và số lượng khác nhau, tuy nhiên chúng mang đặc điểm chung

là có khả năng gây độc đối với nhiều loài côn trùng Khi ở trong tế bào sinh dưỡng, tinh thể thường nằm kề với bào tử, khi tế bào tan tinh thể và

bào tử đều thoát ra ngoài Trong môi trường lỏng Bacillus thuringiensis

có khả năng chuyển động, khả năng này có được là nhờ các lông roi (flagellar) trên bề mặt tế bào có kích thước lớn hơn 0,9 µm [57]

B thuringiensis được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong

rất nhiều môi trường khác nhau Meadows phân chia ra 3 ổ sinh thái phổ

biến của B thuringiensis trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật

và đất [14]

1.1.3 Phân biệt Bt với các loài khác trong nhóm Bacillus cereus

Các loài thuộc nhóm B cereus gồm B cereus, B thuringiensis, B

anthracis, B mycoides, B Megaterium Gần đây có phát hiện thêm 2 loài

B weihenstephanensis và B pseudomycoides [59] Việc sinh ra protein

tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó

chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

Hình 1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn

Bacillus thuringiensis var

israelensis

1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

B thuringiensis không lên men sinh axit trong môi trường có chứa

đường arabinoza, xyloza, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường có chứa đường glucoza Có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH=5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Không có khả năng khử amin của phenilalamin, không sử dụng axit xitric, không khử muối sunphat [57]

B thuringiensis có khả năng sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ dao động

từ 15-45 0C, nhiệt độ tối ưu là 28-300C Không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH=7 Bt có khả năng oxy hoá hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas

1.1.5 Protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Sự tồn tại của các thể vùi ở Bt được phát hiện đầu tiên vào năm 1915 nhưng đến tận những năm 1950 việc nghiên cứu chúng mới được thực hiện Những nghiên cứu đã chỉ ra các thể vùi này chính là các protein có cấu trúc tinh thể [60] Các tinh thể protein được hình thành trong quá trình tạo bào tử Chúng được tạo thành từ một hoặc một vài gen cry (crystal) và gen cyt (cytolytic) mã hóa tinh thể độc nằm trên các plasmid Các protein độc tố của

Bt rất đa dạng Đã có khoảng 30 loại protein Cry và 8 loại Cyt đã được biết đến, hơn 100 gen đã được tách

dòng và xác định trình tự [31]

Tùy theo thành phần protein cấu

tạo khác nhau mà các tinh thể có

nhiều hình dạng đặc biệt như

hình lưỡng tháp, hình khối hộp,

hình thoi dẹt… [60]

1.1.6 Đặc điểm phân loại của Bacillus thuringiensis

Năm 1962 Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 typ huyết thanh

Phương pháp này đã được cải tiến năm 1980, 1981 và được công nhận là

phương pháp đáng tin cậy, được Trung Tâm quốc tế Bacillus thuringiensis đặt

tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng trên thế giới từ năm 1982 Phương pháp được xác định chủ yếu dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên - kháng thể [3] Cho đến năm 1999, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết

thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bacillus thuringiensis [23]

1.1.7 Đặc điểm phân loại loài phụ Bti

Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) là một loài phụ của loài

vi khuẩn Bacillus thuringiensis, tạo tinh thể hình cầu và hình vuông có

khả năng diệt muỗi và ruồi (hình1.2) [20]

Theo hệ thống phân loại dựa trên cơ sở của 69 typ huyết thanh thì

Bti thuộc typ huyết thanh H14 [42]

Nếu dựa vào cấu trúc di truyền thì đặc điểm quan trọng để phân biệt loài phụ Bti với các loài phụ khác là thành phần protein tinh thể của chúng phải chứa các protein 135kDa, 128kDa, 78kDa, 72kDa và 27kDa (thành phần được xác định bằng phương pháp diện di trên gen

polyacrylamid) Vì các protein này là do các gen cry4 A, B, C, D và cyt

mã hóa, vì vậy sự tồn tại các protein này trong tinh thể đồng nghĩa với

việc tồn tại các lớp gen cry4 (A, B, C, D) và gen cyt trong cấu trúc di

truyền của chúng [23]

1.1.8 Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoảng

2,4-5,7 triệu bp Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gen

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry

tự nhiên cho một số chủng Bacillus thuringiensis [21] Hầu hết các chủng

Bacillus thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài nhiễm

sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng [45] Trong một thời gian dài người ta cho rằng các protein tinh thể được mã hóa chung trên các plasmid lớn Khi sử dụng kỹ thuật lai

ADN với các mẫu dò cho gen cry đã nhận thấy chúng xuất hiện cả trên

NST [15, 38]

1.1.8.1 Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng

Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu (ICP -Insecticidal Crystal Protein) ở các loài phụ Bt khác nhau Các phương pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng gen đã chứng minh rằng các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid lớn có

hệ số copy thấp Theo điều tra của Carlton and Gonzalez thì plasmid có

mặt trong hầu hết các chủng Bacillus thuringiensis số lượng plasmid dao

động từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại các gen tổng hợp nhiều độc tố trong

một tế bào Bacillus thuringiensis

Chẳng hạn như trong Bacillus

thuringiensis israelensis có 4 gen cry

và 2 gen cyt mã hoá các protein

Cry4Aa (125 kDa), Cry4Ab (135 kDa),

Cry10Aa (58 kDa), Cry11Aa (68 kDa)

và Cyt1Aa, Cyt2Ba (27 kDa), các gen

này nằm trong một plasmid có khối

lượng 72 MDa [21, 22, 53]

