CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT pptx

Phương pháp chuyển gen vào cây hông Paulownia fortunei: Sử dụng vi khuẩn At được lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môitrường tái sinh tạo chồi môi t

CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT

CẤU TRÚC vector plasmid MANG GEN KHÁNG SÂU VÀ

ỨNG DỤNG TRONG TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

THÔNG QUA VI KHU ẨN Agrobacterium tumefaciens

Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển

Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,

gây đột biến…, ngành công nghệ sinh học với sự phát triển của công nghệ gen đã vàđang tạo ra những bước đột phá do công nghệ gen cho phép đưa các gen có l ợi vào thực

vật để tạo ra những cây trồng có tính trạng m à chúng ta mong muốn

Hàng năm trên thế giới tốn rất nhiều chi phí trong việc phòng trừ sâu hại Các

nhà khoa học đã và đang nghiên cứu chuyển nạp gen Bt (Bacillus thuringiensis) vào cây

trồng để cây trồng tự sản sinh các protein gây chết sâu hại Cây trồng mang gen kháng

sâu Bt là một trong những thành tựu của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây

trồng Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc bộ

Lepidoptera, Coleoptera và Diptera Hiện nay ngoài việc cải tiến kỹ thuật chuyển gen

Bt còn phải cải tiến gen thích hợp sao cho gen Bt, một gen của vi khuẩn có thể biểu hiện

có hiệu quả trong thực vật Phương pháp có hiệu quả để tạo cây chuyển gen là sử dụngsúng bắn gen; tuy nhiên, đối với những cơ sở nghiên cứu chưa thể trang bị được thiết bị

này thì việc chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp

được lựa chọn; ngoài ra phương pháp dùng vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens còn có

các ưu điểm riêng của nó mà các phương pháp khác không có đư ợc

Theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp, chúng tôi đã nghiên cứu tái cấu trúc

vector plasmid mang ba gen là gen bar (gen chọn lọc), gen gusA (gen chỉ thị) và gen Bt

cryIA nhằm tạo một số vector plasmid mới - được đặt tên là plasmid pITB (Institute of

Tropical Biology).

Nội dung bài báo này, chúng tôi trình bày k ết quả nghiên cứu tái cấu trúc và sửdụng các plasmid qua tái cấu trúc trong nghi ên cứu tạo cây cây hông và cây cải ngọtchuyển gen

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Cấu trúc plasmid mới

 Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 được sử dụng để chuyển gen.

 Chuẩn E coli DH5: được dùng làm vi khuẩn có khả năng biến nạp.

 Plasmid pCAMBIA 3301, plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi cryIA(c).

2 Chuyển gen vào cây

Vật liệu và dòng vi khuẩn: Cây trong ống nghiệm được dùng làm vật liệu chuyển gen.

Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (At) EHA 105 chứa plasmid ITBmang gen cryIA(c), gen bar và gen gusA

Phương pháp chuyển gen vào cây hông (Paulownia fortunei): Sử dụng vi khuẩn At

được lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môitrường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1mg/l NAA và 10mg/l BA) có bổ sung

chất acetosyringone nồng độ 100 µM trong hai ngày Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằngdung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong th ời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá

sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4mg/l PPT v à 500mg/l cefotaxime Cấy

truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ượccấy truyền sang môi trường cho ra rễ có chứa 4 mg/l PPT Các cây ra r ễ tốt được đưa ratrồng ở vườn ươm

Phương pháp chuyển gen vào cây cải ngọt (Brassica integrifolia L.): Lá mầm với

cuống lá dài 1-2mm của cây con từ hạt nẩy mầm 5-6 ngày tuổi được sử dụng làm mẫuchuyển gen Sử dụng vi khuẩn đ ã lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầm

được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 2mg/l NAA, 4mg/l

BA và 3,3mg/l AgNO3) trong hai ngày (có bổ sung acetosyringone nồng độ 100 µM)

Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500 mg/l cefotaxime trong th ời

gian 30 phút, chuyển các mẫu sang môi tr ường tái sinh tạo chồi c ó chứa chất chọn lọcPPT và 500mg/l cefotaxime Cấy truyền 2 tuần/ lần tr ên cùng loại môi trường Sau 4-5tuần, mẫu có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi trường ra rễ (môi trường MS có0,1mg/l NAA và 6mg/l PPT)

Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen:

 Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá

chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37C, mẫu chuyển gen sẽ có m àu

xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu

 PCR gen cryIA(c): DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuy ên biệt, quy

trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983)

 Các cây chuyển gen được kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) qua khả năng kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá trong đĩa pétri.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Cấu trúc plasmid mới

Việc gắn gen cryIA(b) và cryIA(c) vào plasmid pCAMBIA 3301 để tạo plasmid mới nh ư

sau:

 Vectơ plasmid CAMBIA 3301 có độ dài 12 Kb chứa gen gusA và gen bar Có 14

enzyme giới hạn tại vị trí cloning site trong vùng T-DNA, ở đó cho phép tách hoặc ghép

các đoạn gen mong muốn Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn

Hind III (A/AGCTT) để cắt tạo hai đầu Hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301.

 Plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) ch ứa gen cryIA có độ dài 4 kb, ở hai

đầu của toàn bộ gen này (promoter-gen-terminator) có vị trí cắt bởi enzyme giới hạn

Hind III Nên chúng tôi đã sử dụng enzyme giới hạn Hind III để cắt ở hai vị trí này.

 Sau khi cắt bởi enzyme giới hạn Hind III các đoạn plasmid DNA đã được chạy điện di cho kết quả: với plasmid pCAMBIA đ ã được mở ra với hai đầu cắt bởi Hind III và được

xử lý bởi AP (alkaline phosphat) để chúng khó có thể tự nối lại với nhau C òn plasmidpUbi.cryIA do có hai vị trí cắt nên tạo ra hai đoạn: 6 kb DNA tương ứng với thân còn lại

của plasmid và đoạn 4 kb tương ứng với đoạn gen cryIA.

Sau đó tiến hành nối kết 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 12 kb v à đoạn gen cryIA 4

kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4oC trong thời gian 16 giờ Kết quả đã tạo được

2 plasmid mới dài khoảng 16 kb

Để kiểm tra kết qủa này chúng tôi đã chuyển 2 plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp

E.coli, nhân bản E coli và tách chiết ADN Sử dụng lại enzyme giới hạn Hind III để cắt

cho kết quả mỗi plasmid đã cho được hai băng DNA với 1 đoạn 12 kb v à 1 đoạn 4 kb(xem ảnh 2 điện di) hoàn toàn phù hợp với kích thước plasmid mới được chúng tôi đặt tên

là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) ch ứa 3 gen và được chuyển vào

dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105.

Chuyển gen vào cây hông:

Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn At, mẫu lá được đăt trên môi trường có PPT nồng

độ 4mg/l, đa số các mảnh lá bắt đầu vàng sau 2 tuần nuôi cấy, một số mảnh lá vẫn duy tr ìmàu xanh nhưng không h ình thành mô sẹo, chỉ một số ít khoảng 10% h ình thành mô sẹo

và một số trong đó bắt đầu tái sinh sau 5 tuần nuôi cấy S au giai đoạn chọn lọc này cácchồi con được chuyển sang môi trường MS để ra rễ với 4mg/l PPT Và chỉ có vài dòngcây tiếp tục phát triển và ra rễ, được chúng tôi giả định là cây chuyển gen Kết quả quátrình chuyển gen được thể hiện như sau:

Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trường có 4mg/l

PPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứng

Thí

nghiệm

Số mẫu lá

Số mẫu lá tạo mô sẹo

Số mẫu lá tái sinh chồi

Số lượng dòng cây chuyển gen

Để khẳng định đây là những cây hông chuyển gen, chúng tôi cấy cây hông giả định

chuyển gen và cây đối chứng vào môi trường ra rễ với chất chọn lọc PPT nồng độ 4mg/l đểthử khả năng chống chịu, sau 2 tuần toàn bộ cây đối chứng chết hoàn toàn, trong khi các câychuyển gen vẫn tiếp phát triển và ra rễ, giúp chúng tôi khẳng định đây l à những cây hông đã

được chuyển gen

Sự biểu hiện gen gusA của cây chuyển gen: Các chồi nhỏ, mảnh lá của cây chuyển gen

đã được xử lý với dung dịch X-Gluc, kết quả cho thấy chồi và mảnh lá này có màu xanh

chàm đặc trưng khẳng định sự biểu hiện của gen gusA trong cây chuyển gen.

Sự biểu hiện của gen bar trong cây chuyển gen: gen bar tạo tính trạng kháng thuốc trừ cỏ

đã được khẳng định trong cây in vitro, tuy nhi ên chúng tôi muốn tiếp tục khảo sát sự tồn tại

ổn định và khả năng biểu hiện của gen này trên cây sau khi được trồng ra môi trường tự nhiênngoài vườn ươm Chúng tôi sử dụng nồng độ 300mg/l PPT để phun l ên các cây đối chứng và

cây chuyển gen 1 tháng tuổi tại vườn ươm Sau 2 tuần nhận thấy các cây hông chuyển gentiếp tục sinh trưởng và phát triển bình thường, chỉ có một dòng cây hơi bị vàng lá phía dưới

nhưng vẫn sống và phát triển cho phép chúng tôi khẳng định một lần n ữa đây là những câyhông đã nhận được gen chuyển

Sự hiện diện của gen cryIA(c) và khả năng kháng sâu của cây chuyển gen: Phân tích PCR với cặp mồi chuyên biệt cho gen cryIA(c) cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen sau khi

chạy điện di có xuất hiện các băng có kích thước 0,65 kb giống như mẫu đối chứng dương tính

plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c) trong khi mẫu cây đối chứng hoàn

toàn không có băng Qua đó chúng tôi kh ẳng định sự hiện diện của gen cryIA(c) trong nhiễm

sắc thể của cây chuyển gen Sau đó các cây hông chuyển gen đ ược chuyển ra trồng trong vườn

ươm Để thử nghiệm tính kháng sâu các lá nhỏ đ ược đặt trong đĩa pétri cùng sâu xanh Heliothis

armigera Sau 3 ngày, với các lá đối chứng diện tích lá bị hại lớn, kích th ước sâu tăng rõ rệt,

trong khi đó ở lá cây chuyển gen diện tích lá bị sâu ăn nhỏ, sâu tăng tr ưởng rất kém và sau 3

ngày sâu hoàn toàn không còn ăn và chết nhiều vào ngày thứ 5 hoặc 6

Chuyển gen vào cây cải ngọt:

Với phương pháp sử dụng lá mầm của cây con từ hạt nẩ y mầm 5-6 ngày tuổi, cấy lámầm vào môi trường tái sinh 3-4 ngày trước khi nhúng cuống lá mầm v ào dịch vi khuẩn

để lây nhiễm, thời gian ủ với vi khuẩn l à hai ngày trên môi trư ờng có bổ sung 100 µM

Acetosyringone và sau khi r ửa được cấy trên môi trường tái sinh có Cefotaxime500mg/l và 4mg/l PPT thì sau 3-4 tuần các chồi tái sinh h ình thành và chúng được cấytruyền trên môi trường MS có 6mg/l PPT để kiểm tra khả năng kháng PPT của cây

Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm chuyển gen nhiều lần với số mẫu trun g bình từ

80-120 mẫu/lần Kết quả được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Tỷ lệ tái sinh ch ồi và cây, trên môi trường có 4mg/l PPT, của các lá mầm được

nhiễm với Agrobacterium tumefaciens v à của mẫu lá mầm đối chứng

thí nghiệm

Số lá mầm tạo mô sẹo

Số lá mầm tái sinh chồi

Số lượng dòng cây giả định chuyển gen

Tần số chuyển gen (%)

