Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phản nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển đồ sơn

Một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitơ có khả năng khử đạm denitrifying bacteria dưới dạng thức ăn thừa hoặc phân cá, tôm giúp giảm lượng nitrate, ammonium gây ô nhiễm nguồn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG

VIỆN SINH - NÔNG

*****

HỌ VÀ TÊN : VŨ THỊ VÂN ANH LỚP: KSNTTS K12 KHÓA : 2011 - 2015

TÊN ĐỀ TÀI: Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phản

nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản

BÁO CÁO ĐỀ CƯƠNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Giáo viên hướng dẫn: 1.Ts Đỗ Mạnh Hào

2 Ths Mai Thị Yến

Học viên thực hiện: Vũ Thị Vân Anh

MỞ ĐẦU

Nước ta có bờ biển dài với hệ thống kênh rạch chằng chịt rất thuận lợi cho nghề phát triển nuôi trồng thủy sản, trong đó nghề nuôi tôm đóng góp một phần không nhỏ vào sự phát triển của ngành Sản lượng tôm không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu ra nước ngoài và góp phần quan trọng vào tăng trưởng kinh tế cho đất nước (7.662 triệu USD/8 tháng 2004)

Trong nuôi trồng thủy sản, các điều kiện vật lý, hóa học và sinh học của môi trường ao nuôi có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe và khả năng sản xuất của tôm

Sự tiếp xúc của tôm với các độc tố như H2S, NH3, CO2 dễ làm tôm bị stress và từ

đó mang bệnh Các chất thải trong ao nuôi tôm bao gồm: (1) thức ăn dư thừa và phân; (2) các sản phẩm phụ trong quá trình trao đổi chất; (3) tồn dư các chất diệt khuẩn như kháng sinh; (4) các chất thải có nguồn gốc từ phân bón; (5) các chất thải trong quá trình lột vỏ tôm; (6) tảo bị chết

Các hướng nghiên cứu hiện tại hướng đến việc nâng cao chất lượng nước ao nuôi bằng cách sử dụng các enzyme hoặc chế phẩm sinh học chứa các nhóm vi sinh vật có lợi vào trong ao nuôi, gọi là “xử lý sinh học” Khi các vi sinh vật và các sản phẩm của chúng được sử dụng để cải thiện chất lượng nước, chúng được gọi là tác nhân xử lý sinh học Kết quả là làm giảm sự tích tụ của các chất cặn bã và bùn đáy, làm tăng lượng oxy hòa tan trong nước ao nuôi Do đó, việc sử dụng các chủng vi sinh có khả năng oxy hóa mạnh các nguồn sulfide nhằm làm giảm hàm lượng H2S; tối ưu hóa việc khoáng hóa nguồn carbon thành CO2 nhằm làm giảm lượng bùn đáy; tối ưu hóa để kích thích sản xuất tôm ở từng mùa vụ nuôi; duy trì cộng đồng vi sinh ổn định và đa dạng nhằm hạn chế sự phát triển ưu thế của các vi sinh vật không mong muốn

Quá trình khử đạm là một trong những quá trình rất quan trọng trong xử lý nước, được xem là một cách loại thải ammonia và nitrate thừa trong môi trường và kích thích sự loại trừ cacbon khi sự sục khí gặp khó khăn Trong xử lý nước thải,

sự loại thải hợp chất đạm có thể được thực hiện bởi sự kết hợp của quá trình nitrate hóa (oxi hóa ammonia thành nitrate) và quá trình khử nitrate (khử nitrate thành

N2O hoặc N2) Điều này đòi hỏi hoạt động phối hợp hoặc nối tiếp của các nhóm vi sinh vật khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn khử nitrate (Lee và các cộng sự (2002))

Một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitơ có khả năng khử đạm (denitrifying bacteria) dưới dạng thức ăn thừa hoặc phân cá, tôm giúp giảm lượng nitrate, ammonium gây ô nhiễm nguồn nước, cải thiện chất lượng nước ao nuôi, góp phần thực hiện nuôi thủy sản bền vững Ngoài ra, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử sẽ giúp nhận diện vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính

xác.Do vậy, thực hiện đề tài “Tổng hợp một số loài vi sinh vật có khả năng phản

nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn” là hết sức cần thiết

1.2 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

- Mục tiêu chung: Phân lập được một số chủng vi sinh vật phản nitrate từ ao nuôi tôm vùng ven biển Kết quả của việc nghiên cứu sẽ góp phần vào việc giải quyết vấn đề ô nhiễm đạm trong nước ở ao nuôi tôm