1.1.8.2 Phân loại độc tố từ Bacillus thuringiensis

Trước đây, khóa phân loại protein độc tố được Hoft và Whiteley đề nghị năm 1989 dựa trên tính tương đồng giữa các trình tự axít amin Dựa trên khóa phân loại này năm 1998 Crickmore và cộng sự đã đề xuất một khóa phân loại mới hoàn thiện hơn Trong khóa phân loại này đã đổi tên một số protein và thay đổi cách viết tên độc tố và tên gen mã hóa các độc tố đó [27]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển Bacillus thuringiensis có khả

năng sinh ra 3 loại độc tố diệt côn trùng chính là Cry (crystal -endotoxin), Cyt (Cytolysin) và Vip (Vegetative Insecticidal Protein) Dựa vào tính tương đồng của trình tự axit amin của các họ độc tố này lại được chia thành các lớp khác nhau, cách viết tên độc tố với các bậc cấu trúc đầy đủ được quy ước như sau; họ độc tố (Cry, Cyt, Vip), số đếm (1,2,3 ), ký tự viết hoa (A, B ), ký tự viết thường (a, b ), số đếm (1,2,3 ), ví dụ như độc tố Cry25Aa1 Tỷ lệ axit amin tương đồng để phân chia các lớp độc tố như sau; lớp 1 (Cry1, Cry2 ) có độ tương đồng dưới 45%, lớp 2 từ 45%-78%, lớp 3 từ 78%-95%, lớp 4 dưới 99%

[20,39]=17,28,47 Ngoài 3 họ độc tố trên Bacillus thuringiensis còn sinh ra một

số độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase [29]

1.1.8.3 Độc tố Cry

Gen cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau Đây là gen độc tố quan trọng nhất của vi khuẩn Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc

mà nó tạo ra Năm 2005, người ta đã phát hiện được gen cry khác nhau thuộc

về 47 nhóm ( từ cry1-cry47) Nhưng tính đến năm 2012, thì người ta đã phát hiện được hơn 607 gen cry khác nhau thuộc về 70 nhóm ( từ cry1 - cry70)

Mỗi nhóm gen lại có những đặc điểm và đặc tính khác nhau [10]

Bảng 1.2: Phân loại gen cry mã hóa các protein độc tố Cry diệt côn trùng

Hai cánh Diptera

Vùng 1 có chứa một bó gồm 7 chuỗi xoắn  đối song song (antiparallel) trong đó chuỗi số 5 được bao bọc bởi các chuỗi còn lại, vùng này mang đầu N [46]

Vùng 2 có chứa ba tấm  đối song song tạo thành một dạng hình học topo điển hình gọi là “Greek key”, sắp xếp này cũng được gọi là cuộn lăng kính  (-prism fold) [54] Vùng 2 được xem là quyết định tính đặc hiệu liên quan đến việc gắn độc tố vào màng, cơ chế gắn cho vùng 2 là phức tạp Các

số liệu đã chỉ ra một sự giống nhau giữa các móc gắn thụ thể của vùng 2 với các epitop đã biết như là vị trí liên kết kháng nguyên - kháng thể

Vùng 3 có chứa hai cuộn xoắn, các tấm  đối song song tạo thành một kẹp  (-sandwich) hình học topo gọi là “jelly roll” Vùng 3 cũng tham gia vào việc gắn thụ thể [46]

b Cơ chế tác động

Cơ chế hoạt động của protein Cry của Bacillus thuringiensis liên quan

đến sự hòa tan của tinh thể trong ruột giữa côn trùng, quá trình phân giải

protein của tiền độc tố nhờ protease ruột giữa, sự gắn kết của độc tố Cry với

các thụ thể ruột giữa, sự gắn độc tố vào màng để tạo ra các lỗ hoặc kênh ion (Hình 4) Tinh thể bao gồm các tiền độc tố, để tiền độc tố trở nên hoạt động thì côn trùng mẫn cảm phải ăn chúng Với hầu hết côn trùng cánh vảy, tiền độc tố được hòa tan trong môi trường kiềm của ruột giữa côn trùng [24, 32]

Sự khác nhau trong phạm vi hòa tan đôi khi giải thích sự khác nhau về cấp độ

gây độc trong số các protein Cry Sự giảm tính tan có lẽ tích lũy một cơ chế tiềm

tàng cho sự kháng của côn trùng Sau khi hòa tan nhiều tiền độc tố phải được xử lí bởi protease ruột giữa côn trùng để trở thành độc tố hoạt động Protease chính của ruột giữa côn trùng cánh vảy giống trypsin hoặc chymotrypsin

Hình 1.4 Cơ chế tác động của protein tinh thể độc lên côn trùng

(a) Tinh thể độc bị hòa tan bởi dịch ruột, (b) Protease ruột cắt từ đầu C của protein độc tố, (c) Tạo ra độc tố được hoạt hóa với hoạt động của vùng 2 và 3, (d) vùng I sắp xếp hai chuỗi xoắn cho phép gắn vào màng, (e) hình thành lỗ rò [51]