(3,7%)

21 ( 1,5%)

Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy số l ượng lá mầm chống chịu với chất chọn lọc4mg/l PPT để hình thành mô sẹo khoảng 3,7% nhưng số lượng có thể tái sinh chồi chỉ ởmức 1,5% và gần như đa số các chồi đều không phát triển v à chết ở các lần cấy truyền sau,

theo chúng tôi đây là hiện tượng được coi là escape khá phổ biến trong quá trình chuyển

gen hoặc chồi ở thể khảm và chỉ còn 2 chồi tiếp tục phát triển trên môi trường MS với6mg/l PPT - điều này cho thấy tần số chuyển gen thấp (0,14%) Chúng tôi cho rằng khichuyển gen trên các đối tượng cây trồng khác như cây thuốc lá và cây hông thì mẫu lá cókhả năng tái sinh chồi cao từ xung quanh rìa lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cóthể xâm nhập vào nhiều vị trí có khả năng tái sinh n ày, trong khi ở cây cải ngọt lá mầm chỉ

có thể tái sinh tại cuống lá nên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chỉ có một vị trí duynhất để có thể xâm nhiễm tạo cây chuyển gen Các cây cải giả định chuyển gen đ ược phântích PCR với cặp mồi chuyên biệt của gen cryIA(c) - cho thấy các mẫu DNA của cây giả

định chuyển gen sau khi chạy điện di có xuất hiện các băng có kíc h thước 0,65 kb giốngnhư mẫu đối chứng dương tính plasmid, chúng là kết quả của sự khuếch đại gen cryIA(c)

trong khi mẫu cây đối chứng hoàn toàn không có băng

KẾT LUẬN

Với việc sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang plasmid ITB

để chuyển gen, chúng tôi đã nhận được một số dòng cây hông và cây cải ngọt chuyển gen

mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera B ằng các kỹ thuật sinh học phân tử

và sinh học chúng tôi đã xác định được của gen này hiện diện trong cây hông và cây cảingọt chuyển gen và gen chuyển đã có biểu hiện tính trạng khá rõ rệt

Plasmid ITB (lane 2 và 3 mang

gen cryIA(b) và cryIA(c)

Phân tích PCR gen cryIA(c) ở cây hông chuyển gen (băng DNA 0,65 kb)

Phân tích PCR gen cryIA(c) ở cây cải ngọt chuyển gen (băng

DNA 0,65 kb)

Cây cải ngọt giả định chuyển gen phát triển

trên môi trường chọn lọc PPT

Cây hông giả định chuyển gen phát triển trên môi trường chọn lọc PPT

LỜI CÁM ƠN

Các tác giả xin chân thành cám ơn Chương tr ình KC-04-13, Chương trình nghiêncứu cơ bản đã tài trợ thiết thực cho nghi ên cứu này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2003 Tạo cây hông (Paulowniafortunei) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc, Hà Nội, 16-17/12/2003 NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1088-1090

2 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển, 2005 Ảnh

hưởng của tác nhân chọn lọc đến mô cây cải ngọt ( Brassica integrifolia) và nghiên

cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa học t oàn quốc

“Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y Hà Nội, Hà

Nội, 3/11/2005, tr 1194 -1197

3 Phạm Thị Hạnh, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, 2005 Khảo sátkhả năng tái sinh cây in vitro cây cải ngọt (Brassica integrifolia) từ lá mầm và trụmầm phục vụ cho nghi ên cứu chuyển gen Tuyển tập Báo cáo Hội nghị khoa họctoàn quốc “Những vấn đề nghi ên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống” , Đại học Y

Hà Nội, Hà Nội, 3/11/2005, tr 498-500

4 Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu H ổ, 2003 Nghiên cứu hệ thống táisinh cây hông (Paulownia fortunei) và ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc để tạo câychuyển gen Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học to àn quốc,

Hà Nội, 16-17/12/2003 NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 866-869

5 Murashige, T., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture Physiol Plant 15: 473-497

6 Pua, E C., Barfield D G., 1991 Gene transfer in plants of Brassica juncea usingAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation Plant Cell Reports 10: 308-314

SUMMARY

Construction of plasmid vector and utilization for production

of transgenic plants resistant to insect via Agrobacterium

tumefaciens

Le Tan Duc, Nguyen Huu Ho, Nguyen Van Uyen

Institute of Tropical Biology

New plasmid vector pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) consisting bar,cryIA(c) and gusA genes was constructed and applied to transfer into Agrobacteriumtumefaciens EHA 105 for Paulownia and Brassica plants genetic transformation Manytransgenic lines of both plant cultivars were obtained PCR analyses and indigogenicGUS assay were performed to confirm the presence and the expression of bar, cryIA(c)and gusA genes Insect bioassays with larvae showed an improvement of resistanceagainst Heliothis armigera

TẠO CÂY THUỐC LÁ KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ

VÀ CÔN TRÙNG

Phạm Thị Hạnh, Phan T ường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ

Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

ĐẶT VẤN ĐỀ

Một trong những yếu tố l àm giảm năng suất cây trồng trên đồng ruộng hiện nay lànhững tác hại do sâu bệnh gây ra v à việc phòng trừ dịch hại này thường gây sự ô nhiễmmôi trường ngày càng nghiêm trọng Vấn đề này chỉ có thể được giải quyết thông qua

sự kết hợp giữa khoa học hiện đại v à ý thức giữ gìn sinh thái môi trường Một trongnhững ứng dụng của công nghệ sinh học để giải quyết vấn đề tr ên là tạo ra những câytrồng tự bản thân có khả năng chống chịu với các loại sâu bệnh Trong các loại côntrùng gây hại thì rầy, rệp chiếm vai trò quan trọng, việc chích hút nhựa của chúng làmcây không phát triển đồng thời chúng là nguồn lây lan một số bệnh virus quan trọng nh ưvirus gây bệnh khảm ở cây thuốc lá

Hiện nay, phương pháp chuyển gen vào cây trồng bằng vi khuẩn Agrobacteriumtumefaciens được xem là một phương pháp có hiệu quả, là phương pháp qua đó k ết quảchuyển gen thường biểu hiện kiểu tích hợp gen (DNA integration) t ương đối đơn giản,phù hợp với ý muốn của các nh à công nghệ gen

Nội dung báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu tái cấu trúc plasmid mới mang gen bar(gen kháng thuốc trừ cỏ), gen gna (gen kháng côn trùng chích hút) và gen gusA; chuyểnplasmid mới cấu trúc vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và dùng dòng vi khu ẩnbiến nạp trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ v à côn trùng

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

 Vi khuẩn E coli chứa plasmid pBluescript SK+-GNA mang cassette gen nguyên

vẹn [Bao gồm Promoter Ubiquitin (Ubi) + Trình tự mã hoá protein GNA (gen gna)

+ Terminator Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb

 Chủng vi khuẩn E coli chứa pCAMBIA 3301 mang gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ) và gusA (gen chỉ thị) Gen chỉ thị gusA: được phân lập từ vi khuẩn E coli

(Jefferson & ctv., 1987), mã hóa enzym -glucuronidase (không màu) Enzymenày xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronide (không m àu) để tạo thành

sản phẩm có màu xanh chàm đ ặc trưng dễ nhận biết Glucuronide th ường dùnggọi là X-gluc, công thức hóa học: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide.

Gen bar kháng chất phosphinothricin (PPT) đ ược phân lập từ vi khuẩn S.

hygroscopicus Gen này mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyl transferase

(PAT), giúp biến đổi PPT từ dạng ức chế sinh tổng hợp glutamine gây chết câytrồng sang dạng bị acetyl hóa không c òn gây độc cho cây Vì vậy, ngoài tác

dụng chọn lọc trong quá trình chuyển gen ở thực vật, gen bar còn có vai trò

kháng thuốc trừ cỏ Basta trong sản xuất nông nghiệp

 Chủng vi khuẩn E coli DH5 được dùng trong biến nạp nhằm khuếch đại số l ượng

bản sao các plasmid

 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dùng để biến nạp plasmid mới.

 Môi trường nuôi cấy: Môi tr ường Luria-Bertani (LB) chứa kháng sinh được sử

dụng trong nuôi cấy và biến nạp

 Enzym giới hạn SacI, KpnI và enzym nối DNA ligase T4.

2 Phương pháp

a Cấu trúc các plasmid mới

Phương pháp xử lý enzym để cắt DNA plasmid theo qui trình c ủa Sambrook và ctv

(1989) Các phản ứng nối kết được thực hiện ở nhiệt độ 140C trong thời gian 3-4g Biếnnạp E coli và Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp sốc nhiệt, 420C trong 2

phút Môi trường LB được bổ sung các kháng sinh thích hợp để chọn lọc cá thể biến

nạp Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng các kháng sinh nh ư kanamycin (50mg/l) vàstreptomycin (25mg/l) Các hợp chất hóa sinh như IPTG (Isopropyl-D-thiogalactoside)50mg/l và X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl -D galactopyranoside) 40mg/l đư ợc bổ

sung vào môi trường nuôi cấy các thể biến nạp để hoạt hoá enzym -galactosidase, chophép chọn lọc các khuẩn lạc xanh/trắng Ph ương pháp tách DNA plasmid các khuẩn lạc

để kiểm tra cloning theo phương pháp của bộ kit công ty Promega

b Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng

Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng Kutsaga 326 Lá cây thu ốc lá trong ống nghiệm

được cắt kích thước khoảng 1x1cm được dùng làm nguyên liệu chuyển gen

Sử dụng vi khuẩn đã lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá đ ượcnuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi tr ường MS có 0,1mg/l NAA v à 1mg/l

BA) trong hai ngày Sau đó r ửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch Cefotaxim e 500mg/l

trong thời gian 30 phút, chuyển các mảnh lá sang môi tr ường tái sinh tạo chồi có 10mg/lPPT và 500mg/l Cefotaxim e Cấy truyền 2 tuần / lần tr ên cùng loại môi trường Sau 6tuần, mẫu lá có chồi tái sinh đ ược cấy truyền sang môi tr ường ra rễ có chứa 20 mg/lPPT Các cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm

Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen

 Khảo sát khả năng phát triển v à ra rễ của cây chuyển gen v à cây đối chứng in vitro

trên môi trường MS có chứa chất chọn lọc nồng độ 20mg/l PPT

 Kiểm tra gen chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc: bằng cách ngâm các mảnh lá v à

chồi nhỏ với dung dịch X -Gluc khoảng 15 giờ ở 370C, mẫu chuyển gen sẽ có m àu

xanh chàm đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ không chuyển m àu

 Sự hiện diện của gen gna trong cây được kiểm tra qua phản ứng PCR với cặp mồi

chuyên biệt như sau: Mồi 1: 5’CGG ATC CAT GGC TAA GGC AAG TCT CCTC-3’ và mồi 2: 5’CGG TAC CTC ATT ACT TTG AAG TCA CAA G -3’ Kích

thước đoạn DNA của gen gna khuếch đại của phản ứng PCR đ ược mong đợi là

0,47 kb

 Sự hiện diện của gen bar được kiểm tra qua phân tíc h PCR với các cặp mồi như

sau: Mồi 1: 5’ ATG AGC CCA GAA CGA CG 3’ v à mồi 2: 5’ TCA GAT CTC

GGT GAC GG 3’ Gen bar ở cây chuyển gen qua phân tích PCR sẽ có đoạn DNA

được khuếch đại là 0,5 kb

 Các cây chuyển gen và đối chứng được phun dung dịch Basta (PPT nồng độ 4g/l)

có bổ sung chất bám dính Tween 80 để kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Cấu trúc plasmid mới

