Đề tài sản xuất kháng sinh penicillin

Kháng sinh là những sản phẩm nhận được từ VSV hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm, tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.

Đề tài sản xuất kháng sinh penicillin

GVHD : PHẠM THỊ HƯƠNG

SVTT : TRẦN DUY SƠN

NGUYỀN ĐÌNH TẤN

NGUYỄN BÁ THẠCH

TRƯƠNG THỊ HOÀI THU

NGUYỄN THỊ THU THỦY

HỒ THỊ TRANG

Mục lục

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

Chương I: Tổng quan tài liệu.

1.1 Tổng quan về chất kháng sinh.

1.1.1 Khái niệm chất kháng sinh:

Kháng sinh là những sản phẩm nhận được từ VSV hay các nguồn tự nhiên khác

có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm, tiêu diệt một cách chọn lọc lên mộtnhóm VSV xác định hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp

1.1.2 Cơ chế tác dụng chung của kháng sinh.

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mangđặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó

Những kiểu tác động:làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điềutiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quátrình sinh tổng họp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu vớinhững giai đoạn nhất định trong chuyển hóa trao đổi chất

Hình 1.1 :Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh như theo phổ tác dụng, theo nguồn gốc … Dựavào cấu trúc hóa học, kháng sinh được chia thành các nhóm như:

-Nhóm β-Lactam: penicillin, cephalosporin,

-Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin,

-Nhóm polypeptid: bacitracin, polymycin,

- Nhóm macrolide: erythromycin, spiramycin,

- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng: tetracillin …

- …

1.2 Kháng sinh Penicillin.

1.2.1 Lịch sử phát hiện và sản xuất Penicillin

Năm 1928 A Fleming là người đầu tiên phát hiện ra kháng sinh

Đến năm 1938, Howard Florey, Ernst Chain, Norman Heatley mới đưa Penicillinvào sản xuất thử

Vào năm 1940, Dorothy Hodkin xác định được cấu trúc phân tử của Penicillin

1942: Mary Hunt đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Peniciỉlium

chrysogenum là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay

trên toàn thế giới

Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm penicillin (trong đóchỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và tiếp tục triển khai

để sản xuất các chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác

1.2.2 Tình hình sản xuất penicillin hiện nay trên thế giới.

Penicillin vẫn là chất kháng sinh được sử dụng nhiều nhất thế giới

Thuốc kháng sinh chiếm khoảng 30% thị phần dược phẩm thế giới

Các tập đoàn dược phẩm của Mỹ, Anh, Nhật Bản , Italia, Hà Lan, Ấn Độ chiếmcác vị trí hàng đầu trong lĩnh vực này

1.2.3 Tính chất hóa lý của penicillin.

Tính chất vật lí:

Các penicillin dưới dạng muối hoặc dạng acid là những bột trắng không mùi khi

tinh khiết.

Đa số các nhóm R acyl hóa trên 6-APA đều là vòng thơm

Bình thường penicillin có trọng lượng phân tử:313 đến 334 g / mol ( penicillin G).Penicillin với các nhóm phân tử đính kèm thêm có thế có một khối lượng phân tửkhoảng 500 g / mol

Tính chất hóa học:

Các penicillin có khả năng tạo muối natri và kali tan trong nước

Các penicillin cũng có khả năng tạo muối với các amin tạo penicillin thủy giảichậm

Các penicillin cũng có khả năng tạo ra các este

Tính không bền của vòng beta lactam:phân hủy trong môi trường kiềm

Sự alcol phân và amino phân: vòng beta lactam nhạy với một số tác nhân ái nhânkhác với xúc tác của các ion kim loại nặng: Cu2+, Zn2+, Sn2+

Sự phân huỷ trong môi trường acid

1.2.4 Vi sinh vật tổng hợp Penicillin.

1.2.4.1 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin nhờ nấm mốc P chrysogenum 1.2.4.1.1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum.

Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng các chủng

có hoạt lực cao thuộc loài P notatum và P baculatum Nhưng từ khi trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập được chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao hơn thì chủng

này dần dần đã thay thế và từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX đến nay tất cảcác công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng các biến chủng

P.chrysogenum công nghiệp.