Hoạt động của độc tố Cry đã được biết đến với hai chức năng: gắn vào thể đặc hiệu trên màng của lông nhung ruột giữa côn trùng mẫn cảm Sự gắn này là một quá trình hai giai đoạn, thuận nghịch và không thuận nghịch Các bước sau này có thể dẫn đến sự gắn chặt giữa độc tố vào thụ thể, sự gắn độc

tố vào màng ruột hoặc cả hai

Bảng 1.2 Đặc điểm của một số protein độc tố Cry Tên độc

tố

Hình dạng tinh

thể

Trọng lƣợng (kDa)

tolworthi

Cry 1D 133 aizawai, entomocidus, darmstadiensis,

Cry 3A Hình hộp 73 tenebrionis (san diego), morrisoni

Cry 3Ba Không xác

- Nhóm Cry1: Gồm 139 protein thuộc các nhóm độc tố Cry1A-Cry1L,

có khối lượng khoảng 130kDa, tích lũy thể vùi dạng hình tháp và thường chỉ

có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy Gen đầu tiên mã hóa cho

protein nhóm này được Schnepf và cộng sự phát hiện trong Bt kurstaki từ chế

phẩm Dipel [56]

- Nhóm Cry2: Gồm 21 protein độc tố thuộc nhóm Cry2A Các protein nhóm này có khối lượng khoảng 70kDa, có hoạt tính với cả hai loài thuộc bộ cánh vảy và bộ hai cánh [56]

- Nhóm Cry3: Nhóm này gồm 17 protein thuộc các nhóm Cry3C, có khối lượng khoảng 73kDa, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng [56]

Cry3A Nhóm Cry4: Gồm 8 protein thuộc nhóm Cry4ACry3A Cry4B tích lũy cả hai loại tinh thể có khối lượng khoảng 70kDa và 130kDa Nhóm này có hoạt tính với các loài thuộc bộ hai cánh Những protein này cùng với protein 27kDa do nhóm cyt1A tổng hợp ra một phức hợp tinh thể tròn [56]

1.1.8.4 Độc tố cyt

Cũng có bản chất là protein và hình thành thể vùi như độc tố Cry,

nhưng tính tương đồng của trình tự axit amin giữa độc tố Cyt và độc tố Cry hầu như không đáng kể Độc tố Cyt đầu tiên được Waalwijk phát hiện là

cyt1Aa1 vào năm 1985 Hiện nay, người ta đã phát hiện được 22 độc tố Cyt

thuộc hai nhóm, các độc tố này có trọng lượng 25-30 kDa Các độc tố Cyt

được phát hiện chủ yếu thuộc các dưới loài Bacillus thuringiensis israelensis,

morrisoni, medellin, neolonensis, kyushuensis, damstradiensis, fuokukaensis, tenebrionis

1.1.8.5 Độc tố Vip

Có một số protein diệt sâu không liên quan đến protein Cry được tạo ra

ở một số chủng Bt trong pha sinh trưởng sinh dưỡng của tế bào, các protein

này gọi chung là Vip (Vegetative Insecticidal Protein) Các Vip này không phải là protein tinh thể mà là protein tiết từ tế bào Độc tố Vip được phát hiện đầu tiên là Vip3A1 và Vip3A2 vào năm 1996 nhờ Estruch và cộng sự

Gen vip3A mã hóa protein 88 kDa được tổng hợp trong suốt pha sinh dưỡng nhưng nó không được tiết ra ngoài Gen mã hóa protein Vip3A xuất

hiện trong cả các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus cereus Protein này

có hoạt tính đối với rất nhiều côn trùng gây hại thuộc bộ cánh vảy như:

Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa zea

Khi côn trùng mẫn cảm ăn phải độc tố, Vip3A là nguyên nhân gây phân giải các tế bào biểu mô ruột giữa; các đặc tính vật lý của Vip3A biểu lộ tính độc như protein Cry [43, 44]

1.2 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bti

Bt israelensis (Bti) được phân lập lần đầu tiên bởi Goldberg và

Margalit (1977) tại Israel, được phân lập từ xác chết của ấu trùng muỗi culex pipiens chủng này lúc đó được đặt tên là ONR60 Về sau chủng này được phân loại bằng huyết thanh H14 phương pháp của de Barjac (1978) và đặt tên

là Bacillus thuringiensis var israelensis Bti được công nhận là có khả năng gây độc cao đối với côn trùng thuộc bộ Diptera và nó đóng vai trò quan trọng

trong việc kiểm soát vectơ truyền bệnh cho người là ruồi và muỗi

Thời kì đầu khi mới phát hiện ra dưới loài Bti, việc nghiên cứu và ứng dụng Bti chỉ giới hạn trong lãnh thổ nước Đức, người Đức đã dùng chế phẩm

Bti để kiểm soát ấu trùng muỗi Culex pipiens và Aedes vexans Chế phẩm này

có tên là Culexđ-Bti và nó được sử dụng kết hợp với chủng Bacillus sphaericu

gia Tây Phi và đã thu về những kết quả ngoài mong đợi (Hougard et al., 1997) Ở Brazil, chế phẩm Bti cũng được sử dụng để thay thế cho thuốc trừ sâu hóa học (Mardini et al., 1999) Ở Trung Quốc, Bti đã chứng tỏ vai trò của mình trong việc giảm dịch bệnh sốt rét (Becker, 1997) [14]

