phân tích vi sinh vật gây bệnh than

Khi vòng đời của vi khuẩn gặp nhân tố bất lợi ví dụ như vật chủ nó ký sinh chết hoặc là nhiệt độ môi trường thay đổi bất lợi, vi khuẩn chuyển thành dạng bào tử có tính ngủ đông để chờ cá

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH THAN

BACILLUS ANTHRACIS

Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Lương

Nhóm 9 Vũ Thị Lan

Vũ Văn Duy

I, Định Nghĩa

Bệnh than là bệnh nhiễm khuẩn cấp tính diễn ra ở gia súc (bò, cừu, dê ) do vi

khuẩn Bacillus anthracis gây ra, có thể truyền sang người, ở một vài dạng nó có độc tính rất cao Vi khuẩn than là một trong số ít những vi khuẩn có thể tồn tại rất lâu ở môi trường trong dạng bào tử Khi vòng đời của vi khuẩn gặp nhân tố bất lợi ví dụ như vật chủ nó ký sinh chết hoặc là nhiệt độ môi trường thay đổi bất lợi, vi khuẩn chuyển thành dạng bào tử có tính ngủ đông để chờ các vật chủ mới, tiếp tục vòng đời của mình

Sau khi thâm nhập (bào tử của vi khuẩn rơi vào vết thương vật chủ), các vi khuẩn hay bào tử này sẽ tự phục hồi hoạt động và nhân lên với một tốc độ rất nhanh Bào tử vi khuẩn than có sức sống rất cao, có thể tồn tại đến hàng thập kỷ thậm chí thế kỷ và được ghi nhận có mặt ở hầu khắp các lục địa (trừ Châu Nam Cực)

Bệnh than là bệnh của các loài động vật ăn cỏ như bò, dê, cừu… Đây là một trong những bệnh lâu nhất trên thế giới Bệnh lây nhiễm sang người khi tiếp xúc với động vật bị nhiễm bệnh, lông, da hay đất bị ô nhiễm

Đây không phải là bệnh truyền nhiễm và không lây từ người sang người Nguyên

nhân là do vi khuẩn Bacillus anthracis

II Lịch sử bệnh

Bệnh than phát hiện đầu tiên là ở Ai Cập, chúng gây chết hàng loạt gia súc Đến thế kỷ 17, xảy ra một đại dịch lớn ở Châu Âu gây chết rất nhiều người và động vật Vào thời điểm đó thì chưa ai tìm ra được nguyên nhân gây ra bệnh và cách phòng trị, vì thế mọi người đặt cho căn bệnh này với nhiều cái tên khác nhau như : "tai ương đen",

"bệnh Bradford", "mụn mủ ác tính", "bệnh của người nhặt giẻ", "bệnh của người xếp len"

Vào thế kỷ 19, Phát hiện bệnh than là do một loại vi khuẩn gây nên Năm 1850 người ta nhìn thấy nó trong máu một con cừu mắc bệnh sắp chết

Năm 1876 Robert Koch là người đã tìm ra vi khuẩn bệnh than đó chính là Bacillus anthracis, chúng đã tạo ra bào tử (là một tế bào mất nước với lớp vỏ dày và các lớp bổ sung khác ) bên trong nó để chống lại điều kiện bất lợi đặc biệt là thiếu ôxy,

và khi điều kiện thuận lợi trở lại, bào tử có thể trở lại thành trực khuẩn Năm 1881, trong cuộc thử nghiệm trên cánh đồng ở Pouilly-le-Fort, Pasteur đã tìm ra được vacxin

ngừa bệnh than đó là dung dịch cấy Bacillus anthracis nhưng chúng đã bị làm giảm độc

lực bằng cách ủ ở nhiệt độ 42-52oC

Và sau đó, vi khuẩn bệnh than được sử dụng làm vũ khí sinh học ở các nước phát triển như Nhật, Anh, Mỹ, Iraq và Liên Xô Chỉ 1 phần triệu gram bào tử vi khuẩn than