- Mục tiêu cụ thể:

+ Học tập được các phương pháp cơ bản trong nghiên cứu vi sinh vật + Có được một số chủng vi sinh vật phản nitrate phân lập từ các ao nuôi tôm ven biển Đồ Sơn

Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo tốt cho các công trình nghiên cứu tiếp theo về lựa chọn, phân lập các chủng vi sinh vật phản nitrate trong nước

- Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng quy trình lựa chọn các một số chủng vi sinh vật

1.2.2 Nội dung

- Phân lập một số chủng vi khuẩn phản nitrate trong trầm tích thu từ các ao nuôi tôm ven biển

- Thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phản nitrate từ các mẫu thu được

- Bước đầu đánh giá tiềm năng khử nitrate của khu hệ vi sinh vật bản địa trong khu vực nuôi trồng thuỷ sản nước lợ khu vực cửa sông Lạch Tray, Hải Phòng

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 HIỆN TRẠNG NUÔI TÔM HIỆN NAY VÀ CÁC CHẤT Ô NHIỄM NITƠ TRONG ĐẦM NUÔI THỦY SẢN NƯỚC LỢ

Trong khoảng 2 thập niên gần đây, chúng ta đang chứng kiến ngành nuôi trồng thuỷ sản đặc biệt là ngành nuôi trồng thuỷ sản nước lợ đang phát triển với tốc độ rất nhanh xét cả về quy mô và phương thức nuôi trồng Giai đoạn từ 1990 đến

2000, nhà nước mở rộng diện tích nuôi được tiến hành chủ yếu trên các vùng ngập nước ven biển, trong các thủy vực nước mặn ven biển, trên các vùng cát trũng ven biển miền Trung và một phần diện tích từ canh tác nông nghiệp kém hiệu quả Giai đoạn sau là giai đoạn chuyển dịch từ hình thức nuôi quảng canh là chủ yếu sang hình thức nuôi thâm canh và công nghiệp

Tuy nhiên, việc phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước lợ đặc biệt là nuôi tôm công nghiệp với tốc độ quá nóng trong thời gian qua đã và đang gây ra những hệ quả tiêu cực cho sự phát triển bền vững của ngành và những tác động tiêu cực đến môi trường sinh thái xung quanh Nước và trầm tích từ ao nuôi thường có hàm lượng các chất ô nhiễm, dư lượng chất kháng sinh và các vi sinh vật gây bệnh tiềm tàng rất cao đã tạo điều kiện môi thuận lợi cho các nhân tố gây bệnh bùng phát làm tôm chết hàng loạt Theo ước tính của Colt (1986) thì cứ 1kg thức ăn có thể sinh ra 0,28 kg CO2, 0,03 kg N-NH4, 0,3 kg TSS và tiêu tốn 0,2 kg ôxy Theo ước tính của Dierberg & Kattisimkul (1996), tổng lượng chất thải sinh ra trong mỗi hecta sau một vụ nuôi được ước tính có thể đạt 321 kg phốt pho tổng, 668 kg nitơ tổng và 215.000 kg tổng chất rắn lơ lửng Hầu hết các khu vực nuôi tôm công nghiệp đều không có hệ thống xử lý chất các chất ô nhiễm, nguồn chất thải từ đầm nuôi thường bị thải trực tiếp ra môi trường xung quanh dẫn đến nhiều hệ sinh thái ven biển bị suy thoái nghiêm trọng,

Trong quá trình nuôi tôm, các chất ô nhiễm nitơ vô cơ (TAN, NO2 và N-NO3) được tích luỹ dần do sự bài tiết trực tiếp từ đối tượng nuôi, phân huỷ thức ăn

dư thừa hay sẵn có từ nguồn nước cấp vào đã nhiễm các hợp chất nitơ TAN và nitrite là độc tố đối với các đối tượng nuôi, bởi nó có thể gây ra hiệu ứng cấp tính

và kinh niên dẫn đến giảm khả năng đề kháng bệnh và sinh trưởng của vật nuôi Theo Chin & Chen (1987), nồng độ NH3 là 0,09 mg/L có thể làm giảm sinh trưởng, tại nồng độ 0,1 mg/L có thể gây chết tôm (Chin & Chen, 1987; Boyd, 2000) N-NO2 có thể ảnh hưởng đển sức khỏe của tôm trong dài hạn tại nồng độ thấp đến 0,45 mg/L (Gross & cs., 2004) Nitrate không gây độc trực tiếp đối với vật nuôi nhưng sự có mặt của nitrate với nồng độ cao sẽ kích thích sự nở hoa của tảo, có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vật nuôi như cá chình (Kamstra & van der Heul, 1998), mực (Hyrayama, 1996), cá hồi (Berka & cs., 1981) và tôm (Muir & cs., 1991)