Chế phẩm Bti có tác dụng tốt trong môi trường nước sạch, nước không

tù đọng hoặc nước có nồng độ muỗi thấp Các chế phẩm này được tổ chức y

tế thế giới (W.H.O) khuyến cáo sử dụng để diệt trừ các vectơ truyền bệnh: sốt rét, sốt xuất huyết, viên não Nhật Bản là những bệnh thường xuất hiện thành dịch lớn do muỗi lây truyền ở các nước nhiệt đới

1.2.1 Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti)

Tinh thể độc của Bti có dạng hình cầu (trứng) có kích thước khoảng 0,71,2 m có hoạt lực đặc hiệu với côn trùng bộ 2 cánh (Diptera) Người ta

đã xác định thành phần protein của Bti bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (PAGE) theo đó tinh thể độc của Bti bao gồm các protein có trọng lượng phân tử là 135 kDa, 128 kDa, 78 kDa, 72 kDa và 27 kDa do các gen cryIV A, B, C, D và cyt mã hoá [22] Các độc tố này có cấu trúc và phổ diệt côn trùng khác nhau [28, 49]

Các protein này thực chất là các tiền độc tố nó chỉ có tác dụng gây độc khi được hoà tan và phân giải thành mảnh nhân độc, tác dụng phân giải xảy ra trong môi trường kiềm và dưới tác dụng của proteaza Khi ở trong môi trường kiềm và dưới tác dụng của proteaza thì:

Protein 27 kDa bị phân hủy thành protein 25 kDa (cả 2 protein này đều

có hoạt lực diệt côn trùng thấp)

Protein 72 kDa bị phân hủy thành các tiểu phần 31 và 35 kDa, 2 tiểu phần này cũng có tác dụng diệt muỗi thấp

Protein 78 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 kDa

Protein 128 và 135 kDa bị phân hủy thành nhân độc 58 và 73 kDa [28]

Cấu trúc tinh thể cầu của Bti được tạo thành từ ba dạng thể vùi khác nhau, gắn với nhau bởi lớp vỏ bọc Chính nhờ các lớp vỏ bọc này mà tinh thể bền vững với proteaza và một vài hóa chất khác Đặc điểm của ba dạng thể vùi của Bti như sau:

Dạng 1: là thể vùi lớn nhất có hình dạng từ tròn đến hình khối đa diện, chiếm 4050% khối lượng tinh thể và có thành phần chủ yếu là protein 27 kDa Độ rộng của thể vùi là 4,3nm, (trên gel polyacrylamide protein 27 kDa được xác định rất rõ bởi đó là một protein dễ hoà tan trong dung dịch 50mM

Na2CO3.HCl ở pH 10,5)

Dạng 2: Có dạng hình thoi, hình khối, hình chữ nhật chiếm 1520% khối lượng tinh thể cầu, chứa protein 72 kDa hoà tan trong dung dịch 1% SDS-50mM DDT(dithio theritol)-trisHCl ở 370C với pH 10,5

Dạng 3: Có dạng hình cầu hoặc bán cầu chiếm 2025% khối lượng tinh thể cầu, chứa protein 128 và 135 kDa hoà tan trong dung dịch 1% SDS-50mM DDT(dithio theritol)-trisHCl ở 370C với pH 8,39,2 [10]

1.2.2 Cấu trúc phân tử nhân độc tố của Bti

Nội độc tố -endotoxin được sản sinh trong quá trình hình thành bào tử Chúng tồn tại ở dạng tinh thể, mỗi tinh thể thường gồm nhiều loại -endotoxin cùng họ gắn với nhau bằng cầu disufua và các liên kết kỵ nước Khi ở trong môi trường kiềm, tinh thể bị hoà tan thành các tiền độc tố sau đó

bị proteaza phân cắt thành các nhân độc Nhân độc của protein tinh thể cấu tạo gồm 3 vùng (hình a)

Vùng 1

Là vùng đầu Nitơ có 2 mặt, mặt háo nước và mặt kỵ nước, mặt háo nước quay ra ngoài, tiếp xúc với nước còn mặt kỵ nước tiếp xúc với vùng 2 và vùng 3 Vùng 1 có chức năng phá hủy và tạo lỗ dò trên niêm mạc ruột côn trùng khi tinh thể độc đã bám dính Về cấu trúc thì vùng 1 bao gồm một bó

gồm 7 đường xoắn  trong đó có 6 đường xoắn tạo thành bó hình trụ 6 cạnh (là lỗ dò sau này) đường xoắn ốc số 5 gọi là đường xoắn kỵ nước trung tâm,

nó nằm ở tâm hình trụ

Sau khi tạo thành lỗ dò mặt ngoài của lỗ dò sáu cạnh tiếp xúc với màng photpholipit (gọi là mặt kỵ nước) mặt trong của lỗ dò cho dòng ion K+

và Na+ chảy qua và gọi là mặt háo nước Cấu trúc trên tạo nên tính bền vững của lỗ

dò và vùng 1 được xem là vùng ít biến đổi [7]

