+ Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ: Phương pháp đánh dấu phóng xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu là 32P và 35S.. Ưu đ
Trang 12.2 Lai ADN
· Đánh dấu gián tiếp:
Đánh dấu gián tiếp được thực hiện theo 3 bước: thực hiện phép lai giữa mẫu dò và mẫu ADN đích, phản ứng giữa nhóm chức năng và
Trang 2protein bám đặc hiệu với nhóm
chức tín hiệu thông báo (reporter)
và cuối cùng là tạo ra tín hiệu từ
nhóm chức tín hiệu
Bảng 1.5 Liệt kê một số hệ thống
đánh dấu gián tiếp
Nhóm chức năng bám
protein
Nhóm tín hiệu
(reporter)
Tài li d
Biotin-dUTP/steptavidin
Digoxigenein-dUTP/antidigoxigenein
Sulphone/antisulphone
Alkaline phosphatase Alkaline
phosphatase
Leary et
al (1982) Kessler
et al
Trang 3Dinitrophenyl/antinitrophenyl
Poly(dA)/poly(dT)
Acetyllaminofluorene/anti-acetylaminofluorene
Europium chelate
Piruvate kinase
Horseradish peroxidase Alkaline phosphatase
(1990)
Syvanen e
(1986)
Leller et
al (1990) Morrisey
&
Collins (1989) Tchen et
al (1984)
Mặc dù có nhiều hệ thống đánh
dấu và phát hiện tín hiệu nhưng
kinh nghiệm cho thấy hệ thống
Trang 4biotin và digoxidenin cho độ nhạy cao hơn cả Hai hệ thống này có thể phát hiện tới mức dưới picrogam acid nucleic Trong trường hợp với biotin thì đôi khi có mức độ nhiễu nền cao do biotin có mặt trong các sinh phẩm, còn đối với digoxigenein thì có thể không gặp khó khăn này
+ Đánh dấu phóng xạ và ghi phóng xạ:
Phương pháp đánh dấu phóng
xạ là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm lai ADN với các thành phần đánh dấu
là 32P và 35S Kết quả của phép lai giữa mẫu dò và ADN đích được
Trang 5phát hiện trên X-phim hoặc nhấp nháy lỏng Ưu điểm nổi bật của phương pháp đánh dấu phóng xạ là
độ nhạy có thể đạt tới dưới mức picrogam ADN đích Hạn chế của phương pháp này là không đạt được sự thích hợp cần thiết cho các thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng và cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm và cá nhân sử dụng cũng như việc quản lý chất thải
Xuất phát từ thực tế trên mà càng ngày người ta càng quan tâm đến các phương pháp đánh dấu phi phóng xạ Mục tiêu là đạt được một
Trang 6hệ thống đánh dấu có độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất phóng xạ Bảng dưới đây liệt kê các yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh dấu mẫu dò:
1, Dễ gắn với acid nucleic theo phương pháp đơn giản và có
độ lặp lại cao
2, Bền trong điều kiện lai và bảo quản
3, Không bị ảnh hưởng và làm ảnh hưởng đến phản ứng lai
4, Có thể thực hiện với điều kiện phản ứng lai trong dịch thể (liquid phase) hay có chất mang (solid phase)
Trang 75, Phương pháp phát hiện nhạy và đơn giản
6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai
7, Dễ phân biệt giữa mẫu lai
và mẫu chưa lai trong cùng điều kiện
8, Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá
Tuy nhiên, nếu theo các yêu cầu lý tưởng trên thì chưa có hệ thống đánh dấu phi phóng xạ nào thoả mãn
Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao và đó là lý do các phương pháp
Trang 8này đang được ứng dụng rộng rãi đặc biệt là phương pháp dựa trên các enzym như Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase Tuy nhiên phương pháp sử dụng các chất phóng xạ hiện tại vẫn đang được dùng cho một số phòng thí nghiệm đặc biệt
· Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ
Có 3 phương pháp đánh dấu phi phóng xạ:
1, Dùng cơ chất hoá phát xạ
và sinh phát xạ, trong trường hợp này thì cả cơ chất hoá và sinh phát quang đều tạo ra các bức xạ ánh
Trang 9sáng và sau đó là phương pháp phát hiện bức xạ này
* Với nguồn cơ chất hoá phát quang có loại như AMPPD (Bronstein, Edward & Voyta, 1989)
có thể được dùng trực tiếp như là
cơ chất cho enzym Alkaline phosphatase trong phép lai ADN đạt độ nhạy cao trong thời gian ngắn (Bronstein et al., 1990)
* Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase trên cơ sở giải phóng D-luciferin từ
cơ chất, ví dụ D-luciferin-O-phosphate (Miska và Geiger., 1987) Hai phương pháp này tương
Trang 10đối nhạy và đang được sử dụng rộng rãi
Vietsciences- Dương Văn Hợp,
Nguyễn Lân Dũng