Hình 1 Chu trình nitơ trong đầm nuôi tôm ven biển

2.2 KHÁI QUÁT VỀ CHU TRÌNH NITƠ VÀ VI KHUẨN PHẢN NITRATE 2.2.1 Chu trình chuyển hoá nitơ sinh học trong đầm nuôi thuỷ sản nước lợ

Chu trình nitơ là một trong những chu trình quan trọng nhất của hệ sinh thái bởi nitơ là nguyên tố chính cấu thành các hợp chất hữu cơ quan trọng của sự sống như protein và axit nucleic Trong nhiều hệ sinh thái tự nhiên, nitơ thường là nguyên tố cần thiết cho sự sống của sinh vật do nguồn cung cấp nitơ giới hạn có thể làm giảm năng suất sơ cấp của hệ sinh thái Trong một số hệ sinh thái khác như

hệ sinh thái đồng ruộng canh tác nông nghiệp, sông ngòi và ven biển, do chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các hoạt động của con người mà nguồn nitơ trong các hệ sinh thái này thường dư thừa (eutrophication) và có ảnh hưởng tiêu cực đến sự cân bằng của hệ sinh thái

Hình 2 Chu trình nitơ vi sinh vật trong hệ sinh thái tự nhiên

Các nhóm vi khuẩn mới được phát hiện bao gồm nhóm vi khuẩn lam đơn bào

cố định khí nitơ (unicellular N2 fixing cyanobacteria), nhóm vi khuẩn ôxy hoá nitrite quang tự dưỡng (phototrophic nitrite oxidation), nhóm vi khuẩn phản nitrate hoá phụ thuộc CH4 (CH4-dependent denitrification), nhóm vi khuẩn khử N2O (N2O reduction), nhóm vi khuẩn cổ ôxy hoá ammonia hiếu khí (archaeal NH3 oxidation), nhóm vi khuẩn ôxy hoá ammonia kị khí (anammox)

Trong tự nhiên có hai loại khử nitrate:

- Quá trình đồng hoá (ammonia hoá nitrate) tức là quá trình khử nitrate thành

ammonia, quá trình này xảy ra ở một số vi khuẩn như Bacillus , E coli,

Aerobacter

- Quá trình dị hoá (phản nitrate hoá) là quá trình khử nitrate hoặc nitrite thành nitơ phân tử

Hai quá trình khử nitrate này có chung giai đoạn đầu

Quá trình khử nitrate thành khí nitơ là quá trình phản nitrate hoàn toàn Mức độ ôxy hoá của các hợp chất trung gian trong quá trình phản nitrate hoá như sau:

NO3- → NO2- → NO → N2O → N2 Quá trình phản nitrate xảy ra chủ yếu do nhóm vi sinh vật dị dưỡng trong điều

kiện kị khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện và có chuỗi hô hấp hoàn chính, chúng phân bố

rộng rãi trong tự nhiên Chúng gồm một số đại diện như Pseudomonas,

Alcaligenes, Azospirillum, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Propionibacterium, Achromobacter, Micrococcus, Paracoccus, Bacillus v.v Ngoài ra còn một số vi

khuẩn lưu huỳnh cũng có khả năng này như Thiobacillus denitrificans, Sulfomonas

denitrificans Bên cạnh các vi khuẩn dị dưỡng còn có các vi khuẩn tự dưỡng như Thiobacillus denitrificans hoặc tự dưỡng không bắt buộc khác Các vi khuẩn này là

các vi khuẩn kị khí tuỳ tiện trong môi trường đủ ôxy các vi khuẩn phản nitrate hoá ôxy hoá các hợp chất hữu cơ giống như vi khuẩn hiếu khí bình thường, khi môi trường thiếu ôxy chúng mới tiến hành khử nitrate