Vùng 2

Bao gồm các tấm  [hình a], xếp song song ngược chiều nhau Mỗi tấm kết thúc bằng một cấu trúc móc, đây là vùng không bền vững của độc tố Vùng 2 có chức năng gắn nhận đặc hiệu tinh thể độc với một số điểm thụ cảm nhất định trên niêm mạc ruột côn trùng đích, đây là yếu tố chính, xác định côn trùng đích của Bti [7]

Vùng 3

Cũng chứa các tấm , nhưng có dạng hình bánh kẹp (sanwich) [hình a] đây là vùng chứa đầu cacbon và có cấu trúc bền vững Vùng 3 có chức năng

trong việc nhận biết các thụ điểm trên màng tế bào

Những nghiên cứu gần đây cho biết trình tự axit amin bao từ cuối vùng

2 đến đầu vùng 3 liên quan chặt chẽ đến tính gắn của tinh thể độc vào niêm mạc ruột côn trùng Khi trình tự này biến đổi làm mất đi tính gắn đó côn trùng

có hiện tượng kháng thuốc Vì thế vùng 2 và 3 được coi là vùng quyết định đến tính kháng thuốc của côn trùng [7]

1.2.3 Hoạt tính diệt côn trùng của Bti

Bti có hoạt tính cao với các sinh vật thuộc họ Culicidae (muỗi) và Simuliidae (ruồi) Các loại muỗi khác nhau thường có mức độ nhạy cảm khác

nhau với Bti Nói chung, muỗi Culex và Aedes thường nhạy cảm hơn muỗi

Anopheles [11] Ngay cả trong cùng một loài muỗi, mức độ nhạy cảm cũng

thay đổi theo giai đoạn phát triển

Các loài muỗi không thuộc nhóm ăn bằng vòi lọc thì hầu như không bị

diệt bởi Bti Khi thử nghiệm muỗi Culicoides occidentalisn và Coquilenttidia

perturbans không bị diệt bởi Bti [58] Trong giống muỗi ăn thịt Toxorhynchites, có một số loài nhạy cảm còn một số loài thì không

Côn trùng thuộc họ Chironomidae và Tipulidae cũng thuộc nhóm có

nhạy cảm với Bti Ở một số nơi chúng là thức ăn cho các sinh vật khác còn ở một số nơi khác Chironomids là những sinh vật có hại Liều dùng để diệt Chironomids thường cao gấp hàng chục lần liều dùng để kiểm soát muỗi

1.2.4 Tác động của Bti đến các sinh vật khác

Nhiều nghiên cứu về tác động của Bti đến các sinh vật khác như động

vật không xương sống, cá và động vật có vú đã chỉ ra rằng hầu như không có tác dụng không mong muốn Thử nghiệm độ an toàn trên động vật có vú cho

thấy sự phơi nhiễm trực tiếp với Bti hầu như vô hại Khi tiêm vào chuột, các

độc tố hòa tan δ–endotoxin có biểu hiện tính độc, độc tố cũng có tác dụng làm tan hồng cầu ở người Tuy nhiên, sự hòa tan độc tố chỉ diễn ra ở pH rất cao giống như điều kiện trong ruột côn trùng Khi thử nghiệm trên động vật có vú

thì thấy không có ảnh hưởng nào khi thử Bti theo con đường ăn uống

1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng trong nước và trên thế giới

1.3.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng trên thế giới

Năm 1977, phát hiện ra Bacillus thuringensis var israelensis (Bti) và

Bacillus sphaericus (Bs) diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ Hai cánh

(Diptera) mở ra hướng mới trong nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chế phẩm

diệt ấu trùng muỗi

Tại những nước nhiệt đới, muỗi và các loài côn trùng cắn, chích hút là những véc tơ truyền bệnh vô cùng nguy hiểm Sau Chiến tranh Thế giới thứ

II, việc sử dụng rộng rãi thuốc hóa học đã đem lại nhiều hiệu quả to lớn Tuy nhiên, cùng với sự phổ biến của thuốc hóa học, sự xuất hiện tính kháng thuốc

ở muỗi ngày càng gia tăng Thuốc DDT sử dụng để chống muỗi được 8 năm thì bắt đầu xuất hiện tính kháng thuốc Mặt khác, do lo ngại các vấn đề về môi trường sinh thái và sức khỏe cộng đồng, nhiều nước đã cấm sử dụng thuốc hóa học độc hại Do đó, hiện nay tổ chức Y tế Thế giới WHO khuyến khích nghiên cứu phát triển các loại thuốc sinh học diệt côn trùng Thuốc diệt muỗi

từ vi khuẩn Bt có hiệu quả cao, thân thiện môi trường và khó xuất hiện tính

kháng thuốc hơn thuốc hóa học Bti đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới 20 năm nay nhưng vẫn chưa có một báo cáo nào về sự xuất hiện tính kháng Bti

Hiện nay, Bti đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới với các dạng chế phẩm thương mại VectoBac và Teknar Chế phẩm thương mại VectoLex sử

dụng vi khuẩn Bs cũng được sử dụng để kiểm soát muỗi và các loại dịch bệnh

do muỗi truyền như sốt rét, sốt xuất huyết, Tuy nhiên, giá nhập khẩu các loại thuốc này còn tương đối cao so với điều kiện kinh tế của nước ta