Trong thí nghiệm này chúng tôi đã xử lý cassette gen nguyên vẹn [Bao gồmPromoter Ubiquitin (Ubi) + Trình t ự mã hoá protein GNA (gen gna) + Terminator

Nopaline synthase (nos)], kích thư ớc khoảng gần 4 kb nằm tr ên plasmid Bluescript SK+được cắt bởi hai enzym giới hạn Kpn I v à Sac I Cassette này s ẽ được chèn vào vị trí

Lac Z alpha (trong vùng T -DNA, cũng được cắt bởi Kpn I v à Sac I) ở plasmidpCAMBIA 3301

Tiếp theo chạy điện di tr ên gel agarose 0,8% kết quả điện di sau khi cắt bởi 2enzym cho thấy plasmid pBluescript SK+ -GNA được cắt làm hai đoạn, đoạn khoảnggần 4 kb là nguyên cassette chứa gen gna còn plasmid pCAMBIA ch ỉ có 1 đoạn khoảng

12 kb Tách và làm sạch đoạn cassette v à plasmid backbone trư ớc khi đưa vào nối kết(ligation)

Phản ứng nối kết giữa gen gna v à vector pCAMBIA b ằng enzym ligase T4 ở 14oCtrong 3 giờ Sau đó các sản phẩm tr ên được biến nạp vào E coli DH5khả biến trong

môi trường LB có 50 mg/l kháng sinh kanamycin, nuôi 37oC qua đêm Kết quả cho thấytrên các đĩa đối chứng (biếp nạp không có plasmid), các tế b ào E coli DH5 do không

được bổ sung plasmid khi thực hiện biến nạp n ên không có khả năng kháng Kanamycin,

do vậy chúng không sinh tr ưởng được trên môi trường LB có bổ sung kanamycin

Ngược lại, các thể được biến nạp mang plasmid mới phát triển đ ược trên môi trường

chọn lọc này chứng tỏ chúng chính l à các thể mong muốn Bên cạnh đó, môi trườngchọn lọc có bổ sung X-gal, dựa trên nguyên tắc sàng lọc, các khuẩn lạc trắng tr ên đĩabiến nạp sẽ được sơ chọn để nhân bản plasmid mới Để xác định kết quả, chúng tôi lấy

một số khuẩn lạc màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng có 50mg/l kháng sinhkanamycin, nuôi lắc qua đêm ở 370C Sau khi tách DNA plasmid, ti ến hành xử lý 2enzym SacI và KpnI cho plasmid m ới và pCAMBIA Kết quả xử lý enzym, chạy điện ditrên gel 0,8% cho thấy plasmid mới chứa 2 đoạn DNA: một đoạn 12 kb (t ương ứngpCAMBIA 3301 backbone) và m ột đoạn kích thước khoảng gần 4 kb (t ương ứngcassette chứa gen gna); cho thấy plasmid đ ã được hình thành có kích thước khoảng gần

16 kb Như vậy có thể khẳng định gen mục ti êu đã được lắp ghép thành công và plasmid

mới đã được nhân bản trong E coli, plasmid này được ký hiệu là p3301-GNA Sau đó

chúng tôi đã tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang plasmid n ày

2 Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ v à kháng côn trùng

Trên môi trường có PPT nồng độ 10 mg/l, các mảnh lá đối chứng bị mất m àu màuxanh sau 2-3 tuần Ngược lại, một số mảnh lá đ ã xử lý vi khuẩn chuyển gen vẫn c ònmàu xanh và hình thành d ần các cụm mô sẹo và chồi nhỏ Sau 6 tuần chọn lọc, các chồi

này được chuyển sang môi trường ra rễ có 20mg/l PPT Chồi thuốc lá qua xử lý chuyển

gen vẫn tiếp tục phát triển và ra rễ Trong khi đó ở thí nghiệm đối chứng, chồi từ mô lákhông xử lý chuyển gen trên môi trường ra rễ chứa 20mg/l PPT dần dần vàng và chếttrong 2-3 tuần Do đó chúng tôi cho rằng những chồi v à cây phát triển trên môi trường

20 mg/l PPT là những cá thể giả định chuyển gen Qua thí nghiệm chuyển gen, cây sinhtrưởng tốt trên môi trường có 20mg/l PPT có sự biểu hiện của gen gusA, lá của các câynày có màu xanh đặc trưng

Bảng 1: Tỷ lệ tái sinh chồi của cá c mảnh lá trên môi trường có 20mg/l PPT sau khi

nhiễm với Agrobacterium v à mẫu lá đối chứng

Kiểm tra sự hiện diện của gen mục ti êu gna trong cây thuốc lá chuyển gen: Phản

ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gen gna Đối chứng dương là

plasmid pUbi-GNA và đối chứng âm là DNA bộ gen tách chiết từ nhiễm sắc thể của cây

không được chuyển gen Kết quả cho thấy ở các dòng cây giả định chuyển gen có sự

hiện diện của vạch DNA mong đợi có kích th ước bằng với kích thước của vạch đốichứng dương tính là 0,47 kb (so với thang chuẩn) Không thấy vạch này ở trường hợpcây thuốc lá đối chứng Kết quả n ày chứng minh gen mục ti êu gna từ plasmid của vikhuẩn Agrobacterium đã được chuyển và sáp nhập vào bộ gen của cây

Sự hiện diện của gen bar v à khả năng kháng thuốc trừ cỏ Basta: Kết quả phân tíchPCR cho thấy các mẫu DNA của cây chuyển gen xu ất hiện băng DNA với kích thướckhoảng 0,50 kb là kết quả của việc khuếch đại gen bar Do đó, chúng tôi có th ể khẳng

định bước đầu gen bar đã được chuyển vào nhiễm sắc thể của cây Sau khi trồng tại

vườn ươm khoảng 30 ngày, các cây thuốc lá đối chứng đã được kiểm tra khả năng

chống chịu với thuốc trừ cỏ Basta bằng cách phun thuốc với các n ồng độ 4 g/l PPT Sau

14 ngày, tất cả cây thuốc lá đối chứng đều bị chết ở nồng độ nói tr ên nên chúng tôi đãchọn nồng độ 4g/l PPT để xử lý số cây thuốc lá chuyển gen Sau 14 ng ày, cây thuốc láchuyển gen vẫn tiếp tục sinh tr ưởng bình thường

KẾT LUẬN

Như vậy bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chúng tôi đ ã tạo được chủng

Agrobacterium tumefaciens mang gen bar, gen gna và gen gusA Sau đó đã sử dụng vikhuẩn này để tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gnakháng côn trùng chích hút

LỜI CÁM ƠN

Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Tp Hồ Chí Minh vàTrung tâm phát triển KHCN Trẻ - Thành Đoàn Tp Hồ Chí Minh đã tài trợ cho nghiêncứu này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Gleave A P., 1992 A versatile binary vector syste m with a T-DNA organisationalstructure conductive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome.Plant Molecular Biology 20: 1203 -1207

2 Hilder V A., Gatehouse M R., Gatehouse J A., Van Damme E., Boulter D., 1995.Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic tobacco plants results in addedprotection against aphids Transgenic Research 4: 18 -25

3 Kumar K K., Sudhakar D., Raija J A., Balasubramanian P., 1999 Engineeringresistance in elite indica rices to major diseases through Agr obacterium -mediatedtransformation.General Meeting of The International Program on RiceBiotechnology, September, 1999, Phuket, Thailand

4 Murashige T., Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture Physiol Plant 15: 473-497.Ư

5 Rao K V., Christou P., Gatehouse M R., Gatehouse J A, 1998 Expression ofsnowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brownplanthopper Plant Journal 15(4): 469 -477

6 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T., 1989 Molecular Cloning - A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory Press

Production of transgenic tobacco plants ( Nicotiana tabacum

L.) resistant to insect and BastaR herbicide via Agrobacterium

tumefaciens

Pham Thi Hanh, Phan Tuong Loc, Le Ta n Duc, Nguyen Huu Ho

Institute of Tropical Biology

Intact gna gene cassette was collected from the plasmid pBluescript SK + byrestriction enzymes KpnI và SacI and inserted in Lac Z alpha region on T-DNA of theplasmid pCAMBIA 3301 Consequently, newly for med plasmid was introduced intocompetent E coli and Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (for transformation) Afterco-cultivation, tobacco leaf disks were cultured on selection medium containing 10 mg/lPPT (Phosphinothricin) Many transgenic tobacco plants with aphid resistance gene gna,herbicide resistance gene bar, and reporter gene gusA were obtained via Agrobacteriumtumefaciens LBA 4404 carrying the plasmid pCAMBIA 3301-GNA PCR analyses andindigogenic GUS assay were pe rformed to confirm the presen ce and the expression ofgna, bar and gusA genes

1,2,3,4: cây chuyển gen

Hình 4: Cây thuốc lá chuyển

gen và đối chứng trên môi

trường chứa 20 mg/l PPT

Hình 5: Chồi cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện gen gusA qua ngâm trong dung dịch X-gluc

Hình 6: Cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng sau khi phun dung dịch Basta

NGHIÊN CỨU TÁI SINH in vitro VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH CÂY CÚC Dendranthema grandiflorum L MANG

GEN ipt tạo cytokinin

Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Đức Trí,

Nguyễn Thị Thanh

Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Trong ngành trồng hoa thương mại, một trong các vấn đề đ ược quan tâm nhiều nhất

là nghiên cứu giữ cho cây hoa nói chung v à hoa cắt cành nói riêng sao cho lâu tàn Cácnhà sản xuất và kinh doanh hoa cảnh đã sử dụng một số tác nhân l àm cho hoa được tươi

lâu như dung dịch chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) cytokinin (dihydrozeatin hoặc

benzyladenin), dung dịch đường, dung dịch sát khuẩn,,, để xử lý hoa cắt c ành hoặc xử lý

đối với cả cây hoa

Cây hoa cúc là đối tượng cây hoa có nhu cầu tiêu thụ rất cao vì có hoa đẹp, đa dạng,

nhiều màu sắc nhưng thời gian bền tươi của hoa cắt cành không dài nhất là khi đưa vàotiêu thụ giống cúc ôn đới hoặc trưng bày, bảo quản hoa trong điều kiện không thích hợpnên nghiên cứu làm tăng độ bền tươi của cây hoa này là vấn đề cần được quan tâm

Như chúng ta đã biết, các chất điều hoà sinh trưởng như auxin, gibberellin, ethylen,

acid abscisic, cytokinin có ý nghĩa rất lớn trong việc điều ho à sự lão hoá Trong cácnhóm chất nêu trên, cytokinin chiếm vai trò quan trọng [5,9,10,11] Trong công nghệnuôi cấy mô tế bào in vitro, cytokinin có vai trò rất rõ rệt trong việc giữ cho mô lá táchrời chậm thoái hoá diệp lục tố - được xanh tươi lâu Trong thực tiễn công tác giống câytrồng, việc xử lý cytokinin, li ên quan mật thiết đến sự tươi lâu của rau vừa thu hoạch v àkéo dài tuổi thọ của hoa cắt cành, mang ý nghĩa thương mại rất cao

Trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển gen nạp ipt (mã hoá enzym

isopentenyl transferase có liên quan đ ến sinh tổng hợp cytokinin isopentenyl adenin,

zeatin và dihydrozeatin) vào cây tr ồng mục đích làm mô tế bào của chúng tự sản xuấtcytokinin Thực tế nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng, ở một số tr ường hợp

như cây thuốc lá [25], Petunia [5,10] cây bông cải [11], cây cải xà lách [13,14] kể cảcây cúc [8,9,10]…, tác d ụng của cytokinin nội sinh (sản phẩm của gen đ ược chuyển

nạp) đối với tuổi thọ của lá v à hoa của cây chuyển nạp gen là rất có ý nghĩa Để tránh sựtạo dư thừa (overproduction) cytokinin gây thay đồi h ình dạng cây, các nhà khoa học đã

sử dụng một số loại promoter khác nhau tạo sự biểu hiện gen khi cây ở điều kiện đặc

thù [1,5,9,10,13] trong đó có promote r SAG12 (tạo sự sinh tổng hợp cytokinin khi mô

đi vào trạng thái lão hoá) [5,13] mà chúng tôi s ử dụng trong nghiên cứu này

Theo xu hướng trên, ở nghiên cứu này, qua kết hợp công nghệ nuôi cấy mô v à công

nghệ gen, chúng tôi nghi ên cứu tái sinh cây in vitro và chuyển gen ipt vào cây hoa cúcDendranthema morifolium L Với hy vọng sự hiện diện v à biểu hiện của gen ipt nói trên

sẽ có tác dụng góp phần l àm cho cây hoa lâu héo tàn

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống lan: Sử dụng giống cúc đại đoá Đ à Lạt có hoa màu vàng.