Quá trình phản nitrate hoá có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí tùy tiện, nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện thiếu ôxy Các vi khuẩn phản nitrate hoá là các tác nhân có hại cho sản xuất nông nghiệp vì làm mất một lượng lớn chất đạm

vô cơ ở dạng NO3- dành cho thực vật Tuy nhiên, chúng lại là tác nhân quan trọng trong xử lý nước thải và nước sinh hoạt vì chúng loại bỏ nguồn nitơ liên kết đối với môi trường sinh thái

Cần chú ý một tới một số loài vi khuẩn như Alcaligens, Escherichia,

Aeromonas, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia, Spirillum, Staphylococcus và Vibrio, chúng chỉ chuyển hoá NO3- thành NO2- và do đó gây độc cho nguồn sử dụng

Ngoài ra nitrate và nitrite thường tồn dưới dạng muối của các kim loại kiềm và kiềm thổ Trong quá trình phân giải các muối kali, natri, canxi v.v Các muối cacbonat và kiềm được tạo thành Vì thế, quá trình phản nitrate hoá thường kèm theo sự kiềm hoá môi trường

Độ pH tối ưu cho quá trình phản nitrate xảy ra là từ 6,0 – 8,0

2.2.2.Sơ lược về một số vi khuẩn khử đạm:

- Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí gram âm, tồn tại ở dạng đơn,

bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực Là vi

khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng P aeruginosa có thể phát triển trong môi trường

kỵ khí nếu có NO3-làm chất nhận điện tử, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC Loài

này tăng trưởngđược trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một

nguồn carbon thích hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose,… P

aeruginosa có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrate, oxidase…Khuẩn lạc

của P aeruginosa có ba dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng hoang dại

phân lập từ đất, nước; (2) khuẩn lạc to, trơn, rìa phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có dạng nhầy (được phân lập từ bệnh phẩm) (Trần Linh Thước, 2003) Nhóm vi khuẩn này phân bố rộng rãi và được tìm thấy chủ yếu trong đất, nước

- Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn khử đạm không có sắc tố huỳnh quang của

giống Pseudomonas Tế bào vi khuẩn hình que, gam âm, di chuyển bằng

chiênmao đỉnh, có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử, có thể tăng trưởng trong maltosevà tinh bột (Bennasar và các cộng sự, 1998; Sikorski và các cộng sự, 1999) Cho phản ứng dương tính với kiểm tra catalase và oxidase Nó được phân lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri và Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus

denitrificans II, sau đó được đổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen (Van Niel và Allen, 1952) Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có dạng không

bình thường và độ sệt thay đổi theo thời gian, có khuẩn lạc thì khô cứng và gắn kết chặt, có nếp gấp, có khuẩn lạc có màu trắng đục hay màu vàng nhạt (Van Neil và Allen, 1952; Lalucat và các cộng sự, 2006)

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC

Năm 1983, Curtis đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng khử nitrate của

ba loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas

paracoccus, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, nhưng tốc

độ tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khác nhau Sản phẩm sinh ra

của quá trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn P

stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N2, P aeruginosa và P

paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là khí NO2 Vi khuẩn P.stutzeri và P

Paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO3-, NO2-, NO2 và vi khuẩn này

có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện của NO2 trong môi trường

Những nghiên cứu tiếp theo của Holmes (1986) và Rosello và các cộng sự

(1991) đã phân lập được tổng cộng 49 dòng P stutzeri Chúng được phân lập từ

các mẫu bệnh lý, bùn biển và trong hệ thống nước thải

Những nghiên cứu đầu tiên về cơ sở phân tử và sinh học tế bào của sự khử đạm được biết đến là mô tả kích thước gen và bản đồ gen của vi khuẩn khử đạm; những đặc tính và cấu trúc enzyme khử nitrite, nitric oxide, nitrous oxide; các dòng Pseudomonas khử đạm; độ đa dạng của vi khuẩn khử đạm Nghiên cứu này do Zumft thực hiện năm 1997

Sự xuất hiện của kỹ thuật PCR (Kary Mulis, 1985) đã hỗ trợ rất nhiều trong việc nhận diện các dòng vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác Vì thế những nghiên cứu sau này tập trung vào các đoạn gen mã hóa cho tính khử đạm Điển hình có Braker cùng đồng nghiệp (1998) đã nghiên cứu phát triển hệ thống các cặp mồi chạy PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa quá trình khử nitrite (nirK và nirS) để phát hiện vi khuẩn khử đạm trong mẫu môi trường thu được (bùn hoạt động của hệ thống xử lý nước thải ở Đức) Gen nirK đã được khuếch đại từ

Blastobacter denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans và Alcaligenes sp.