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bacillus thuringiensis var israelensis đã được nghiên cứu tại một số

phòng thí nghiệm ở Việt Nam

Trong vài năm trở lại đây, đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản về vi

khuẩn diệt côn trùng (muỗi) Bti và Bs (Mã số 64.34.01: 2001-2003 và

82.09.04: 2004-2005) do phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện đã phân lập, sàng lọc và lựa chọn được một số chủng Bti và

Bs ở Việt Nam có hoạt lực diệt muỗi cao, đã tách được các gen mã hoá protein độc tố diệt muỗi Cry4 và Cry2, đã sản xuất được một lượng chế phẩm để thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và bước đầu đưa ra áp dụng

thực tế Kết quả cho thấy hiệu quả diệt ấu trùng muỗi sốt rét (Anopheles

minimus), muỗi vằn truyền bệnh sốt xuất huyết, sốt Dangue (Aedes aegypti),

muỗi truyền bệnh viêm não Nhật Bản, bệnh sùi chân voi, giun chỉ (Culex

quinquefasciatus, Culex pipiens) đạt 95,0 -100 % sau 6 giờ xử lí trong phòng

thí nghiệm Trong tự nhiên (ao, hồ, sông, ngòi) đạt tỷ lệ chết trung bình từ 85,0 đến 93, 6 %) sau 4 ngày xử lí Tuy nhiên, các đề tài mới chỉ trong phạm vi bước đầu áp dụng trong tự nhiên để sản xuất được một chế phẩm vi sinh vật mới có ý nghĩa về kinh tế, xã hội và môi trường này cần thiết có những nghiên cứu tiêp tục [4,5]

Ngoài ra, cũng còn có một số những nghiên cứu được thực hiện như nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein diệt ấu trùng muỗi từ

Bti, nghiên cứu chuyển gen diệt muỗi từ Bti vào tảo lam…

1.4 Tổng quan về côn trùng thử nghiệm

Muỗi là một nhóm sinh vật thuộc lớp côn trùng hợp thành họ Muỗi Culicidae, bộ hai cánh [34] Chúng có một đôi cánh vảy, một đôi cánh cứng, thân mỏng, các chân dài Muỗi đực hút nhựa cây và hoa quả để sống, muỗi cái hút cả máu người và động vật Kích thước muỗi thay đổi theo loài nhưng thường không lớn hơn 15mm Đa số có trọng lượng khoảng 2 đến 2,5mg Chúng có thể bay với tốc độ 1,5 đến 2,5 km/h

1.4.1 Phân loại khoa học của muỗi

Kingdom (giới) : Animalia (động vật)

Phylum (ngành) : Athropoda (chân khớp) Class (lớp) : Insesta (sâu bọ)

Ordo (bộ) : Diptera (hai cánh)

Familia (họ) : Culicidae (muỗi)

Theo các nhà khoa học muỗi xuất hiện trên hành tinh của chúng ta cách

đây khoảng 170 triệu năm Họ Culisidae thuộc bộ Diptera với khoảng trên

3000 loài thuộc 3 phân họ: Anophelinae gồm 3 giống; phân họ Culicinae gồm

37 giống chiếm đến hơn 80% và phân họ Toxorhynchitinae chỉ có một giống

Trong đó những giống muỗi được biết đến nhiều nhất gồm Anopheles,

Culex, Aedes, Masonia, Sabethes, Wyeomyia và Malaya

1.4.2 Vòng đời của muỗi

Vòng đời của muỗi trải qua 4 giai đoạn hoàn chỉnh (hình 1.5), từ trứng nở

ra ấu trùng (bọ gậy) rồi phát triển thành bọ gậy, cuối cùng là muỗi trưởng thành Trừ giai đoạn muỗi trưởng thành ra, các giai đoạn khác của muỗi đều diễn ra ở dưới nước

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của muỗi

Muỗi sinh trưởng chủ yếu trong các đầm lầy, ao hồ hoặc các vũng nước đọng Chúng đẻ trứng xuống nước, trứng sẽ nở thành ấu trùng (còn gọi là bọ gậy, cung quăng, lăng quăng) Thức ăn của ấu trùng chủ yếu là các sinh vật nhỏ trong nước, ấu trùng muỗi phải thường xuyên bơi lên mặt nước để lấy oxy trong không khí thông qua một ống thở Sau một thời gian, ấu trùng phát triển thành nhộng rồi biến thái thành muỗi trưởng thành bay lên khỏi mặt nước Chỉ có muỗi trưởng thành mới có khả năng bay và hút máu Muỗi cái

có vòi đặc biệt có thể xuyên thủng da người và động vật để hút máu tạo nguồn protein sản sinh ra trứng Muỗi đực không có vòi để hút máu nên chỉ

ăn nhựa cây và hoa quả Cũng chỉ có một nhánh muỗi tên là Toxorhynchites không hút máu

Tùy vào điều kiện nhiệt độ môi trường nước, vòng đời một con muỗi từ khi là trứng cho đến muỗi trưởng thành có thể kéo dài từ khoảng 4 ngày cho đến một tháng

Muỗi cái có khả năng xác định mục tiêu hút máu qua mùi vị và cảm nhận nhiệt, chúng đặc biệt nhạy cảm với CO2 trong hơi thở động vật và một

số mùi trong mồ hôi Một số người, ví dụ như nam giới béo và thuộc nhóm máu O thì hấp dẫn muỗi nhiều hơn Loài muỗi có khả năng cảm nhận tia hồng ngoại phát ra từ người có thân nhiệt cao nên dễ tìm được đến động vật và chim máu nóng [55]