Phương pháp

Môi trường nuôi cấy mô và thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin

1 Môi trường nuôi cây: MS (Murashige -Skoog, 1962) [15 ] không ch ất điều hoà sinhtrưởng (ĐHST)

2 Môi trường tái sinh chồi: MS có các chất ĐHST NAA , BA với các nồng độ khác

nhau

3 Môi trường vươn chồi tạo cây và ra rễ: như môi trường số 1

4 Môi trường thử tính chống chịu đối với kháng sinh hygromycin: nh ư môi trường 1nhưng có hygromycin t ừ 5 - 10mg/l

Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng/ng ày, nhiệt độ 25-28oC

Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid

pVDH396 (kích thước 15,9 kb) (do TS Nguyễn Thị Thanh thiết kế) mang gen ipt (có nguồn gốc từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ) tạo enzyme isopentenyl t ransferase [có promoter SAG12 (senescence associated gene 12, t ừ Arabidopsis thaliana), gen

gusA (có intron, promoter CaMV35S) và gen kháng hygromycin hph (promoter CaMV35S).

Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50mg/l kanamycin Để nhân

giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đ êm trong môi

trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin nh ư trên Nhiệt

độ nuôi cấy: 25 - 280C

Quy trình chuyển gen

Các mảnh lá với kích thước 0,6 x 0,6cm, từ cây in vitro trên môi trường MS không

chất điều hoà sinh trưởng, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen

Tóm tắt quy trình chuyển gen

1 Nuôi cấy mảnh lá trên môi trường có 0,5mg/l NAA v à 1mg/l BA trong thời gian 2ngày

2 Gây nhiễm các mảnh lá với vi khuẩn trong thời gia n 10 phút Vớt mẫu ra, thấm bớtdịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc.

3 Nuôi chung mảnh lá với vi khuẩn trong 2 ng ày Sử dụng môi trường như trên

nhưng có acetosyringone 100 M

4 Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kếthợp lắc nhẹ)

5 Vớt mẫu ra, thấm ráo n ước và cấy các mảnh lá trên môi trường chọn lọc: như môi

trường ở bước 1 của quy trình nhưng có bổ sung 10 mg/l hygromycin, 500 mg/l

cefotaxime Thời gian nuôi 15 ngày / chu kỳ chọn lọc và thực hiện 2 chu kỳ

6 Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc thêm 3 chu kỳ (15 ngày/chu kỳ) trên môi trườngchọn lọc như trên nhưng có 5mg/l hygromycin đến khi có chồi tái sinh

7 Cấy truyền các chồi / cụm chồi tái sinh (cao khoảng 1 cm) sang môi trường MSkhông chất sinh trưởng cũng chứa 5mg/l hygromy cin đến khi vươn chồi, thời giannuôi khoảng 1 tháng

Kiểm tra cây chuyển gen

1 Tách các chồi vươn cao (khoảng 2cm) và cấy truyền cũng sang môi tr ường MSkhông chất sinh trưởng có 5mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ trongthời gian khoảng 20 ngày

2 Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá trong thuốc thử GUS qua đ êm ở

CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 940C: 3 phút; 30 chu kỳ (940C:

30 giây, 560C: 45 giây, 720C: 1 phút); 720C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp

GCCATGTTGTTTGCTAGCCAG; chương tr ình nhiệt: 900C:10 phút; 40 chu kỳ (940C: 15giây, 450C: 45 giây, 720C: 50 giây); 720C: 7 phút; khuếch đại đoạn DNA 355 bp

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

a Tính chống chịu tự nhiên của mô lá đối với hygromycin

Theo một số tài liệu công bố về chuyển nạp gen qua sử dụng tác nhân chọn lọc l àhygromycin thì cây cúc là đối tượng rất mẫn cảm đối với tác nhân chọn lọc n ày Quatriển khai thử nghiệm tính chống chịu đối với hygromycin d ùng vật liệu là mảnh lá vàcây con in vitro, kết quả cho thấy các mảnh lá (kích thước 0,6 x 0,6cm) và cây con (cao

khoảng 1,5 - 2cm) đều bị chết nâu trên môi trường MS không chất sinh trưởng có10mg/l hygromycin Trên môi trường có nồng độ 5mg/l hygromycin, ở mảnh lá có sựhình thành mô sẹo nhưng mô sẹo đen dần và không có khả năng tái sinh chồi, v à nếu có

sự tái sinh chồi xảy ra th ì chồi rất yếu ớt, xanh nhạt; đối với thử nghiệm tr ên cây con thìcây tuy cũng có sự phát triển nhất định nh ưng chậm, rễ ra ngắn và có màu nâu đen, các

lá gần gốc ở trạng thái héo nâu, rũ

Kết hợp thử nghiệm ri êng trên giống cúc thí nghiệm v à theo tài liệu đã công bố,chúng tôi chọn nồng độ hygromycin 10mg/l để chọn lọc tế bào chuyển gen ở giai đoạn

đầu (1 - 2 chu kỳ) qua sử dụng phiến lá (không mang phần cuống) l àm vật liệu xử lý

chuyển gen Tuy vậy, chúng tôi cũng quan tâm cân đối việc gia giảm nồng độ tác nhânchọn lọc này để đảm bảo vừa có sự tái sinh ở mức t ương đối chấp nhận được vừa không

bị lúng túng do việc tái sinh nhiều cây không phải l à cây chuyển gen Cũng qua thực tếtriển khai thử nghiệm này trên giống cúc đại đoá vàng Đồng Tháp (giống chịu nhiệt) th ìgiống này lại tỏ ra ít mẫn cảm hơn giống cúc nói trên (số liệu cá nhân)

b Nghiên cứu nuôi cấy mô tái sinh cây phục vụ nghi ên cứu chuyển gen

Nói chung, trong nghiên c ứu nuôi cấy mô và chuyển gen thì việc quan tâm trạngthái sinh lý của lá là yêu cầu quan trọng Tuy giống cúc n ày phát triển rất tốt trong bìnhnuôi cấy, lá xanh đậm và to tạo thuận lợi cho việc lấy mẫu nh ưng theo kinh nghiệmnghiên cứu thì việc lấy các lá không ở vị trí ngọn cũng nh ư gần gốc là điều cần thiếtnhất là đối với nghiên cứu chuyển gen Điều n ày rất rõ đối với nghiên cứu nuôi cấy mô

và chuyển gen đối với cây hoa cát t ường (tài liệu cá nhân)

Chúng tôi đã bố trí một số môi trường thí nghiệm tái sinh tr ên cơ sở khoáng MS với

các nồng độ NAA 0,1; 0,5 v à 1mg/l kết hợp với BA 1 v à 2mg/l Kết quả cho thấy, nóichung, khi NAA cao (0,5; 1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2 mg/l thì sự tái sinh chồi xảy

ra theo kiểu phát sinh cơ quan (organogenesis) [22] thông qua giai đo ạn trung gian là

mô sẹo Ngược lại, khi nồng độ NAA thấp h ơn (0,1mg/l) kết hợp với BA 1 hoặc 2 mg/l,nhất là khi dùng 2mg/l, thì sự tái sinh chồi xảy ra ít qua giai đoạn mô sẹo, một số chồi

có vẻ hình thành trực tiếp từ mảnh lá [20,22,23] Đặc biệt, sự hình thành trực tiếp này là

thường theo kiểu sinh phôi sô-ma [19], xảy ra nhiều khi chỉ dùng BA từ 1 - 2mg/l mà

không bổ sung NAA (số liệu cá nhân)

Theo một số tác giả nước ngoài nghiên cứu chuyển gen trên cây cúc, sự tái sinhtheo dạng trực tiếp này không có lợi cho nghiên cứu Kết quả nghiên cứu của chúng tôiphù hợp ý kiến nêu trên Về vấn đề này, thực tế nghiên cứu cho thấy khả năn g nhận

được cây chuyển gen sẽ cao h ơn khi điều chỉnh sự tái sinh thông qua mô sẹo v ì theo

chúng tôi tế bào chuyển gen, trước hết, cần được nhân lên và như vậy sẽ tạo cơ hội caocho sự tái sinh cây mang gen chuyển Nói chung, hiện nay tr ên thế giới, nghiên cứu nuôicấy mô phục vụ nhân giống [2], sự phát sinh h ình thái [4,8, 20,22,26] và ph ục vụchuyển nạp gen [17,18] đã và đang được các nhà khoa học quan tâm rất nhiều ở đối

tượng cây trồng này

c Quy trình chuyển gen

Như đã nói ở trên do tính rất mẫn cảm với hygromycin nên chúng tôi, như đã trình

bày trong phần quy trình chuyển gen, sự chọn lọc đ ược thực hiện ở giai đoạn đầu với

10mg/l hygromycin, sau đó giảm xuống còn 5mg/l nhằm tạo cơ hội cho sự tái sinh.Cách làm này của chúng tôi phù hợp với cách thực hiện của một số tác giả n ước ngoài

vì theo các tác giả ấy, trên giống cúc cụ thể ở công bố, th ì sự tái sinh không thể xảy ra

dù đã có sự chuyển nạp gen (gen hph)

Cũng do quá mẫn cảm đối với hygromycin n ên quá trình chọn lọc tế bào chuyểngen từ sau xử lý vi khuẩn đến khi nhận được cây thì khá dài Điều này là do trên môi

trường có hygromycin tế b ào tăng sinh chậm và cây khi đã có đầy đủ thân lá phát triển

cũng rất chậm Và thực tế cũng cho thấy khi đ ã là cây chuyển gen nhưng chúng cũngphát triển khá chậm trên môi trường có nồng độ hygromycin dù không phải ở mức quácao (5mg/l) Theo chúng tôi, đây là đi ểm đáp ứng đặc thù của các giống cúc khi sử dụngtác nhân chọn lọc là hygromycin Qua quá trình chuy ển gen, chúng tôi đã nhận được 3dòng chồi có khả năng vươn cao thành cây Chúng đư ợc kiểm tra về khả năng sinh

trưởng, ra rễ trên môi trường có hygromycin sẽ đ ược trình bày dưới dây

Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học dùng nhiều phương pháp khác nhau [3, 6,