(DM 30128); gen nirS được khuếch đại từ Alcaligenes eutrophus DSM 530 và từ

chủng khử đạm IFAM 3698 Với mỗi gen, ít nhất một mồi phối hợp đã khuếch đại thành công đối với tất cả các chủng trong thí nghiệm Cặp mồi nirK1F-nirK5R và nirS1F-nirS6R được dùng trong PCR cho kết quả như mong đợi với các chủng vi khuẩn khử đạm có mang gen tương ứng nirK và nirS Sản phẩm khuếch đại không chuyên biệt đã không thu được ở những vi khuẩn không khử đạm hoặc với các chủng có kiểu gen nir khác

Năm 1999, Hallin và Lindgren đã tìm ra gen mã hóa cho quá trình khử nitrite

(2 dạngcủa gen nir: nirK và nirS) trong vi khuẩn khử đạm (P stutzeri ATCC

14405, P fluorescens ATCC 33512, P putida CCUG 2479, P aureofaciens

ATCC 13985, P denitrificans ATCC 13867, Paracoccus denitrificans ATCC

19367, Alcaligenes eutrophus ATCC 17699,…) bằng kỹ thuật PCR Bước chính

của con đường khử đạm là sự khử nitrite bằng enzyme nitrite reductase (nir) Được biết có 2 loại enzyme nir đó là: một enzyme với heme c và heme d1 (cd1-nir) và

một có chứa đồng (Cu-nir) Cả hai loại enzyme này đều tương tự nhau về chức năng và đặc điểm sinh lý học

Chèneby cùng cộng sự (2000) tiến hành phân tích 16S rDNA về đặc tính của

vi khuẩn khử đạm phân lập từ 3 vị trí đất nông nghiệp ở Đông bắc nước Pháp, đất được lấy từ tầng mặt (0-20 cm) Tổng cộng đã phân lập được 138 chủng từ tổng số

1445 chủng vi khuẩn kỵ khí là có khả năng khử đạm Phân tích hệ thống phát sinh loài của 16S rDNA của những dòng khử đạm đã phân lập được từ 3 loại đất trên đã phát hiện sự đa dạng ở một mức độ cao

Su và đồng nghiệp (2001) tiến hành so sánh sự khử nitrite ở điều kiện hiếu

khí, dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC

35512 và P stutzeri SU2 Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống

xử lý nước thải từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan

Năm 2002, Sikorski cùng cộng sự sử dụng môi trường SW-LB để phân lập P.

stutzeri từ mẫu môi trường (đất) SW-LB gồm có 10 g/l Bacto Trypton; 5 g/l yeast

extract và 15 g/l agar cùng với nước biển nhân tạo (SW) chứa 24 g/l NaCl; 10,5 g/l MgSO4.7H2O và 0,11 g/l NaHCO3, có bổ sung 50mg cycloheximide để ngăn chặn sự phát triển của nấm Cặp mồi đặc hiệu và rất nhạy dựa trên vùng gen 16S rDNA được sử dụng trong bài là fps158 và rps743 đã được mô tả bởi Bennasar et

al (1998) để phân tích sự diện của P stutzeri trong mẫu môi trường Phương pháp này đã cải tiến một chuyên biệt những qui trình phân lập, nhận diện P stutzeri

được Baggi và cộng sự mô tả năm 1987 bằng đoạn mồi thích hợp và đặc biệt hơn nữa là có độ nhạy tối đa để khuếch đại mẫu DNA vi khuẩn đã phân lập từ môi

trường Gia tăng tính chuyên biệt của qui trình phân lập, nhận diện đối với P

stutzeri có quan hệ với những vi khuẩn khác bằng việc rút ngắn 4 nucleotide ở đầu

5’của mồi ngược rps743, đổi tên thành rps743minus4; mà các nucleotide đó được cho là đã làm tăng hiệu quả mất ổn định của những lỗi sao chép ở đầu 3’ trong lúc

mồi gắn với các gen của vùng 16S rDNA của vi khuẩn khác hơn là của P stutzeri

Cùng lúc đó Lee và đồng nghiệp (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của quần xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính loại thải nitrate với việc sử dụng phương pháp dựa trên 16S rDNA Bài báo cáo cũng đã mô tả một vài đặc tính của một số