đủ gây chết người khi hít phải 1kg bào tử có thể giết chết hàng trăm ngàn người tại vùng trung tâm

III Mầm bệnh

Bệnh than khởi phát do nhiễm bào tử của B anthracis, một trực khuẩn Gram

dương Chúng thường đứng với nhau thành chuỗi, chung một vỏ bọc, như hình "đoạn tre"

Vi khuẩn than qua kính hiển vi Vi khuẩn than trong cơ thể con khỉ

B anthracis rất khó nhận biết trong điều kiện bình thường, tiềm lực mạnh, phát tán và

lây lan nhanh, không chỉ được sử dụng trong chiến tranh mà còn trong các hoạt động khủng bố Chính vì thế bào tử vi khuẩn bệnh than được một số nước dùng làm vũ khí

sinh học Tất cả những gen độc lực của B anthracis đều xuất phát từ sự nảy mầm của

bào tử trong cơ thể

IV, Cơ chế gây bệnh

Năm 1954, Keppie và Smith chứng minh được bệnh than gây ra chủ yếu bởi sự

nhiễm độc tố của vi khuẩn B anthracis Có 3 loại độc tố được tiết ra khi vi khuẩn

Bacillus anthracis xâm nhập cơ thể

 Kháng nguyên bảo vệ (PA) protective antigen

 Yếu tố gây phù (EF) edema factor.

 Yếu tố gây chết (LF) lethal factor

B anthracis sau khi xâm nhập vào cơ thể, Độc tố PA gắn vào màng tế bào và

hoạt hóa ly giải protein tạo thành phần tiếp nhận cho độc tố EF và LF chui vào bên trong làm tiêu hủy tế bào EF cùng với PA tạo thành độc tố gây phù (edema toxin) làm sưng phù và ngăn cản không cho các bạch cầu của cơ thể tới để diệt vi trùng LF và PA tạo thành độc tố gây chết (lethal toxin)

Ðộc tố gây chết là yếu tố độc lực và là nguyên nhân chủ yếu gây chết động vật bị nhiễm Sự sản xuất các độc tố được điều hòa bởi 1 plasmid và sự tạo nang bởi plasmid thứ 2 (pXO1 và pXO2)

Sau đó, Chúng đến cư trú, nhân lên và gây tổn thương (phù nề, hoại tử ) các hạch lympho trong khu vực Các vi khuẩn thoát khỏi sự chống đỡ của cơ thể, từ hạch lympho theo đường bạch huyết và máu đến các cơ quan của cơ thể và gây bệnh

Cơ chế gây bệnh được miêu tả như sau:Bào tử bacilus antharacis thâm nhập vào lớp

dưới da , niêm mạc tiêu hóa , hoặc khoang phế nang Trong thể bệnh ở da và đường tiêu hóa, tại vị trí ban đầu này bào tử nảy mầm ở mức độ thấp gây phù và hoại tử tại chỗ Bào tử bị tấn công bởi đại thực bào và nảy mầm Đại thực bào chứa vi khuẩn di chuyển đến hạch bạch huyết khu vực Trực khuẩn than phát triển trong hạch gây viêm bạch hạch xuất huyết Vi khuẩn than lan truyền theo máu và bạch huyết và tăng sinh gây nhiễm khuẩn huyết nặng Ngoại độc tố được tiết ra với nồng độ cao gây các triệu chứng rầm rộ và tử vong Một số trường hợp nhiễm khuẩn toàn thân có thể dẫn đến viêm màng não

Trong thể hô hấp,viêm bạch hạch xuất huyết quanh phế quản làm tắc nghẽn dẫn lưu bạch huyết dẫn đến phù phổi Bệnh nhân có thể chết khi tiếp xúc với mầm bệnh từ

1 đến 7 ngày

Hình ảnh nhỏ trên hình cho thấy ảnh hưởng của độc tố bệnh than trên đại thực bào,trực khuẩn than tiết ra hai loại độc tố tác động trên tế bào ký chủ Toxin gây phù là