12, 16, 17, 21, 23, 24, 27] để chuyển một số gen khác nhau nhằm tạo ra các đặc tínhmới cho cây cúc như cây chậm lão hoá [5, 9, 10, 13], tạo hoa có màu sắc mới lạ, khángvirus [27]

d Kiểm tra khả năng ra rễ tr ên môi trường có hygromycin

Các cây vươn cao t ừ 2cm trở lên được cấy sang môi tr ường MS không chất sinhtrưởng có 5mg/l hygromycin đ ể theo dõi sự sinh trưởng tiếp theo So sánh với câyđối chứng, sự sinh tr ưởng tiếp tục với biểu hiện k èm theo là có sự hình thành rễ là

hai hiện tượng xảy ra đồng thời đối với cây thực sự l à cây chuyển gen; ngược lại,

cây đối chứng mất ho àn toàn khả năng sinh trưởng dẫn đến sự chết sau đó tr ên cùng

loại môi trường

e Thử GUS

Điểm gây sự chú ý ở đây là các dòng chuyển gen đều cho kết quả âm tính đối với thử

nghiệm GUS Điểm đặc biệt nữa l à không chỉ riêng giống cúc này trên các dòng chuyển

gen khác nhau mà đối với giống cúc khác (đại đoá v àng Đồng Tháp) tạo ra cũng bằngphương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium và bằng phương pháp chuyển gen khác (là bắn

gen) thì tất cả các dòng chuyển gen cũng đều cho kết quả âm tính (tài liệu của phòng) Theomột tài liệu nước ngoài, hiện tượng âm tính đối với thử GUS n ày vẫn chưa giải thích đượckhi dùng dòng vi khuẩn LBA 4404 để chuyển nạp v à khi dùng promoter CAMV35S cho

gen gusA Tuy nhiên, theo chúng tôi, đây ch ỉ là gen chỉ thị nên dù có biểu hiện hay không làđiều không quan trọng, chỉ có điều nó gây cho ng ười nghiên cứu ít nhiều khó khăn khi

muốn kiểm tra nhanh cây chuyển gen khi ch ưa cần làm PCR

f Phân tich PCR các gen hph, gusA và ipt

Các dòng cây được kiểm tra bằng PCR chỉ khi chúng đã qua giai đoạn tạo rễ và có

sinh trưởng bình thường trên môi trường có 5mg/l hygromycin Kết quả phân tích PCR

các gen hph, gusA, ipt v ới các cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của các băng

DNA được khuếch đại tương ứng là 800 bp, 365 bp và 355 bp

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu nuôi cấy tái sinh cây v à chuyển nạp gen trên cây cúc đại đoá vàng

Đà Lạt nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chúng tôi có một số kết luận sau:

 Trong số các môi trường khảo sát, môi trường thích hợp đồng thời cho việc tái sinhcây và cho nghiên cứu chuyển nạp gen (ở khía cạnh cần sự tái sinh cây thông qua

mô sẹo) là môi trường MS có 0,5mg/l NAA v à 1mg/l BA

 Giống cúc nói trên rất mẫn cảm đối với hygromycin n ên việc chọn lọc áp lực cao(10mg/l hygromycin) ch ỉ nên được thực hiện trong 1 - 2 chu kỳ đầu, sau đó cầngiảm xuống (5 - 6mg/l hygromycin) ở giai đoạn tái sinh để có thể nhận đ ược chồitái sinh

 Đã nhận được 3 dòng cây cúc mang gen ipt, gen hph và gen gusA Sự hiện diện của

chúng đã được kiểm tra bằng phân tích PCR

LỜI CÁM ƠN

Các tác giả xin chân thành cám ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí

Minh đã tài trợ cho nghiên cứu này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Aida, R., S Nagaya, K Yoshida, S Kishimoto, M Shibata , A Ohmiya, 2005.Efficient transgene expression in chrysanthemum, Chrysanthemum morifoliumRamat., with the promoter of a gene for tobacco elongation factor 1  protein.JARQ 39(4): 269-274

2 Bhattacharya, P., S Dey, N Das, B C Bhattacharya, 1990 Rap id masspropagation of Chrysanthemum morifolium by callus derived from stem and leafexplants Plant Cell Rep 9: 439-442

Hình hàng trên (từ trái sang phải): Phôi sô -ma, chồi hình thành trực tiếp và gián

tiếp từ mảnh lá Hình hàng dưới (từ trái sang phải): Cụm chồi kháng hygromycin; phân tích PCR

gen hph (800 bp), gen gusA (365 bp) và gen ipt (355 bp)

3 Boase, M R., J M Bradley, N K Borst, 1998 Genetic transformation mediated

by Agrobacterium tumefaciens of Florists’ chrysanthemum (Dendranthema

grandiflorum) cultivar ‘Peach Margaret’ In vitro Cell Dev Biol.- Plant 34: 46-51.

4 Bush, R., E D Earle, R W Langhans, 1976 Plantlets from petal segments, petalepidermis and shoot tips of the periclinal chimera, Chrysanthemum morifo lium

‘Indianapolis” Am J Bot 63: 729-737

5 Chang, H., M L Jones, G M Banowetz, D G Clark, 2003 Overproduction ofcytokinins in Petunia flowers transformed with PSAG12-IPT delays corollasenescence and decreases sensitivity to ethylene Plant Physiology 132: 2174-2183

6 De Jong, J., W Rademaker, M F Van Wordragen, 1993 Restoring adventitiousshoot formation on chrysanthemum leaf explants following co -cultivation withAgrobacterium tumefaciens Plant Cell Tiss Org Cult 32: 263-270

7 Jefferson, R A., T A Kavanagh, B W Bevan, 1987 GUS fusion: glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO 6: 3901-3907

-8 Kaul, V., R M Miller, J F Hutchinson, D Richards, 1990 Shoot regenerationfrom stem and leaf ex plants of Dendranthema grandiflora ‘Tzvelev’ (syn

Chrysanthemum morifolium Ramat.) Plant Cell Tiss Org Cult 21: 21-30.

9 Khodakovskaya, M V., R McAvoy, H Liu, Y Li, 1998 Ethylene -regulatedexpression of the ipt gene increases flower number in trans genic Dendranthemagrandiflorum Abstracts, Society for In Vitro Biology

10 Khodakovskaya, M V., Y Li, J Li, R Vankova, J Malbeck, R McAvoy, 2005.Effects of cor15a-IPT gene expression on leaf senescence in transgenic Petuniahybrida and Dendranthema grandiflorum Plant Growth Regulation 00: 00-00.Richard.McAvoy@uconn.edu

11 Kim Hong, N T., E J Kane, P J Dix, 1998 Hormonal regulation of senescence incauliflower (Brassica oleracea var Botrytis) (Abstract) In: Altman A., Ziv M.,Izhar S (eds), Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century, IXInternational Congress on Plant Tissue Culture Kluwer Academic Publishers,Dordrecht, The Netherlands, p 164

12 Ledger, S E., S C Deroles, N K Given, 1991 Regeneration and mediated transformation of chrysanthemum Plant Cell Rep 10: 195-199

Agrobacterium-13 McCabe, M S et al., 2001 Effects of PSAG12-ipt gene expression on developmentand senescence in transgenic lettuce Plant Physiol., 127: 505-516

14 McCabe, M S., U Mohapatra, F Sch epers, K Van Dun, J B Power, M Davey,

1998 Delayed senescence in transgenic lettuce using an autoregulated ipt gene J.Exp Bot Suppl 49: 49

15 Murashige, T., F Skoog, 1962 A revised medium for rapid growth and bioassaywith tobacco tissue culture Physiol Plant 15: 473-497

16 Renou, J P., P Brochard, R Jalouzot, 1993 Recovery of transgenicchrysanthemum (Dendranthema grandiflorum Tzvelev) after hygromycin resistanceselection Plant Science 89: 185-197.i1

17 Sherman, J M., J W Moyer, M E Dau b, 1998 A regeneration andAgrobacterium-mediated transformation system for genetically diversechrysanthemum cultivars J Amer Soc Hort Sci 123: 189-194

18 Shinoyama, H., T Kazuma, M Komano, Y Nomura, T Tsuchiya, 2002 Anefficient transformation system in Chrysanthemum [ Dendranthema x grandiflorum(Ramat.) Kitamura] for stable and non -chimeric expression of foreign genes PlantBiotechnology 19(5): 335-343

19 Tanaka, K., Y Kanno, S Kudo, M Suzuki, 2000 Somatic embryogenesis and

plant regeneration in chrysanthemum ( Dendranthema grandiflorum (Ramat.)

Kitamura) Plant Cell Rep 19:945-953

20 Teixeira da Silva, J A., 2003 Thin cell layer technology for induced response andcontrol of rhizogenesis in chrysanthemum Plant Growth Regulation 39: 67-76

21 Teixeira Da Silva, J A., S Fukai, 2002 Increasing transient and subsequent stabletransgene expression in chrysanthemum following optimization of particlebombardment and Agroinfection parameters Plant Biotechnology 19(4): 229 -240

22 Teixeira da Silva, J A., S Fukai, 2003 Chrysanthemum organogenesis throughthin cell layer technology and plant growth regulator control Asian Journal of PlantSciences 2(6): 505-514

23 Teixeira da Silva, J A., S Fukai, 2003 Four gene introduction methods affect theshoot regeneration and localization of transgene expression in greenhouse stemexplants and in vitro-grown chrysanthemum stem thin cell layers African Journal

of Biotechnology 2(5): 114-123

24 Urban, L A., J M Sherman, J W Moyer, M E Daub, 1994 High frequencyshoot regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum(Dendranthema grandiflora ) Plant Sci 98: 69-79

25 Wang, J., D S Letham, E Cornish, K R Stevenson, 1997 Studies on cytokininsaction and metabolism using tobacco p lants expressing either the ipt or the gus genecontrolled by a chalcone synthase promoter: 1 Developmental features of thetransgenic plants Aus J Plant Physiol 24: 661-672

26 Xiaohan, Y., J Bo, Z Yan, M Ding, T Xuemei, 2002 Enhancement of directshoot regeneration from internode segments of chrysanthemum by silver nitrate.Propagation of Ornamental Plants 2(1): 28-37

27 Yepes, L C., V Mittak, S -Z Pang, C Gonsalves, J L Slightom, D Gonsalves,

1995 Biolistic transformation of chrysanthemum wit h the nucleocapsid gene oftomato spotted wilt virus Plant Cell Rep 14: 694-698

In vitro plant regeneration and transformation of

Dendranthema grandiflorum L with the ipt gene for cytokinin

production

Nguyen Huu Ho, Le Tan Duc, Phan Tuong L oc, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh

Institute of Tropical Biology

The leaf disks of Dendranthema grandiflorum L (0.6 x 0.6 cm) were co -cultivatedwith Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 This Agro-strain contains theplasmid pVDH396 harbouring the ipt gene (with SAG12 promoter) for the isopentenyltransferase enzyme, the nptII gene (for kanamycin resistance) and the reporter genegusA After 2 day co-cultivation, The leaf disks were transferred to the mediumcontaining hygromycin of 10 mg/l for sel ection Through 4 - 5 rounds of selection, 3independent transformed plants were obtained The presence of the hph, gusA and iptgenes was checked by the PCR analyses and / or the GUS assay [In the case of gusAgene: positive in the PCR analysis; negative for the expression of gene in the differentorgans of three in vitro transformed plant lines, in the GUS assay] These transgenicsare being grown in the greenhouse for further studies

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU HƯỚNG ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO

vắc-xin VIÊN GAN B TỪ CÂY TRỒNG

Nguyễn Hữu Hổ, Trương Thiện Trí, Lê Tấn Đức,

Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Tâm

Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Thời gian gần đây, công nghệ sinh học đặc biệt l à công nghệ gen đã có những bướctiến vượt bậc, qua đó các nhà khoa học nhiều nước (Mỹ, Cuba, Đức, H àn Quốc, TrungQuốc, Tây Ban Nha…) có thể sản xuất vắc -xin tái tổ hợp từ cây trồng