Nhìn chung, quá trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinhcũng thường trải qua sáu giai đoạn cơ bản là:

- Phân lập từ thiên nhiên

- Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng " Siêu tổng hợp" có hoạt lực cao

- Tuyển chọn sơ bộ

- Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

- Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot

- Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớncông nghiệp

Trong các giai đoạn trên, bước tuyển chọn lại quy mô phòng thí nghiệm là công đoạntuyển chọn toàn diện và kỹ lưỡng nhất;

Mục tiêu của quá trình tuyển chọn tạo biến củng công nghiệp không chỉ dừng lại ởnăng lực siêu tổng hợp kháng sinh của chủng, mà còn định hướng đồng thời vào cácmục tiêu khác như: tạo ra các biến chủng tích tụ ít các sản phẩm không mong muốn,các biến chủng tổng hợp ra các sản phẩm hoàn toàn mới (nhất là các sản phẩm có cấutrúc và đặc tính mong muốn theo "thiết kế" của con người), các biến chủng rất nhạycảm với chất kháng sinh hay các chủng có sức đề kháng cao với những chất kháng sinhnào đó Việc tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp là công việc lâu dài và tiêu tốnrất nhiều nhân lực, đòi hỏi phải được tiến hành nghiêm túc, liên tục và thường xuyên.Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin trên nguyên tắccũng trải qua sáu giai đoạn cơ bản trên, trong đó giải pháp kỹ thuật đã được áp dụnghiệu quả để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại chính là các kỹ thuật gâyđột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím và tạo đột biến bằng hoáchất, thí dụ như Metylbis - amin (metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo-etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 - diepoxybutan

1.2.4.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P chrysogenum.

Theo quan điểm phổ biến hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc

P.chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α-aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ;

tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng β-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; rồi trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay

phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp

penicillin G trong hình 1.2

Hình 1.2: Cơ chế sinh tổng hợp penicillin GTrong 3 axit amin tiền chất trên thì cystein có thể được tổng hợp bằng một trong bacon đường là được tổng hợp từ xerin (hình 1.3), từ homoxerin với việc tuần hoànchuyển hóa α-cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 1.4), hay từ homoxerin với sự chuyển

hóa α- cetobutyrat qua izolecin Đồng thời α- aminoadipic được giải phóng ra trong sơ

đồ hình 4 có thể được tuần hoàn để tham gia quá trình ngưng tụ ban đầu

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

Hình 1.3: Tổng hợp cystein từ xerin

Hình 1.4: Tổng hợp cystein từ homoxerin với việc chuyển hóa α-cetobutyrat thànhoxaloacetat

Tuy nhiên, cũng có thể nó được giải phóng ra và tích tụ trong môi trường (vì trongquá trình lên men sản xuất penicillin V bao giờ cũng phát hiện thấy trong dịch lên men

lượng lớn α- aminoadipic dạng vòng) Như vậy, quá trình sinh tổng hợp penicillin, phụ

thuộc vào điều kiện lên men cụ thể nhất định, có thể xảy ra theo sáu đường hướng khácnhau Do đó, hiệu suất chuyển hoá cơ chất - sản phẩm cũng biến đổi và phụ thuộc vàođường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyết thì hiệu suất lên men sẽ trongkhoảng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, trong thực tế, với những chủng cóhoạt tính sinh tổng hợp cao nhất cũng mới chỉ đạt khoảng 200 UI/g glucoza

Hình1.5: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp α-aminoadipic

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

Hình 1.6: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp valin

1.2.4.2 Cải tiến trên vi sinh vật nhằm tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp penicillin.

Nhìn chung, quá trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinhthường trải qua sáu giai đoạn cơ bản: 1) Phân lập từ thiên nhiên 2) Nghiên cứu xử lýtạo các biến chủng " Siêu tổng hợp" có hoạt lực cao 3) Tuyển chọn sơ bộ 4) Tuyểnchọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm 5) Thử nghiệm vàtuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot 6) Thử nghiệm và chọn lọc lạicác chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn công nghiệp Trong các giaiđoạn trên, bước tuyển chọn lại quy mô phòng thí nghiệm là quan trọng nhất.[1]

15 năm sau khi Alexander Fleming phát hiện ra chủng P.chrysogenum (có tài liệu cho rằng chủng này là P.notatum [5, 17] hoặc P.ruben [10]) có khả năng sinh penicillin (1928), chủng P.chrysogenum NRRL 1951 có năng suất cao hơn được phân

lập tại Phòng nghiên cứu phía Bắc của Sở Nông nghiệp Mỹ (NRRL) ở Peoria, Illinois

từ quả dưa đỏ mốc Tất cả các chủng P.chrysogenum trên thế giới hiện nay đều là dẫn

xuất của chủng gốc NRRL1951 này, nhờ khuếch đại gen mã hóa cho sinh tổng hợppenicillin [11, 17] Cho tới nay, giải pháp kỹ thuật được áp dụng hiệu quả để thu nhậnbiến chủng siêu tổng hợp penicillin là các kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tiaRơnghen, xử lý tia cực tím, tạo đột biến bằng hóa chất như Metylbis - amin (metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat,1,2,3,4 - diepoxybutan.[18]