1 andenat cực lase lệ thuộc calmodulin làm tăng nồng độ Amp vòng

V Phương pháp xác định bệnh

1 Phương pháp nuôi cấy và phân lập

* Cơ sở thực hiện nuôi cấy

Bacillus anthracis là một trực khuẩn Gram dương lớn, sinh nha bào, không di

động Trên phết nhuộm từ mô bệnh, vi khuẩn đứng đơn hay thường sắp xếp thành chuỗi ngắn, nang polypeptid có thể trông thấy bằng cách nhuộm Giemsa, mực Tàu, hay polychrome methylene blue Trong cơ thể động vật vi khuẩn không tạo nha bào Khi để vi khuẩn ra ngoài không khí thì sự sinh nha bào bắt đầu xảy ra, tốc độ tùy thuộc vào nhiệt độ và điều kiện khác của môi trường

Vi khuẩn mọc tốt trên môi trường bình thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, không tiêu huyết Khúm của dòng độc lực thì xám trắng, hơi thô ráp, bờ hơi uốn lượn không tròn đều Phết nhuộm cho thấy vi khuẩn hình que thẳng, xếp thành chuỗi dài Nang chỉ được thấy nếu môi trường cấy chứa 0,7% bicarbonate hoặc 5% huyết thanh và ủ trong khí trường có 5-10% CO2, khi đó khúm trơn láng và nhày Vào cuối thời kỳ tăng trưởng lũy thừa, nha bào bắt đầu xuất hiện trong nuôi cấy và rất nhiều sau 48 giờ Nha bào hình bầu dục, nằm giữa hay gần một đầu tế bào vi khuẩn và không làm phồng tế bào Nha bào đề kháng cao với nhiệt, lạnh, khô, tia cực tím, pH cao hoặc thấp, hóa chất tẩy uế và sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn khác

* Dụng cụ nuôi cấy: thuốc nhuộm, nước muối sinh lý, các ống thạch nghiêng nuôi cấy ,ống nghiệm đựng nước cất vô trùng, lame ,que cấy , đèn cồn ,diêm quẹt, bình đựng nước rửa tiêu bản,cốc thủy tinh,kính hiển vi,dầu soi kính và 2 que tăm bông lây bệnh phẩm

* Môi trường nuôi cấy : thạch dinh dưỡng, thạch máu

* Thao tác nuôi cấy ,phân lập vi khuẩn than

-Quy tắc thực hiên:

Nếu nghĩ đến bệnh than, tất cả bệnh phẩm và nuôi cấy vi khuẩn phải được xử

lý và xem xét hết sức cẩn thận trong phòng cách ly có trang bị tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 Tủ an toàn phải đảm bảo vận hành tốt, nhất là luồng không khí lưu thông,

tủ phải được lau chùi sạch bằng dung dịch tẩy uế trước và sau khi sử dụng Hạn chế người vào ra phòng này nếu không được phân công Thay giày, áo choàng trước khi vào phòng

Mọi thao tác phải tránh tạo ra những hạt khí dung nhiễm khuẩn Nhân viên xét nghiệm phải mặc áo choàng, mang khiên che mặt (hoặc ít nhất phải có khẩu trang, kính bảo vệ mắt) và găng lúc thao tác với bệnh phẩm Không nhất thiết chủng ngừa cho nhân viên

Khi xong việc, mọi dụng cụ đã dùng phải hấp tiệt trùng, các bề mặt tủ an toàn

và bàn xét nghiệm phải được tẩy uế Những vật lấy ra khỏi tủ an toàn như phiến phết