[9,10,11,15,16,17,19,20] Hư ớng nghiên cứu sản xuất vắc-xin này được xem là hướng

có tiềm năng vô cùng lớn vì theo tính toán giá thàn h sản phẩm sẽ thấp hơn rất nhiều sovới giá thành các sản phẩm hiện dùng do có thể sản xuất ở quy mô lớn, lại khá đ ơn giảntrong khâu tổ chức sản xuất, vận chuyển v à bảo quản nguồn vắc-xin, sản phẩm khôngchứa các virus gây bệnh cho người… - tạo điều kiện thuận lợi phục vụ tiêm chủng vắc-xin mở rộng cho người dân ở các nước nghèo và các nước đang phát triển Nêu đề tàinghiên cứu này, chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu của mình, cùng với kết quảnghiên cứu theo hướng này của các nhà khoa học khác trong nước, sẽ góp phần nhất

định vào sự phát triển của lĩnh vực nghi ên cứu, sản xuất vắc-xin từ các nguồn vật liệu

truyền thống nói chung v à vắc-xin được sản xuất từ cây trồng nói ri êng

Như chúng ta đã biết, nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi B

(HBV) Tỷ lệ người mang mầm bệnh v ào khoảng 10-15 % dân số (trên dưới 10 triệu

người) Tình trạng nhiễm này đã gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng Bệnh này lây lantheo hướng đa dạng và phức tạp, trường hợp bệnh mạn tính có thể dẫn đến x ơ gan và

ung thư gan, thời gian chữa trị kéo d ài hơn nữa chi phí điều trị còn rất cao so với thunhập Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp ph òng ngừa quan trọng làchủng ngừa Tuy nhiên, chi phí cho chủng ngừa bệnh cũng còn khá cao nếu tuân thủphác đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách quãng thời gian)

Protein HBsAg của HBV là thành phần rất quan trọng giúp cho HBV bám dính v àomàng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh và huyết tương có chứaHBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyết

tương (ngoài huyết tương, vắc-xin này còn được sản xuất từ nấm men, tế b ào động vật

hữu nhũ…) Đã có một số công bố khoa học li ên quan đến nghiên cứu chuyển nạp genHBsAg (mã hoá protein vỏ - HBsAg), dùng công nghệ chuyển gen vào nhân và lục lạp

tế bào, vào một số cây trồng, sản xuất sinh khối mô tế b ào cây chuyển gen, chiết táchprotein tinh khiết và nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch ở c ơ thể động vật qua tiêm

chích protein tinh khiết hoặc/và ăn trực tiếp sản phẩm cây chuyển gen Qua các nghi êncứu nêu trên, nhận thấy protein kháng nguy ên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hoá cókhả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt - mở ra triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gen nàyvào các cây trồng có bộ phận ăn tươi được như quả, lá, thân, củ… Cũng qua một sốcông bố nêu trên, kết quả nghiên cứu còn có mặt hạn chế là lượng protein (sản phẩmcủa gen chuyển) trong cây chuyển gen c òn chưa cao nên trong nghiên c ứu này, chúng

tôi đặt vấn đề đưa hệ thống sao chép T7 của thực khuẩ n thể vào nghiên cứu ở đối tượng

thực vật (vấn đề đã gây được sự quan tâm đặc biệt chỉ trong v ài năm gần đây) kết hợpvới promoter PDS tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả nhằm hướng làm tăng hàm lượngprotein kháng nguyên trong lo ại mô này Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, gen HBsAg vớipromoter PDS được nghiên cứu sự tích hợp và biểu hiện trước hết ở cây thuốc lá tuyrằng protein biểu hiện chuy ên biệt ở quả cây thuốc lá không có ý nghĩa sử dụng nh ư

“vắc-xin ăn được” và kết quả nghiên cứu chuyển gen này trên cây cà chua quả bi là kết

quả khoa học mang tính mới mẻ

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống thuốc lá, cà chua: Sử dụng giống thuốc lá sợi v àng K.326 và cà chua bi qu ả

dài (mua ngoài chợ) Hạt được khử trùng bằng nước Javel 50 % (v/v) trong 5 phút, rửasạch bằng nước cất và được cấy trên môi trường không chất sinh tr ưởng Các mảnh lácây in vitro với kích thước khoảng 0,7 x 0,7cm (đối với thuốc lá) và lá mầm của câymầm 7-10 ngày tuổi (đối với cà chua) được sử dụng làm nguyên liệu chuyển gen

Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy: Sử dụng môi tr ường cơ bản MS

(Murashige và Skoog, 1962) [13]

 Gieo hạt sau khử trùng và nuôi cây giai đoạn tạo rễ: MS không chất sinh tr ưởng

1/ Tái sinh chồi, cây từ mảnh lá: MS + 0,1mg/l NAA + 1 mg/l BA (đối với thuốclá), MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA (đối với cà chua)

Điều kiện nuôi: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux.

Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:

2/ LBA 4404 chứa plasmid pITB-HBsAg ( 16,78 kb) (do TS Nguyễn Hữu Tâmthiết kế) mang gen HBsAg (promot er T7, terminator T7;  0,7 kb), gen gusA (promoterT7, terminator T7) và gen nptII kháng kanamycin (promoter CaMV35S) Gen HBsAg

mã hoá protein nhỏ S và gen gusA được điều khiển bởi hệ thống [promoter PDS(phytoene desaturase,  2 kb) + T7-polymerase (2,7 kb)] tạo sự biểu hiện chuyên biệt ởquả Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có 50mg/l kanamycin trước khi gâynhiễm mô

Quy trình chuyển gen:

 Cấy các mảnh lá (đối với thuốc lá) v à lá mầm (đối với cà chua) trên môi trường 2;

nuôi 2 ngày ngoài sáng

 Gây nhiễm mô với vi khuẩn trong 10 phút v à nuôi chung mô và vi khuẩn trong 2ngày trên môi trường 2; để ngoài sáng (trường hợp cà chua thì môi trường có bổ

sung acetosyringone 100 M)

 Rửa vi khuẩn bám vào mô bằng nước cất + 500mg/l cefotaxime, thấm khô nhẹ mô

 Cấy mô lá / lá mầm trên cùng môi trường 2 có 500mg/l cefotaxime và tác nhân

chọn lọc kanamycin 100 mg/l (đối với thuốc lá) hoặc tăng dần từ 20 -50mg/l (đối với

cà chua); để ngoài sáng

 Cấy truyền mô hình thành trên môi trường có kanamycin sang môi trường chọn lọcnhư trên (thực hiện 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến khi hình thành chồi và cây con

Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển :

 Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [7]: ủ mô lá, chồi trong thuốc thử GUS ở

37°C (tủ ấm) trong 24 giờ

 Đối với cà chua, mảnh lá của cây giả định chuyển gen đ ược cấy trên môi trường số

2 có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả năng tạo mô sẹo và tái sinh

 PCR: Sự hiện diện của gen nptII, gen gusA v à gen HBsAg được kiểm tra dùng các

cặp mồi đặc hiệu

CTCGTCCTGCAGTTCATTC; khu ếch đại đoạn 600 bp; chương trình nhiệt: 94C: 5 phút;

35 chu kỳ (94C: 1 phút, 55C: 1 phút, 72C: 2 phút); 72C: 7 phút

CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:

30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp

Gen HBsAg: Sử dụng cặp mồi: HBV1: CTACACTCGTGGTGGACTTCTC,HBV2: AACGCCGCAGACACATCC; khu ếch đại đoạn DNA 680 bp; ch ương trìnhnhiệt: 94C:10 phút; 40 chu k ỳ (94C: 50 giây, 45C: 45 giây, 72C: 50 giây); 72C: 7phút; hoặc cặp mồi HBsAg1: ATGGAGAACACAACATC, HBsAg2:

GGATCCTTTTGCGGAAGCCCA; khu ếch đại đoạn DNA 480 bp; ch ương trình nhiệt:

như trên Sản phẩm PCR gen HBsAg (680 bp) c òn được kiểm tra bằng máy phân tích tựđộng Agilent 2100 Bioanalyzer - Automated Analysis System (công ty Agilent

Technologies, Mỹ) với bộ kit DNA 12000 LabChip (công ty Caliper Life Science, Mỹ)

 Sự hiện diện của protein HBsAg đ ược kiểm tra bằng máy phân tích Agilent 2100

Bioanalyzer với bộ kit Protein 200 Plus LabChip của các công ty nói tr ên

 Kiểm tra nhanh sự hiện diện của protein HBsAg trong cây chuyển gen bằng que thửđặc hiệu của công ty Clinotech Diagnostics (Mỹ)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chuyển gen vào cây thuốc lá:

Sau khoảng 15 ngày nuôi cấy chọn lọc trên môi trường có hygromycin, nhìn chung cácphiến lá bị mất dần màu diệp lục, đồng thời có sự hình thành các cụm mô sẹo nhỏ ở mép lá và

sau đó là các chồi nhỏ được tái sinh Trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọckanamycin đúng ngưỡng (100mg/l), màu sắc tương phản của chồi tái sinh (màu xanh lụcđậm) và phiến lá (mất màu xanh) là hiện tượng rất dễ nhận biết; điều này cho thấy các chồi

mới hình thành rất có thể là những chồi đã mang gen chọn lọc Khá nhiều trường hợp cónhiều hơn một chồi / cây hình thành trên 4 đường cắt (chu vi) của một mảnh lá Sau đó, các

cây con được cấy truyền sang môi trường nuôi (môi trường 1) cũng có nồng độ kanamycinnhư trên Ở báo cáo này, cây giả định chuyển gen (GĐCG) được định nghĩa là những cây táisinh trên môi trường tái sinh có nồng độ chọn lọc ngưỡng, có khả năng phát triển tốt rễ thân látrên môi trường nuôi cây (MS không chất sinh tr ưởng) với cùng nồng độ chọn lọc ngưỡng

Thực ra, các dòng cây tái sinh trên môi trường chọn lọc thường cũng có khả năng phát tiển tốt

rễ thân lá trên môi trường nuôi cây chọn lọc Tất cả các d òng cây tái sinh qua xử lý chuyển

gen đều đã được kiểm tra theo cách này trước khi được đem phân tích tiếp theo

Do thuốc lá là một đối tượng có đáp ứng khá cao đối với chuyển gen n ên sau một số chu

kỳ chọn lọc chúng tôi đã nhận được khá nhiều dòng cây GĐCG Theo dự kiến của chúng tôithì gen gusA (cùng với gen HBsAg) sẽ không biểu hiện ở mô sinh d ưỡng như lá, thân, rễ do

chúng được điều khiển bởi promoter PDS chỉ tạo sự biểu hiện chuyên biệt ở quả Kết quả thử

nghiệm GUS đối với các loại mô nói tr ên đều cho kết quả âm tính với thuốc thử X -gluc, hoàntoàn phù hợp với dự kiến Ngược lại, phân tích PCR gen gusA cho kết quả d ương tính với

băng DNA 365 bp

PCR gen chọn lọc nptII và gen mục tiêu HBsAg cũng đã được thực hiện với các trình tự

DNA được khuếch đại theo thứ tự là 600 bp và 680 bp (đối với cặp mồi HBV1 và HBV2)

hoặc 480 bp (đối với cặp mồi HBsAg1 v à HBsAg2) Sự hiện diện cũng như kích thước đoạnkhuếch đại gen HBsAg (680 bp) qua kiểm tra bằng hệ thống phân tích tự động cho kết quảkhớp với kết quả chạy điện di trên gel agarose