Nhờ kết hợp đột biến theo nhiều bậc đã đem lại thành công trong việc tạo ra chủng

P.chrysogenum E15-1 có sản lượng là 7000 mg/l [4] cao gấp nhiều lần so với chủng

NRL1951 ban đầu (hình 1.2) Trong đó các ký hiệu S - chọn lọc thường, X - xử lý tiaRơnghen, U (UV) - xử lý tia tử ngoại, NM, NG - xử lý với metylbis amin, DEB – xử lývới 1,2,3,4-dieboxybutal [1, 5] Bảng 1.1 cũng liệt kê ra một số loài có khả năng sinhpenicillin và sản lượng tương ứng, chủng siêu tổng hợp penicillin công nghiệp với sảnlượng lên tới 30-55 g/l cũng được tạo ra nhờ đột biến [12] Trong năm 2013 này, B M

Onyegeme-Okerenta và cộng sự cũng đã tạo được chủng P chrysogenum UVP1 và UVP2 có sản lượng cao gấp 70% so với dòng mẹ P chrysogenum (PCL 501) bằng

cách chiếu tia UV trong 20, 25 phút tương ứng; nghiên cứu này chỉ ra đột biến là một

hướng tốt để cải thiện các chủng P.chrysogenum [9]

Bảng 1.1: Một số loài có khả năng sinh Penicillin và sản lượng tương ứng [12]

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

Hình 1.7: Qúa trình đột biến và tuyển chọn chủng P.chrysogenum E15-1.[5]

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

1.2.4.3 Tối ưu hóa thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men tạo điều kiện cho vi sinh vật tổng hợp Penicillin nhiều nhất.

Thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện của quá trình lên men ảnhhưởng trực tiếp đến năng suất sản lượng penicillin trong sản xuất công nghiệp

Về cơ chất hay môi trường lên men, thay vì sử dụng glucose và lactose, các nghiên cứuhiện nay đang hướng tới những loại cơ chất rẻ tiền và thân thiện với môi trường nhưcác chất thải công nông nghiệp Đặc biệt, nghiên cứu được thực hiện bởi B MOnyegeme-Okerenta và cộng sự chỉ ra: việc bổ sung bã mía vào môi trường lên mencho sản lượng penicillin cao, sắn bào và hạt bắp cũng cho sản lượng penicillin cao hơn

so với glucose và lactose, mùn cưa cũng được nghiên cứu tuy nhiên cho sản lượngpenicillin thấp hơn so với sử dụng glucose hay lactose Các chất thải đô thị có nguồngốc thực vật cũng được xem như nguồn cacbon giá rẻ cho sản xuất penicillin [9, 16]

“Corn steep liquor (CSL)” – nguồn Nito cho P.chrysogenum [13]- chất thải của

công nghiệp sản xuất tinh bột ngô được sử dụng làm cơ chất trong công nghiệp để sản

xuất penicillin cho thấy năng suất cao đối với các chủng sản xuất P.chrysogenum [13,

14, 16] Theo báo cáo của R P Elander, bộ đậu nành và hạt bông cũng được sử dụng

như là nguồn Nito cho P.chrysogenum [13] Bên cạnh việc tìm ra nhũng nguồn cơ chất

rẻ tiền, cho năng suất sản xuất penicillin cao thì thay đổi trong công nghệ sản xuấtpenicillin cũng không kém phần quan trọng Bảng 1.2 nêu ra một số thay đổi trongcông nghệ sản xuất penicillin sau từ năm 1950 đến năm 2000

Bảng 1.2: Một số thay đổi trong công nghệ sản xuất penicillin (1950-2000) [13]

1.2.5 Các phương pháp sản xuất kháng sinh penicillin.

Hiện nay penicillin được sản xuất theo 2 phương pháp là lên men bề mặt và lên menchìm [8]

- Phương pháp lên men bề mặt: Trong những năm 30 đến 50 của thế kỷ XX,

phương pháp lên men bề mặt được áp dụng rộng rãi để sản xuất penicillin từ nấm

Penicillium chrysogenum, tuy nhiên hiện nay phương pháp này không còn được triển

khai trong sản xuất lớn nữa Lên men bề mặt gồm 2 phương pháp là lên men trênnguyên liệu rắn là các loại hạt hoặc cám có bổ sung đường lactose và lên men trên môitrường lỏng tĩnh chủ yếu là nước chiết ngô.[3][5][8]