để soi kính hiển vi cũng phải thực hành cẩn trọng Các dụng cụ bị nhiễm như pipét, kim, lam kính, phải được ngâm trong dung dịch tẩy uế trước khi đem đi hấp Trong trường hợp huyền dịch chứa vi khuẩn tràn ra bề mặt thì phải phủ dung dịch tẩy uế lên ít nhất là 5 phút đối với bệnh phẩm có mật độ nha bào thấp và ít nhất là 1 giờ đối với bệnh phẩm có mật độ nha bào cao trước khi làm sạch Người làm sạch cũng phải mang áo choàng, găng, kính và khẩu trang khi làm sạch

Dung dịch tẩy uế được dùng là hypochlorite 0,5% (tức nước Javel pha loãng 1/10) hay phenol 5%

-Lấy bệnh phẩm

+Bệnh than thể da

Giai đoạn mụn nước: Vi khuẩn được phát hiện nhiều nhất trong giai đoạn này

Dùng 2 que tăm bông khô ấn vào mụn nước chưa vỡ và thấm dịch chảy ra gởi đến phòng thí nghiệm

Giai đoạn loét hoại tử: Dùng hai que tăm bông xoay qua lại ở rìa hay bờ dưới của

vết loét nhưng không lấy mảng loét

+Bệnh than thể tiêu hoá

Bệnh phẩm thường là mẫu phân của bệnh nhân Tuy nhiên trong giai đoạn trễ cấy máu có thể phát hiện vi khuẩn nếu như trước đó chưa dùng kháng sinh

+Bệnh than thể hô hấp

Bệnh phẩm thường là đàm Tương tự như trên, trong giai đoạn muộn, cấy máu có thể phát hiện vi khuẩn nếu như kháng sinh chưa được dùng

-Qui trình nuôi cấy

Phải đảm bảo an toàn

Như đã nêu ở trên, tất cả thao tác với bệnh phẩm phải thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2

Xử lý bệnh phẩm và nuôi cấy

Dùng 2 que tăm bông, 1 để cấy và 1 dùng để nhuộm Gram

Dịch não tuỷ được ly tâm 1500 vòng/ phút trong 15 phút Lấy cặn cấy và nhuộm Gram

Ba môi trường cấy thường được dùng là thạch máu cừu, thạch MacConkey (MC) và môi trường tăng sinh lỏng (tryptic soy broth hoặc thioglycollate) Riêng đối với bệnh phẩm phân thì không dùng môi trường tăng sinh; có thể loại trừ ngoại nhiễm trên môi trường phân lập dựa vào tính đề kháng nhiệt hoặc ethanol của nha bào

Các môi trường cấy được ủ ở 35-370 C trong điều kiện khí trường bình thường Xem xét các hộp thạch sau 18-24 giờ

- Ðặc điểm nhận dạng vi khuẩn than trên môi trường cấy

Quan sát vi thể

Trên phết nhuộm Gram, B anthracis là trực khuẩn Gram dương lớn đầu vuông

đường kính 1-1,5 x 3-5 mm xếp thành chuỗi Trên các phết nhuộm trực tiếp từ bệnh phẩm thường không thấy nha bào nhưng lại thấy nang Ngược lại nha bào thường thấy ở các lứa cấy ủ trong khí trường CO2 còn nang thì lại không thấy ở phết nhuộm

vi khuẩn từ thạch máu ủ bình thường Nha bào hình bầu dục, nằm giữa hay gần một đầu tế bào vi khuẩn và không làm phồng tế bào.Khi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng với 5% CO2 hoặc nuôi cấy trong các môi trường cơ bản khác có cho thêm 0,7% sodium bicarbonat, dòng vi khuẩn độc lực sẽ xuất hiện dưới dạng là các trực

khuẩn có nang Nang này có thể thấy được bằng phương pháp nhuộm mực Tàu

Hình dạng khúm khuẩn

Vi khuẩn mọc tốt trên môi trường bình thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu

nhưng không mọc được trên MC Khác với các loại Bacillus khác, B anthracis không tiêu huyết trên thạch máu Khúm B anthracis phẳng hoặc hơi lồi Khúm của dòng độc

lực thì xám trắng, hơi thô ráp, bờ không đều, có hình dạng giống "đầu sứa" hoặc dạng kính mờ Nếu dùng que cấy nâng một góc khúm khuẩn lên thì phần còn lại của khúm khuẩn cũng được nâng lên theo giống như lòng trắng trứng, đó là đặc tính kết dính của khúm khuẩn