Cũng bằng hệ thống phân tích tự động n êu trên, một peak protein có trọng lượng phân tửkhoảng 23 kDa được ghi nhận [trọng lượng phân tử của protein thuộc loại nhỏ (S) trong số baloại protein cấu thành protein kháng nguyên bề mặt của virus (S, preS1, preS2)]; ngược lại, ở

trường hợp đối chứng thì không có Như chúng ta đã biết, protein kháng nguyên bề mặt S là

protein quan trọng trong tạo đáp ứng miễn dịch ở cơ thể người và động vật

Trong nghiên cứu này, do muốn kiểm tra sự chính xác của cấu trúc plasmid, gen v à vaitrò của promoter PDS nên chúng tôi, trước hết, nghiên cứu chuyển gen này vào cây thuốc lá.Hiện chúng tôi đang cấu trúc gen HBsAg với promoter cấu trúc (constitutive) CaMV35Strong hệ thống T7 nhằm tạo biểu hiện cao ở tất cả các bộ phận của cây với hy vọng trong

tương lai có thể nghiên cứu chiết tách protein kháng nguyên tinh khiết từ lá cây thuốc lá - mộtđối tượng cây trồng cho sinh khối lá rất cao t ương tự như một số nghiên cứu trên thế giới

[9,11,15,20] Việc sử dụng promoter tạo biểu hiện chuyên biệt ở một bộ phận của cây tronglĩnh vực nghiên cứu tạo vắc-xin từ cây trồng cũng đã được công bố [4] Ngoài nghiên cứu sảnxuất vắc-xin viêm gan siêu vi B, hiện nay các nhà khoa học còn đang nghiên cứu tạo vắc-xinphòng bệnh viêm gan C từ cây trồng [14]

Các cây chuyển gen đang được trồng và theo dõi ở vườn ươm đến khi ra hoa, kếtquả Chúng tôi sẽ thực hiện một số nghiên cứu liên quan đến sự biểu hiện của genHBsAg và gen gusA ở giai đoạn quả

Kết quả thử nhanh bằng que thử ELISA cho thấy có sự h ình thành vạch dương tính (testline) ngoài vạch đối chứng (control line) ở cây chuyển gen Theo công ty ClinotechDiagnostics, que thử có độ chính xác rất cao (99,8%), tính đặc hiệu tuyệt đối (100%) đối vớitất cả các subtype virus có các quyết định kháng nguy ên (determinants) phổ biến hiện nay.

Chuyển gen vào cây cà chua bi:

Sau khi được cắt ra từ cây mầm, các lá mầm đ ược nuôi 2 ngày trên môi trường số 2

nhằm làm tăng độ khoẻ (pre-conditioning) trước khi lây nhiễm với vi khuẩn Các khâu

xử lý, nuôi chung với vi khuẩn, chọn lọc đ ược thực hiện tương tự trường hợp cây thuốc

lá và đã được trình bày ở phần nguyên liệu và phương pháp

Nói chung, cây cà chua bi có đáp ứng không cao đối với sự chuyển nạp gen mặc d ù

khả năng tái sinh in vitro khá cao (số liệu chưa công bố) Tại thời gian đầu nghi ên cứu,

sau khi nuôi chung, mô đư ợc cấy chọn lọc ngay trên môi trường (MS + 1mg/l NAA + 2

mg/l BA) có nồng độ kanamycin cao - 50 mg/l Kết quả cho thấy, tất cả các lá mầm đềuchết Sau đó, chúng tôi áp dụng chế độ chọn lọc với nồng độ kanamycin t ăng dần từthấp đến cao - từ 20mg/l đến 50mg/l qua 4 chu kỳ chọn lọc và bước đầu nhận được 2dòng cây tái sinh

Mảnh lá của hai dòng cây này, có kích thước khoảng 0,6 x 0,6cm, được cấy trên

môi trường chứa các chất điều ho à sinh trưởng NAA và BA và có 50mg/l kanamycin để

theo dõi khả năng hình thành mô sẹo và tái sinh cây Kết quả cho thấy, khoảng 7 - 10ngày sau nuôi cấy có sự hình thành mô sẹo và có sự tái sinh chồi sau khoảng 20 -30 ngàynuôi cấy; ngược lại, ở lá cây đối chứng, ho àn toàn không có sự hình thành mô sẹo Phân

tích PCR các gen đang đư ợc thực hiện để khẳng định chúng l à cây chuyển gen

Như chúng ta đã biết, việc tạo một số “vắc -xin ăn được” nhằm phòng bệnh viêm

gan B và một số bệnh khác [11,16,18,19, 21] đ ã được thực hiện trên một số đối tượngcây trồng có sản phẩm ăn đ ược trực tiếp (đối với động vật) nh ư khoai tây [1,2,3,8] th ìcây cà chua [6,12] là đối tượng cây trồng được quan tâm vì có thể ăn trực tiếp quả đốivới nghiên cứu tạo đáp ứng miễn dịch cho ng ười Nghiên cứu của chúng tôi nhằm tiếpcận xu hướng này

KẾT LUẬN

Qua sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ,

chúng tôi đã nhận được một số dòng cây thuốc lá và cây cà chua bi mang gen mã hoá

protein kháng nguyên b ề mặt virus viêm gan B Các dòng nói trên c ơ bản đã qua kiểm

Hình 1: PCR gen nptII v ới băng Hình 2: PCR gen HBsAg v ới băng

DNA 600 bp DNA 450 bp

tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chuyển bằng một số phương pháp định tính và sinhhọc phân tử Nghiên cứu này nhằm hướng đến việc tạo “vắc-xin ăn được”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Arakawa, T., 1997 Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenicpotato plants Transgenic Research 6: 403-413a3

2 Bose, B., N Khanna, S K Acharya, S Sinha, 2006 Generation andcharacterization of a single -gene mouse-human chimeric antibody against hepatitis

B surface antigen J Gastroenterology and Hepatology 21: 1439-1447

3 Diminsky, D., R Schirmbech, J Reiman n, Y Barenholz, 1997 Comparisonbetween hepatitis B surface antigen (HBsAg) particles derived from mammaliancells (CHO) and yeast cells ( Hansenula polymorpha): composition, structure andimmunogenecity Vaccine 15(6-7): 637-647

4 Domansky, N., P Ehsani, A H Salmanian, T Medvedeva, 1995 Organ -specificexpession of the hepatitis B surface antigen in potato Biotechnol Lett 17: 863-866

5 Ehsani, P., A Khabiri, N Domansky, 1997 Polypeptide of hepatitis B surfaceantigen in transgenic potato Gene 190: 107-111

6 Gao, Y., Y Ma, M Li, T Cheng, S -W Li, J Zhang, N-S Xia, 2003 Oralimmunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg.World journal of Gastroenterology 9(5): 996-1002

7 Jefferson, R A., T A Kavanagh, B W Bevan, 1987 GUS fusion:-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants EMBO 6: 3901-3907

8 Joung, Y H., et al., 2004 Expression of the hepatitis B surface S and preS2antigens in tubers of Solanum tuberosum Plant Cell Rep 22: 925-930

9 Kapusta, J et al., 1999 Biotechnological approaches to making vaccine in plants.Plant Biotechnology and In vitro Biology in the 21st Century, A Altman et al.(eds.), Kluwer Academic Publishers, 571 -574

10 Kong, Q., L J Richter, Y F Yang, C J Arntzen, H S Mason, Y Thanavala,

2001 Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenicplants Proc Natl Acad Sci USA 98(20): 11539-11544

11 Mason, H S., C J Arntzen, 1995 Transgenic plants as vaccine productionsystems Trends in Biotechnology 13: 388-392

12 McGarvey, P B., J Hammond, M M Dienelt, D C Hooper, Z F Fu, B.Dietzschold, H Koprowski, F H Michaels, 1995 Expression of the rabies virusglycoprotein in transgenic tomatoes Bio/Technology 13: 1484-1487

13 Murashige T., F Skoog, 1962 A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures Physiol Plant 15, 473-497

14 Nemchinov, L G., T J Liang, M M Rifaat, H M Mazyad, A Hadidi, J M.Keith, 2000 Development of a plant -derived subunit vaccine candidate againsthepatitis C virus Arch Virol 145: 2557-2573

15 Ramírez, N., et al., 2003 Expression and characterization of an anti -(hepatitis Bsurface antigen) glycosylated mouse antibody in transgenic tobacco ( Nicotianatabacum) plants and its use in the immunopurification of its target antigen.Biotechnol Appl Biochem 38: 223-230.

16 Richter, L J., Y Thanavala, C J Arntzen, H S Mason, 2000 Production ofhepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immuniza tion NatureBiotechnology 18: 1167-1171

17 Sakakibara, K Y., K Saito, 2006 Genetically modified plants for the promotion ofhuman health Biotechnol Lett 28: 1983-1991

18 Smith, M L., L Richter, C J Arntzen, M L Shuler, H S Mason, 2003 Structura lcharacterization of plant -derived hepatitis B surface antigen employed in oralimmunization studies Vaccine 21: 4011-4021

19 Tripurani, S K., N S Reddy, K R S Sambasiva Rao, 2003 Green revolutionvaccines, edible vaccines African Journal of Biotechnology 2(12): 679-683

20 Valdés, R., et al., 2003 Hepatiris B surface antigen immunopurification using aplant-derived specific antibody produced in large scale Biochemical andBiophysical Research Communication 310: 742-747

21 Webster, D E et al., 2002 Successful boosting of a DNA measles immunizationwith an oral plant-derived measles virus vaccine Virology 76: 7910-7912

SUMMARY

Towards evolving production of Hepatitis B vaccine

from plant

Nguyen Huu Ho, Truong Thien Tri, Le Tan Duc,

Pham Thi Hanh, Nguyen Huu Tam

Institute of Tropical Biology

Towards production of vaccine from the plant cultivars, the leaf disks of tobaccoNicotiana tabacum L and the cotyledons of tomato Lycopersicon esculentum were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing the HBsAggene (with T7 system and PDS promoter) along with the nptII gene (kanamycinresistance gene) and the reporter gene gusA After 2 - 3 day co-cultivation, tissues weretransferred to the medium containing kanamyc in (100 mg/l for tobacco, 20-50mg/l fortomato) for selection Through 3 -4 cycles of selection, several transgenic plants wereobtained The presence of the HBsAg, nptII and gusA genes was checked by PCRanalyses and / or GUS assay [GUS assay: positive for the expre ssion in the fruit butnegative in the leaf, stem and root] The presence of HBsAg protein was carried out bythe Agilent 2100 Bioanalyzer Automated Analysis System and by the quick ELISA testusing the dip stick of the Clinotech Diagnostics Inc The trans genics are being grown inthe greenhouse for further studies

CHUYỂN GEN PHÁT SÁNG gfp VÀO CÂY HOA PHONG LAN Dendrobium cv Burana White NHỜ VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens

Võ Phan Mi Sa, Lê Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh,

Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển

Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Phong lan là loại hoa đẹp do đa dạng về m àu sắc, kiểu dáng; hoa được tiêu thụ phổbiến trên thế giới và trong nước, kinh doanh hoa lan trong n ước có khả năng đạt doanhthu rất cao (1 tỷ đồng/ha/năm) Ri êng tại Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chỉ đạo về pháttriển hoa lan đã được thành lập nhằm xây dựng ch ương trình giống và xác định vùngtrồng hoa lan với quy mô h àng hoá để đưa cây hoa lan trở thành cây nông nghiệp đô thịchủ lực của thành phố Trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng, Thành phố Hồ ChíMinh sẽ phấn đấu mở rộng diện tích trồng lan l ên 200 ha vào năm 2010 Trên th ế giớicũng như ở nước ta, ngoài việc nhân giống phong lan phục vụ sản xuất bằng ph ươngpháp nuôi cấy mô, việc tạo giống (d òng) mới như giống kháng bệnh (nấm, vi khuẩn,virus), giống có dạng cây nhỏ (mini) và đáp ứng các tiêu chuẩn đòi hỏi ngày càng caocủa người tiêu dùng như hoa có màu s ắc và đặc tính mới lạ là những vấn đề đang và sẽ

