Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc 5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi ph
Trang 1- Thử nghiệm VP (xem bài 3)
Bài 5 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxi phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ
vệ sinh của thực phẩm Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc
là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm
Hình 20: thử nghiệm lên men glucose Ống a: đối chứng Ống b: không lên men glucose Ống c: lên men yếu Ống d: lên men mạnh
Trang 25.2 Quy trình phân tích
5.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
SPW
(Saline Pepton
Water)
NaCl : 42.5g Pepton: 5g
500 ml nước cất Phân phối cho mỗi tổ 27ml
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng (buổi
Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4…
Chọn 2 nồng độ pha loãng
thích hợp, chuyển 1ml mẫu
vào đĩa petri vô trùng (mỗi
nồng độ cấy 2 đĩa)
Trải 0.1ml mẫu lên đĩa DRBC, ủ ngửa đĩa ở
250C, 5-7 ngày (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)
Rót vào mỗi đĩa petri
10-15ml môi trường PCA đã
được làm nguội đến 450
C, lắc cho mẫu phân tán đều
vào môi trường, ủ ở 300C
trong 72 giờ
Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men
Chọn các đĩa có số khuẩn
lạc trong khoảng 25-250
khuẩn lạc/đĩa để đếm
Tính kết quả: tổng số vi sinh vật hiếu khí và tổng số nấm men nấm mốc trong mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)
Xác định tổng số VK hiếu
khí bằng kỷ thuật hộp đổ
Xác định tổng số nấm men nấm mốc bằng kỷ thuật hộp trải
Trang 3PCA
(Plate Count
Agar)
Casein enzymic hydrolysate: 5g Yeast extract: 2.5 g Dextrose: 1g
Agar: 15g
1000 ml nước cất
pH 7.0 ± 0.2
Phân phối 100ml PCA cho
mỗi tổ (15ml/petri) (buổi 5)
DRBC
(Dichloran Rose
Bengal
Chloramphenicol
Agar)
Glucose: 10g Peptone: 5g
KH2PO4: 1g MgSO4: 0.5g Rose bengal (dung dịch 5%, w/v): 0.5ml
Dichloran (0.2%(w/v) trong ethanol): 1ml Chloramphenicol: 0.1g Agar: 15g
1000 ml nước cất
pH 5.6 ± 0.2
Lưu ý: trộn lẫn các thành phần trừ
chloramphenicol, đun nóng để hòa tan hết agar, hấp khử trùng Để nguội đến 500C,
bổ sung 1ml dung dịch kháng sinh 100X vào
trường
Phân phối 100ml DRBC cho mỗi tổ (15ml/petri)
(buổi 5)
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút
Bước 3: pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: thực hiện như qui trình
Trang 4Cách tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn số đĩa có số đếm trong khoảng 25-250 để tính kết quả Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men nấm mốc được tính như sau:
A (CFU/g hay CFU/ml) = n1 x V x f1 + ⋯ + ni x V x iN Trong đó:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) trong 1g hay 1ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g