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương

• Quá trình nhân giống:

Quá trình nhân giống bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm.Trong các nhà máy,người ta cấy làm 3 ống Một ống dùng kiểm tra trước khi sản xuất, một ống dùng đểsản xuất và một ống dùng để bảo quản.[3]

Môi trường nhân giống: giống với môi trường lên men nhưng không chứa lactose,một số khoáng chất và tiền chất.[3][8]

Trong công nghiệp để có đủ lượng giống cung cấp cho quá trình sản xuất phải tiếnhành nhân giống qua nhiều cấp, khối lượng môi trường qua mỗi cấp tăng từ 10 – 15lần Tùy theo quy mô của nhà máy mà có thể tiến hành nhân giống qua các cấp khácnhau cho đến khi đủ 5 – 10% giống cho sản xuất.[3][8]

• Qúa trình lên men

Đối với phương pháp lên men trên môi trường rắn: sau khi môi trường đã được

khử trùng và làm nguộn đến 300C, tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ 5 – 10%.Các khayđược xếp chồng lên nhau trên những giá đỡ có một khoảng cách nhất định để thoángkhí và thoáng nhiệt Quá trình lên men kéo dài 6 – 7 ngày ở nhiệt độ 24 – 28oC Ưuđiểm của phương pháp này là đường lactose được nấm mốc đồng hóa chậm nên khôngxảy ra hiện tượng dư thừa đường trong tế bào.[3][8]

Đối với phương pháp lên men trong môi trường lỏng: áp dụng công nghệ bổ sung

liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môitrường thường là 0.2 – 0.8 kg phenylacetic/ m3 dịch lên men Dung dịch lên men saukhi được khử trùng sẽ được phân phối vào các khay giống các khay nuôi cấy bề mặtvới môi trường rắn.Thời gian lên men là 6 -7 ngày, nhiệt độ lên men là 24 – 28 0C.Tiến hành lên men trong điều kiện môi trường lỏng này, lượng penicillin G được tổnghợp tăng lên rõ rệt còn hàm lượng các penicillin khác cũng giảm đi.[3]

Ưu điểm của phương pháp:[7]

-Dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường đơn giản

-Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so vớinuôi cấy chìm

-Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối VSV, enzyme

và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

-Không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũngnhư đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.

-Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý.Môi trường đặc là môitrường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực

đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ an toàn

Nhược điểm của phương pháp: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy.Quá trình lên men không cơ khí hóa và tự động hóa được.[7][8]

- Phương pháp len men chìm.

Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong những năm 1950 trở lại đây, thay thếdần phương pháp nuôi cấy bề mặt.[8]

• Quá trình nhân giống

Trong phương pháp này người ta nhân giống trong môi trường lỏng Mục tiêu củaquá trình nhân giống là thu được sô lượng tế bào cao Môi trường nhân giống nấm

Penicillium chrysogenum trong phương pháp lên men chìm cũng giống như môi trường

nhân giống trong phương pháp lên men bề mặt là không bổ sung đường lactose, một sốkhoáng chất và tiền chất[8]

Quá trình nhân giống bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ống nghiệm sang nhữngbình tam giác đã chứa sãn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào cácbình lên men dung tích từ 1 lít đến vài trăm lít Nhiệt độ trong quá trình nhân giốngduy trì ở khoảng 2610C và thời gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 720C.[3]

• Quá trình lên men

Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương pháp lên men chìm để sảnxuất pencillin trải qua hai pha: [3][8]

- Pha thứ nhất: hệ sợi phát triển rất mạnh, hay còn gọi là pha sinh khối Trong phanày các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào nấm men hấp thụ rất mạnh Tốc

độ sinh sản của nấm xay ra nhanh Sự tạo thành pencillin mới bắt đầu

- Pha thứ hai: hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần lên và đạt đến giá trị khoảng 7– 7.5 Trong pha này penicillin tạo ra với mức độ cực đại

Giống nấm Penicillium chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc Hơn nữa quá trình

tổng hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí nên trong suốt quá trình lên men,việc thổi khí là điều hết sức cần thiết

Nhiệt độ duy trì khoảng 2610C, pH 7 – 7.5, chế độ thổi khí 1.2 – 1.5 thể tích/lít/phút.[8]

Ưu điểm của phương pháp:[7][8]