THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sin

Trang 1

ThS Lê Thùy Linh

Trang 2

3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản 14

4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 20

Tài liệu tham khảo

1 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ

Trang 3

Bài 1: Định lượng Coliforms và E coli1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

1.1.1 Định nghĩa

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc

kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 –

48 giờ Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của

chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị

khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:

E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa

đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),

Hình 1: phát hiện Coliforms và E.coli trong thực phẩm hay nước bằng môi trường CHROMagar ECC

Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h

khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC

Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng

24h ở 440C trong canh Trypton E coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +,

Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)

1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)

Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở

một số độ pha loãng khác nhau Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ

pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm

Quy trình thực hiện như sau:

Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp

Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăngtrưởng của vi sinh vật cần kiểm định

Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính

ở từng độ pha loãng Tra bảng Mac Crady

Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu

Homepage: http://lethuylinh.weebly.comﾧ

Trang 4

Chú ý:

Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch được sử dụng đểphân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml chomẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượngmẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên Vậy số liệu củabảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa phaloãng khi

1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích

Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng tiếp theo cầnphải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng Ví dụ: sử dụng

1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng

độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10

1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E coli bằng phương pháp MPN

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độpha loãng 10-1, 10-2, 10-3…

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3vào ống 10ml canhLSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL,

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C,

24 giờXemtran

g sau

Trang 5

Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,

SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC (+) vàIMViC ++ , tra bảng MPN

E coli

1.3 Cách tiến hành thí nghiệm

Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)

1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ

Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú

SPW

(Saline Pepton

Water)

NaCl : 42.5g Pepton: 5g

500 ml nước cất

Phân phối cho mỗi tổ 27ml

pH 6.8 ± 0.2

Phân phối 90ml LSB cho mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)

trước khi khử trùng (buổi 1)

Trang 6

(Brilliant Green

Broth)

Lactose: 10g Mật bò: 20g Brilliant green: 0.0133g

cất

pH 7.4

mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có chứa ống Durham) trước khi

KH2PO4: 1.5g K2HPO4: 4g NaCl: 5g

pH 6.9

Phân phối 90ml BGBL cho mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có chứa ống Durham) trước khi

Lactose: 10g K2HPO4: 2g Eosin Y: 0.4g Methylene blue: 65mg Agar: 15g

1000 ml nước cất.

pH 7.1 ± 0.2

Phân phối 100ml EMB cho

mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)

Tryptone water Tryptone hoặc

trypticase:10g

1000ml nước cất

pH 7.2 ± 0.2

Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân phối 10ml/ống nghiệm.

Glucose: 5g K2HPO4: 5g

Môi trường 2:

Digest: 3.5g Peptic digest of animal tissue:3.5g

Dextrose: 5g Potassium phosphate: 5g

1000ml nước cất.

pH 6.9 ± 0.2

Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân phối 10ml/ống nghiệm Kiểm tra lại môi trường cung cấp nào để pha môi trường.

(buổi 3)

Trang 7

pH 6.9 ± 0.2

Môi trường 3:

Peptone: 5g Glucose: 5g Phosphate buffer: 5g

K2HPO4: 1g NH4H2PO4: 1g MgSO4: 0.2g

0.08g Agar: 15g

1000ml nước cất Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc.

Đun sôi 1-2 phút cho đến khi hòa tan hết pH 6.8 ± 0.2

Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân phối 10ml/ống nghiệm.

(buổi 3)

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.

Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.

Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3.

Trang 8

Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3

ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng

Bước 5: Định lượng Coliform và E coli

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu

từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa

canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu

từ các ống LSB (+) sang môi trường canh

EC, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với

mỗi độ pha loãng

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với mỗi độ pha loãng

(+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ ở 370C, 24 giờ.

Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)

(xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC

Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Trang 9

Bước 6: thử nghiệm IMViC

Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat Cheeptham, Thompson Rivers University, Kamloops, BC, Canada)

Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C (Anne Hanson, University ofMaine, Orono)

Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau

khi nhỏ thuốc thử Kovács

Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red

Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi

cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B

Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc

trong ống nghiệm

a Thử nghiệm Indol (I):

Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzymetryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản

ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p- Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên

một phức chất dạng quinone có màu đỏ

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước tryptone Sinh

khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ

370C trong 24-48 giờ Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết

Trang 10

tách indol lên lớp dung môi hữu cơ Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch

nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi

hữu cơ

Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi

trường (-) lớp màu vàng của thuốc thử Đôi khi có sự xuất hiện của màu

cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của indol, tạo ra

b Thử nghiệm Methyl Red (MR):

Hình 6: thử nghiệm IndolNguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi trường sau khi

vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH<4.4 đỏ; pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0màu vàng

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng GlucosePhosphate (MR-VP Broth) Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trên môi trường MR-VP, ủ ở 370Ctrong khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ

lệ 3:2, bảoquản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quảngay

Hình 7: thử nghiệm

MR

Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử.(-) khi có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường

có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm

c Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)

d Thử nghiệm Citrate (iC)

Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi trường Mặtkhác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muốiammonium làm nguồn đạm duy nhất Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môitrường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màucủa chỉ thị pH trong môi

trường

Trang 11

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên

môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C

trong khoảng 24-48 giờ

Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang

màu xanh dương (-) khi không có khuẩn lạc và môi

trường giữ nguyên màu xanh lục

Từ số lượng các ống nghiệm có E coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ốngnghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị

số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng

Bài 2 Định lượng Staphylococcus aureus2.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gramdương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) cókhả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose Tất cả cácdòng S aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trongmôi trường

chứa đến 15% NaCl Một số dòng có khả năng tăng trưởng làmHình 9: S aureus trên

BPA tan máu trên môi trường thạch máu S aureus có thể nhiễm vào

thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm Sự hiện diệnvới mật độ cao của S aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quátrình chế biến

2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN

Phương pháp này được dùng để định lượng S aureus trong mẫu có mật độ S aureus thấp nhưng mật độ

vi sinh vật cạnh tranh cao

Trang 12

Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độthập phân 10-1, 10-2, 10-3…

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3vào ống 10ml canhMSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ

Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng

Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng,

có quầng trong và quầng sáng xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1

trong 2 quầng))

Cấy vào TSA, ủ ở 370C ± 10C , 24 giờ

Thử nghiệm ngưng kết coagulase

Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ phaloãng

Tra bảng MPN

Mật độ S.aureus(MPN/g hoặc MPN/ml)

2.3 Cách tiến hành và tính kết quả

Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp

Trang 13

Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú

SPW

(Saline Pepton

Water)

NaCl : 42.5g Pepton: 5g

Phân phối cho mỗi tổ 27ml

Mannitol: 10g Phenol red: 0.025g

Lithium chloride.6H2O:

5g Agar: 20g

Môi trường hoàn chỉnh

5ml Bacto EY tellurite enrichment (45-500C) vào 95ml môi trường cơ bản được làm nóng chảy Môi trường hoàn chỉnh phải đục.

1000 ml nước cất cho môi trường cơ bản

pH 7.0 ± 0.2

Phân phối 100ml BPA cho

TSA

(Tryptone Soya

Agar)

Trypticase peptone: 15g Phytone peptone: 5g NaCl: 5g

Agar: 15g

pH 7.3± 0.2

Phân phối 50ml BGBL cho

Trang 14

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.

Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng ở 1210C

trong 15 phút

Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu

Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập

mẫu khoảng 30 giây Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)

Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ

ở 370C, 48 giờ (xem bài 1, mục 1.3.2) Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để

tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA

Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA

Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ Chọn khuẩn

lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và

quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem

BPAChọn khuẩn lạc đặc trưng của S aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa coagulase

Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase

Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường enzyme

coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các khối đông làm đông

huyết tương

Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được dùng cho thử

nghiệm này Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch

nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV Ủ ống thử

nghiệm ở 370C trong

4 giờ Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút Tiếp tục ủ đến

24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ

Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp vẫn đồng nhất

Hình 11: thử nghiệm coagulase Ống trên (+); ống dưới (-)

Trang 15

Bài 3 Định tính Salmonella3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả

năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid

nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không

phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu

hết các chủng đều sinh H2S

Hình 12: Salmonella trên thạch XLD

Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4

bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng

định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae

có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella

3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinhBPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ

Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV, ủ

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

- Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol(+); Sorbitol (+)

Salmonella dương tính/

âm tính trong 25g mẫu

Định dạng
Số trang	28
Dung lượng	1,84 MB