Định danh B anthracis

Ðịnh danh B anthracis trong phòng xét nghiệm dựa theo các tiêu chuẩn sau:

- Khúm khuẩn phẳng bờ không đều (dạng kính mờ, dạng đầu sứa), không tiêu huyết trên thạch máu

- Trực khuẩn Gram dương, có nha bào ở giữa xếp thành chuỗi giống "cây tre",

có nang

- Không di động

- Tiết lecithinase, catalase

- Thử nghiệm với 0,5-10U/ml Penicillin cho hình ảnh "chuỗi ngọc trai"

-Không mọc được trên môi trường Phenylethyl alcohol (PEA)

Có thể hỗ trợ định danh bằng các test kit API, Plainview, NY hoặc nhuộm kháng thể huỳnh quang chuyên biệt

Ngoài ra còn dùng các phương pháp thử nghiệm khác như:

+Tạo nang trên môi trường thạch bicarbonate

+Phân tích acid béo tế bào vi khuẩn bằng sắc ký khí

+Gửi dòng phân lập đến labô chuẩn thức (reference laboratory) làm thử nghiệm nhạy cảm với g-phage

2, Phương pháp huyết thanh chuẩn đoán và test da của bệnh than

Dùng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể kháng độc tố Chẩn đoán huyết thanh học dương tính khi khi hiệu giá kháng thể giữa giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục cách nhau 4 tuần tăng gấp 2 lần hoặc hiệu giá kháng thể 1 lần duy nhất >1/32

Test da chẩn đoán bệnh than được đánh giá bởi Liên bang Xô Viết trước đây như là biện pháp thay thế cho chẩn đoán vi khuẩn học bệnh than ở người (có thể chỉ 10-40% ca trong vòng 3 tuần đầu của bệnh) Phản ứng da với kháng nguyên anthraxcin: tiêm trong da 0,1ml kháng nguyên chiết suất từ màng ngoài của vi khuẩn

(anthraxcin) Nếu có miễn dịch với bệnh than thì tại chỗ tiêm nổi quầng đỏ đường kính >3cm

Vì vậy test da dường như là một phương pháp có giá trị trong chẩn đoán sớm bệnh than cấp tính đồng thời là biện pháp duy nhất có sẵn để chẩn đoán hồi cứu bệnh than

ở người

VI Triệu chứng

1 Bệnh than ngoài da

Chiếm 95% các trường hợp nhiễm bệnh than, thường do tiếp xúc với động vật mắc bệnh Vị trí tổn thương thường ở đầu cổ, các chi Tổn thương ban đầu trên da có dạng sẩn ngứa, không đau, xuất hiện sau khi nhiễm bào tử 3-5 ngày Trong vòng 24-36 giờ, sẽ trở thành dạng bọng nước, bị hoại tử ở giữa, rồi khô đi để lại một vảy mục màu đen đặc trưng kèm phù chung quanh với những bọng nước đỏ tím

Nếu loét hoại tử có mủ, đau và bệnh nhân bị sốt chứng tỏ có bội nhiễm, thường

là do tụ cầu hoặc liên cầu khuẩn (Edwards MS, 1992) Phù ở mặt, cổ thường lan rộng hơn so với phù ở thân hoặc các chi Phù ác tính là biến chứng hiếm xảy ra, nhưng có thể

gặp ở vùng cổ hoặc ngực kèm triệu chứng sốc và gây khó thở Nhuộm Gram phát hiện được trực khuẩn ở mô dưới da