Muỗi sinh trưởng và phát triển thuận lợi nhất là khoảng 200

đến 250C,

vì vậy chúng thường xuất hiện ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam

1.4.3 Khả năng gây bệnh của muỗi

Một số loài muỗi có khả năng là vật trung gian truyền bệnh giữa người với người hay giữa động vật và người Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử

vong cao như Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho người

Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết Culex tritaeniorhynchus truyền

bệnh viêm não Nhật Bản… Ở Việt Nam, vào mùa hè và mùa mưa sự phát triển của muỗi thường xuyên gây nên các dịch bệnh làm tử vong vài chục bệnh nhân trong số hàng chục nghìn người nhiễm sốt xuất huyết Trên thế giới có khoảng hơn nửa tỷ người mắc bệnh sốt xuất huyết hàng năm, nơi tập trung nhiều nhất là Châu Phi mà muỗi là tác nhân truyền bệnh chính

1.4.4 Sơ lƣợc về côn trùng thử nghiệm:

1.4.4.1 Muỗi Anopheles

Thuộc họ Culicidae, muỗi Anopheles có khoảng 400 loài khác nhau

trong đó có khoảng 30-40 loài có khả năng truyền 4 loại kí sinh trùng khác

nhau thuộc giống Plasmosium gây bệnh sốt rét cho người Anopheles gambiae

là loài được biết đến nhiều nhất vì nó có thể mang và truyền kí sinh trùng sốt

rét Plasmodium falciparum, một kí sinh trùng sốt rét nguy hiểm nhất Muỗi

anopheles sống chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, do đó sốt rét là căn bệnh phổ

biến ở nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ và Nam Mỹ Tác nhân

gây bệnh là Plasmodium - loại ký sinh trùng một tế bào Thông qua ngòi của muỗi Anopheles, kí sinh trùng Plasmodium xâm nhập vào cơ thể người Mỗi năm, Plasmodium tấn công khoảng 300 triệu người và cướp đi sinh mạng của

Một số loài Anopheles thường gặp ở Việt Nam: Tính đến năm 1995 thì

số loài Anopheles ở Việt nam lên tới 59 loài và được chia như sau [5]:

 Vectơ truyền bệnh chính: An minimus, An dius, An sundaicus

 Vectơ truyền bệnh phụ: An subpictus, An jeyporiensis, An maculatus,

An aconitus, An sinesis, An vagus, An indefinitus

 Vectơ nghi ngờ truyền bệnh: An campestris, An culicifaciens, An.baezai,

An.lesteri, An.interruptus

1.4.4.2 Muỗi Aedes

Aedes là một giống muỗi thường gặp ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt

đới Muỗi Aedes là vật chủ trung gian truyền một số bệnh nguy hiểm như sốt xuất huyết (dengue) và sốt vàng (yellow fever) Ở Polynesia, loài muỗi Aedes

polynesiensis là vật trung gian truyền bệnh giun chỉ cho người Tên của giống

này được nhà khoa học Johann Wilhelm Meigen đặt năm 1818 Hiện nay có

một số ý kiến tranh luận về đổi tên Aedes thành Stegomyia

Hình 1.7 Ấu trùng(A) và muỗi Aedes trưởng thành (B)

Muỗi Aedes có những dải trắng và đen trên thân và chân Vì thế chúng

còn được gọi là muỗi vằn

Tại Việt Nam, theo thống kê của Cục Y tế Dự phòng Việt Nam, tính

từ đầu năm đến tháng 9 năm 2008, dịch bệnh sốt xuất huyết và sốt vàng đã hiện diện ở khoảng 30 tỉnh, thành phố làm cho 40.000 người bị mắc bệnh gây40 trường hợp bị tử vong Dịch sốt xuất huyết lan rộng và bùng phát rất nhanh đặc biệt là ở các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, thành phố Hồ Chí Minh

Một số loại muỗi Aedes chính:

 Aedes aegypti: trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết có nguồn gốc

từ châu Phi Loài muỗi này dần dần lan tràn ra hầu hết các khu vực có khí hậu nhiệt đới đầu tiên là nhờ đường thủy Ngày nay, có hai dưới nhóm của

Aedes aegypti là Ae aegypti queenslandensis, một dạng hoang dã ở châu Phi

không phải là vectơ truyền bệnh chính và Ae aegypti formosus là muỗi sống

ở khu vực đô thị vùng nhiệt đới và là vectơ truyền bệnh chính Trong quá

khứ, muỗi Aedes aegypti phải nhờ vào các vũng nước mưa để đẻ trứng Tuy

nhiên, ngày nay quá trình đô thị hóa diễn ra với tốc độ ồ ạt đang cung cấp

cho muỗi những hồ nước nhân tạo, dụng cụ chứa nước để muỗi đẻ trứng dễ dàng hơn nhiều

