tìm hiểu phương pháp Rapid amplification of 5’cDNA (5RACE)

Rapid amplification of 5’cDNA end (5RACE)Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) – là quy trình nhằm khuếch đại trình tự acid nucleic từ khuôn mẫu mRNA giữa một trình tự bên trong đã được xác định và một trình tự chưa biết ở đầu 5’ hoặc 3’ của mRNA.RACE được nghiên cứu một cách độc lập bởi nhiều nhà khoa học và được đặt bởi nhiều tên gọi khác nhau như: RACE; PCR mỏ neo; PCR một bên.

Rapid amplification of

5’cDNA - end

Nhóm 7:

- Lê Văn Duy Thanh

- Nguyễn Minh Thành

- Trương Thị Hoài Thu

- Nguyễn Thị Thu Thủy

- Trương Thanh Tỉnh

- Hồ Thị Trang

- Trịnh Xuân Tùng

3 Kỹ thuật 5’ RACE

2 Ứng dụng

1 Giới thiệu

Nội dung

1/ Giới thiệu:

• Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) – là quy trình nhằm khuếch đại

trình tự acid nucleic từ khuôn mẫu mRNA giữa một trình tự bên trong đã được xác định và một trình tự chưa biết ở đầu 5’ hoặc 3’ của mRNA.

• RACE được nghiên cứu một cách độc lập bởi nhiều nhà khoa học và được đặt bởi nhiều tên gọi khác nhau như: RACE; PCR mỏ neo; PCR một bên.

2/ Ứng dụng

1

Khuếch đại và tạo

dòng các RNA hiếm

2

Phân tích biểu hiện gen

3

Phát hiện các tác nhân gây bệnh ở các loài

4

Nghiên cứu cấu trúc, đặc điểm một số gene chưa rõ trình tự

RACE được ứng dụng nhiều trong y học và sinh học

3/ Kỹ thuật

a/ Tách mRNA

b/ Thiết kế mồi

c/ Tổng hợp cDNA

d/ Tinh sạch cDNA

- Loại bỏ dNTP, enzyme RNase, GSP1

- Dùng cột S.N.A.P

e/ Gắn đuôi polyC vào cDNA

- Thêm các thành phần:

- Ủ 2-3 phút ở 94°C, làm lạnh trong 1 phút.

- Thêm 1 ml TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase), trộn nhẹ nhàng, và ủ trong 10 phút ở 37°C.

- Nhiệt bất hoạt các polyC ở 65°C trong 10 phút.

- Làm lạnh.

Mẫu cDNA đã tinh sạch 10.0

f/ PCR khuếch đại PolyC-cDNA

 Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 bước.

- Bước 1: biến tính DNA mẫu.

- Bước 2: gắn mồi.

- Bước 3: kéo dài mồi

Các bước trên được lặp lại nhiều lần, thường là 30 – 35 lần

 Chu kỳ nhiệt:

- Biến tính: 940C trong 1 phút

- Gắn mồi: 550C trong 30s

- Kéo dài mồi: 720C trong 2 phút

Thành phần Thể tích ( µ l)

Taq DNA polymerase 0.5

Đệm 10X (200mM Tris-HCl, 500 mM KCl) 5.0

Abridged Anchor Primer (AAP) 10µM 2.0

cDNA đã gắn đuôi polyC 5.0

g/ Nested PCR