2 Bệnh than đường tiêu hóa và họng-thanh quản

Bệnh than đường tiêu hóa một thể bệnh nặng Sau khi ăn thịt động vật mắc bệnh

có chứa bào tử, có thể xảy ra các triệu chứng sốt, đau bụng lan tỏa kèm hồi ứng (rebound tenderness), táo bón hoặc tiêu chảy Phân có màu bã cà phê hoặc lẫn máu Sau khi khởi phát 2-4 ngày, có thể xuất hiện cổ trướng kèm với giảm đau bụng Dịch cổ

trướng có thể trong hoặc có mủ và khi cấy hoặc nhuộm Gram có thể phát hiện được B.

anthracis Khảo sát mô học có thể thấy trực khuẩn ở mô bạch huyết trong niêm mạc

hoặc dưới niêm mạc ở vùng tổn thương; niêm mạc bị phù, hoại tử và thâm nhiễm tế bào viêm Bệnh nhân chết do thủng ruột hoặc nhiễm độc ngoại độc tố Nếu vẫn sống sót, triệu chứng thường lui dần trong vòng 10-14 ngày (Alizad A et al., 1995)

Thể họng-thanh quản ít gặp hơn thể tiêu hóa, nhưng cũng do nuốt phải bào tử bệnh than Những triệu chứng ban đầu gồm phù nề và sưng hạch bạch huyết vùng cổ, nuốt đau và khó thở Có thể nhìn thấy tổn thương ở họng dưới dạng vết loét có màng giả Thể bệnh này nhẹ hơn thể tiêu hóa

3 Bệnh than đường hô hấp

Thể bệnh này hiếm gặp trong tự nhiên nhưng có thể có tần suất cao trong trường hợp bào tử bệnh than được dùng làm vũ khi sinh học Khi bào tử bệnh than được dùng dưới dạng khí dung, nó có thể lan xa trong khí quyển và thâm nhập vào đường hô hấp

và gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao Mặc dù phổi là nơi nhiễm bào tử, nhưng bệnh than đường hô hấp không phải là viêm phổi thực thụ Ða số trường hợp không có dấu hiệu viêm ở phổi Trái lại, bào tử được đại thực bào phế nang bắt giữ và được đưa đến hạch bạch huyết quanh phế quản và hạch trung thất Tại đây, chúng sẽ nảy mầm và trực

khuẩn B anthracis tăng sinh trong hạch bạch huyết, gây viêm bạch hạch xuất huyết, và

lan đi khắp cơ thể bằng đường máu Thời gian ủ bệnh ghi nhận được trong vụ dịch Sverdlovsk khoảng 10 ngày, nhưng triệu chứng có thể khởi phát muộn sau khi tiếp xúc đến 6 tuần Thời gian ủ bệnh càng dài khi số lượng bào tử bị nhiễm càng ít Triệu chứng lâm sàng ban đầu gần giống nhiễm siêu vi đường hô hấp trên với sốt, ho khan, đau cơ, mệt mỏi X-quang lồng ngực từ đầu có thể thấy rộng trung thất (do viêm bạch hạch xuất huyết) và tràn dịch màng phổi Sau 1-3 ngày, bệnh trở nặng với khó thở, ho the thé, rét run dẫn đến tử vong

4 Thể viêm màng não

Ðây là một biến chứng hiếm gặp Ðường xâm nhập của trực khuẩn thường thấy nhất là qua da, nhưng cũng có thể xảy ra với thể bệnh ở đường tiêu hóa và ở phổi Bệnh nhân hấu như sẽ tử vong trong vòng 1-6 ngày sau khi khởi phát, tuy được điều trị kháng sinh tích cực Một số ít trường hợp sống sót được báo cáo khi điều trị phối hợp kháng độc tố, pednisone hoặc với cả hai

Ngoài các triệu chứng điển hình như viêm màng não mủ, còn có triệu chứng đau

cơ, kích động, co giật hoặc mê sảng Tình trạng thần kinh suy sụp nhanh và sau đó là tử