Ở Việt Nam, số lượng muỗi Ae aegypti và sự phân bố của chúng khác

nhau rõ rệt giữa các miền: Ở miền Nam số lượng muỗi này nhiều hơn ở miền Bắc do đó số lượng bệnh nhân sốt xuất huyết ở miền Nam cao hơn ở miền Bắc Ở những vùng rừng núi xa trục giao thông, dân cư thưa thớt và ít dụng

cụ chứa nước thì hầu như chưa có Ae aegypti

Bọ gậy muỗi Ae.aegypti chủ yếu sống trong các dụng cụ chứa nước,

thường xuyên ngoi lên mặt nước để thở, hầu hết áp sát thành dụng cụ chứa nước

 Aedes albopictus: Trước đây là vectơ truyền bệnh chính của sốt xuất

huyết và hiện nay vẫn còn là vectơ truyền bệnh quan trọng ở châu Á Loài muỗi này gần đây đã lan tràn đến khu vực Trung Mỹ, Hoa Kỳ và tại đây muỗi

này là vector truyền bệnh quan trọng thứ hai Trong khi muỗi Ae aegypti

formosus chủ yếu sống ở khu vực đô thị thì muỗi Aedes albopictus lại cư trú

chủ yếu ở vùng nông thôn Muỗi Aedes aegypti không truyền virus cho trứng trong khi muỗi Aedes albopictus thì có khả năng này

1.4.4.3 Muỗi Culex

Culex là một giống muỗi với một số loài trong đó là vật trung gian

truyền bệnh nguy hiểm như: Giun chỉ (filariasis), Viêm não Nhật bản (Japanese encephalitis), virut tây sông Nile (West Nile virus), St Louis encephalitis, bệnh sốt rét gia cầm (avian malaria )

Hình 1.8 Muỗi Culex trưởng thành

Muỗi Culex có thể được mô tả là loài ăn động vật vì chúng hút máu

người và động vật Tuy nhiên, chúng còn có thể được coi là loài ăn chim vì

chúng thường xuyên hút máu của các loài chim Chính vì thế, những bệnh do

muỗi Culex truyền thường khó bị dập vì cộng đồng động vật bị muỗi hút máu

trở thành nguồn chứa mầm bệnh và có sự di chuyển rất rộng, dẫn đến lan truyền bệnh ở một vùng rộng lớn (chủ yếu là từ chim di cư)

Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, trung bình mỗi năm cả nước có 3.000 trẻ mắc bệnh viêm não, trong đó viêm não Nhật Bản chiếm từ 30% đến 40% Viêm não Nhật Bản là loại bệnh trẻ em lứa tuổi từ 5 đến 7 tuổi thường mắc phải, có tỷ lệ tử vong cao (30%), nếu được chữa trị kịp thời thì di chứng của nó để lại cũng rất nặng nề cho mỗi gia đình và toàn xã hội Ở miền Bắc, bệnh viêm não Nhật Bản xảy ra nhiều hơn miền Nam

Một số loài muỗi Culex chính là:

- Culex tritaeniorhynchus: trung gian truyền bệnh viêm não Nhật Bản

là loài muỗi có số lượng nhiều và chiếm tỷ lệ cao ở các vùng trồng lúa thuộc miền Bắc Việt nam, chúng thường hút máu vào ban đêm và thích hút máu súc vật hơn Bọ gậy muỗi này sống ở nhiều loại thuỷ vực, nhiều nhất ở ruộng lúa, mương máng và các hố vũng Trong năm mật độ muỗi cao nhất vào các tháng 4, 5 và 9

- Culex quinquefasciatus: trung gian truyền bệnh giun chỉ phân bố rộng

cả 3 vùng rừng núi, trung du và đồng bằng nước ta Số lượng tăng dần từ nông thôn đến thành phố do bọ gậy của muỗi này rất thích hợp với các loại cống rãnh chứa nước thải

- Culex pipiens: Trung gian truyền bệnh viêm não do virut, là một loài

muỗi phổ biến nhất trên thế giới, có ở tất cả các châu lục (trừ Nam cực),

chúng thường mang theo nhiều loại virut gây bệnh (arbovirut), chúng hay tấn

công người và đặc biệt là chim vì vậy nên rất khó khống chế bệnh Ấu trùng của muỗi này thích nước ô nhiễm và có thể phát triển trong cả bể phốt

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Sinh phẩm

- Các chủng vi khuẩn B thuringiensis phân lập tại đất Nha Trang, các

chủng dưới loài Bti do phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

- Ấu trùng muỗi: Anopheles minimus, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus do

Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng TW cung cấp

Mồi sử dụng để khuyếch đại và đọc trình tự gen cry 4A, cry 4B có trình tự

1,0 cry4A5 5´-ATG GCT TGT TTC GCT ACA TC-3´ cry4A

cry4BF 5’-CGTTTTCAAGACCTAATAATATAATAC-3’ cry4B 0,3 cry4BR 5’-CGGCTTGATCTATGTCATAATCTG T-3’ cry4B

Quick Gel Extraction Kit: PureLink (Invitrogen)

2.1.2 Hoá chất và môi trường

a Hoá chất, dung dịch

Các hoá chất dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử được mua từ các

hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad, bao gồm: dNTP, Taq polymerase,

agarose, marker, ethidium bromide, protease, RNAse, axit axetic, enzyme,

Các hoá chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật bao gồm: cao nấm men, cao thịt, trypton, agar, glucose, NaCl…

Dung dịch tách chiết DNA plasmid:

 Dung dịch Sol I: Tris – HCl 1M; pH8 2,0 ml