được quan tâm nghiên cứu

Hiện nay, bên cạnh phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống nh ư lai hữu tính,

gây đột biến , phương pháp công nghệ sinh học (chuyển nạp gen) đ ã và đang chứng tỏ

là công cụ hỗ trợ rất đắc lực cho nghi ên cứu tạo giống và song hành với các phươngpháp tạo giống truyền thống Đến nay đ ã có khá nhiều giống cây trồng biến đổi gen (gen

nhân) được trồng trên diện rộng nhằm mục đích th ương mại Nghiên cứu tạo giống bằng

công nghệ gen đã và đang được thực hiện đối với cây lan một phần v ì việc tạo giống lanbằng phương pháp lai hữu tính tiêu tốn nhiều thời gian và nguồn gen đích mong muốndùng lai tạo không phong phú [12]

Trên thế giới, đã có khá nhiều thông báo đề cập chuyển một số gen v ào cây hoa lan

(vào nhân) như gen bar, gen gusA, gen nptII, gen hpt [11, 14, 16, 17, 18, 24, 25], gen

mã hoá protein vỏ virus (papaya ringspot virus ) [12], trình tự ACC antisense [1]; cũng

đã ghi nhận được công trình nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp [16], luc [5,6] Cây

phong lan Dendrobium lai (hybrid) mang gen luc phát sáng sinh học (bioluminescent

orchid) đã được rao bán đấu giá tr ên thị trường thế giới với giá khởi điểm 200.000 đô -la

Singapore [4] [ở lĩnh vực chuyển gen v ào động vật, cá cảnh Zebra - Zebra fish

Brachydanio rerio mang gen gfp [1] phát sáng có điều kiện (chiếu tia UV) cũng đ ã được

thương mại hoá với giá 5 đô-la/con tại Singapore, Mỹ]

Như chúng ta đã biết, gen gfp (green fluorescent protein gene) t ạo protein GFP có

khả năng phát sáng - được phân lập (từ sứa biển Aequorea victoria), được xác định trình

tự và dòng hoá vào đầu những năm 90 [2, 13] Từ đó, gen n ày được biến nạp và biểuhiện ở nhiều loại cơ thể sinh học khác nhau nh ư vi khuẩn, nấm, động vật có / không có

xương sống và thực vật [3, 8, 13] Ngoài gen gfp, gen luc (mã hoá luciferase, phân l ập

từ đom đóm) [4, 5, 6, 20] cũng tạo sự phát sáng - theo cơ chế khác nhưng ít được nghiêncứu hơn do kỹ thuật tạo phát sáng mô tế b ào cây chuyển gen phức tạp hơn Ở lĩnh vựcchuyển nạp gen vào cây trồng, gen gfp được xem là gen chỉ thị sống (vital) [21, 22, 23],mới [22] và có tiềm năng ứng dụng lớn trong nghi ên cứu [7, 8, 13, 19] Đã có khá nhiềucông trình nghiên cứu chuyển gen này bằng phương pháp bắn gen [23], bằng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens [10, 13] vào một số cây trồng và có thể nghiên cứu sự biểuhiện của gen này ở mức ty thể tế bào Do vậy, theo chúng tôi, gfp là đối tượng gen cần

được xem xét sử dụng trong các nghi ên cứu về biến nạp di truyền

Đến nay, ở nước ta, chưa ghi nhận được công trình công bố chuyển các gen nói

chung, gen gfp nói riêng vào cây hoa lan Vì v ậy, theo chúng tôi, nghi ên cứu chuyểngen gfp cây phong lan (Dendrobium Burana White) là vấn đề cần được quan tâm thựchiện theo xu hướng chuyển gen này vào một số đối tượng cây hoa trên thế giới hiện nay

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống lan: Sử dụng giống lan Dendrobium Burana White có hoa màu tr ắng.

Phương pháp:

Môi trường nuôi cấy mô

1 Môi trường nuôi, nhân protocorm -like body (PLB): 1/2 x MS (Murashige -Skoog,

1962) [15] có1 mg/l BA

2 Môi trường tạo sự vươn chồi: 1/2 x MS có 2mg/l BA

3 Môi trường nuôi cây: 1/2 x MS không có chất sinh tr ưởng

Điều kiện nuôi cấy: 9 giờ chiếu sáng / ngày, nhiệt độ 25-28oC

Dòng vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid

pCAMBIA 1303 (kích thư ớc 12,36 kb) (CAMBIA) mang gen gfp5 tạo protein phát sáng

GFP (green fluorescent protein) , gen gusA và gen kháng hygromycin hph.

Môi trường giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 100mg/l kanamycin Để nhân

giống cho nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn đ ược nuôi cấy lắc qua đ êm trong môi

trường khoáng AB (Chilton v à cs., 1974) cũng có nồng độ kanamycin như trên

Nhiệt độ nuôi cấy: 25 - 28oC

Quy trình chuyển gen

Các cụm nhỏ PLB (được cắt từ cụm to, nhằm tạo vết th ương) với kích thước 0,3 x0,3cm được sử dụng làm vật liệu chuyển gen

Tóm tắt quy trình chuyển gen

1 Nuôi các cụm PLB trên môi trường số 1 trong thời gian 2 ngày

2 Gây nhiễm các cụm PLB với vi khuẩn trong thời gian 10 phút Vớt mẫu ra, thấmbớt dịch vi khuẩn thừa bằng giấy lọc

3 Nuôi chung các cụm PLB với vi khuẩn trong 7 ng ày Sử dụng môi trường số 1 có

bổ sung acetosyringone 100 M

4 Rửa thật sạch vi khuẩn bằng n ước cất và bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l (kếthợp lắc nhẹ)

5 Vớt mẫu ra, thấm ráo n ước và cấy các cụm PLB trên môi trường chọn lọc: môi

trường số 1 có bổ sung 20mg/l hygromycin, 500 mg/l cefotaxime Thực hiện 2 chu

kỳ chọn lọc, thời gian chọn lọc 20 ng ày / chu kỳ

6 Tiếp tục thực hiện sự chọn lọc th êm 3 chu kỳ (20 ngày / chu kỳ) trên môi trườngchọn lọc như trên nhưng có 30mg/l hygromycin

7 Cấy truyền các cụm PLB kháng hygromycin sa ng môi trường số 2 cũng chứa30mg/l hygromycin đến khi vươn chồi, thời gian nuôi khoảng 2 tháng

Kiểm tra cây chuyển gen

1 Tách các chồi vươn cao (khoảng 1-1,5cm) và cấy truyền sang môi trường số 3 có30mg/l hygromycin: theo dõi s ự vươn chồi và ra rễ

2 Nhuộm GUS (Jefferson và ctv, 1987) [ 9]: ủ mô PLB, chồi trong thuốc thử GUS ở37°C (tủ ấm) trong 24 giờ

3 PCR: Sự hiện diện của gen hph, gen gfp được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu.

4 Sự phát sáng của PLB, chồi chuyển gen (đ ược ghi nhận trong điều kiện tối) bằngcách chiếu tia cực tím sóng d ài (365nm) từ đèn cực tím Blak-Ray (công ty UVP,San Gabriel, CA, Mỹ) hoặc sử dụng kính hiển vi huỳnh quang Nikon Chụp ảnhqua kính lúp bằng máy ảnh kỹ thuật số Nikon 8700 8 Mpixels (khi d ùng đèn cựctím cầm tay) hoặc dùng camera (khi dùng h ệ thống kính hiển vi huỳnh qua ng)

TACTTCTACACAGCCATC; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu k ỳ (94C: 1phút, 62C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp

CCCGGCAATAACATACGGCGTG; chương trình nhiệt: 94C: 3 phút; 30 chu kỳ (94C:

30 giây, 56C: 45 giây, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 365 bp

Gen gfp: GFP1: TGGAGAGGGTGAAGGTGATG, GFP2:

TGTGTGGACAGGTAATGGTTG; chương tr ình nhiệt: 94C: 5 phút; 30 chu kỳ (94C: 1phút, 55C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C: 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 500 bp

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Thực tiễn nghiên cứu trên thế giới về sự biểu hiện (phát sáng có điều kiện) củaprotein GFP ở cơ thể cây trồng cho thấy sự phát sáng xanh lục của protein GFP bị chekhuất bởi sự phát sáng đỏ của diệp lục tố khi cây đ ược chiếu ánh sáng cực tím sóng d àihoặc ánh sáng lam Vì vậy, đối với cây trồng lấy hoa trang trí (hồng, cát t ường…), cácnhà khoa học thường chọn đối tượng có hoa màu trắng (không có diệp lục tố) Trongnghiên cứu này, chúng tôi cũng đã sử dụng giống phong lan Dendrobium Burana White

có hoa màu trắng

Bước đầu nghiên cứu cho thấy, giống phong lan n ày tuy nuôi cấy mô không là vấn

đề ở khía cạnh nhân giống v à tạo chồi / cây từ PLB nh ưng tương đối khó thực hiện sự

dung nạp gen gfp hơn so với một số giống khác nh ư Dendrobium Candy Stripe xMadam Cherry (số liệu chưa công bố) trong cùng điều kiện plasmid sử dụng, c ùng điềukiện chuyển nạp và phương pháp chuyển nạp

a Tính chống chịu tự nhiên của mô PLB đối với kháng sinh hygromycin

Tuy đã có thông tin về nồng độ kháng sinh hygromycin d ùng chọn lọc mô PLB đối

với một số giống lan l à 30mg/l nhưng yếu tố nhạy cảm đối với kháng sinh n ày, theochúng tôi, có khác nhau tuỳ giống Thực tế nghi ên cứu của chúng tôi cho thấy giốngBurana White có tính nhạy cảm cao hơn so với giống khác là Candy Stripe x Madame

Cherry Điều này tạo thuận lợi và định hướng cho quá trình chọn lọc là cần sử dụng nồng

độ hygromycin từ thấp đến cao (tăng dần từ 15 mg/l đến 30mg/l) - khác với các nghiên

cứu trên thế giới là sử dụng nồng độ cao 30mg/l hygromycin ngay ở chu kỳ chọn lọc đầutiên; và thực tế cũng cho thấy rằng nếu dùng ngay nồng độ 30mg/l hygromycin thì thínghiệm không đạt kết quả Thậm chí ở có một số lô thí nghiệ m, toàn bộ PLB chết hết khinồng độ hygromycin chỉ 15mg/l được sử dụng sau khi xử lý chuyển gen bằng vi khuẩn

b Giai đoạn nuôi chung

Theo nhiều công bố về chuyển nạp gen ở cây trồng, giai đoạn nuôi chung mô với vikhuẩn thường chỉ kéo dài từ 2 - 3 ngày Nhưng ở đối tượng phong lan chúng tôi nghi êncứu, trên môi trường nuôi chung mô là môi trường 1/2 MS có 1mg/l BA và 100 Macetosyringone thì sau 2 ngày chúng tôi nh ận thấy vi khuẩn mọc rất yếu, th ường khôngnhận biết được bằng mắt thường Vì vậy, chúng tôi kéo dài thời gian nuôi chung l ên 7

ngày và đôi khi để lâu hơn Thời gian nuôi chung kéo d ài ở nghiên cứu của chúng tôi

phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới (có lô thí nghiệm kéo d ài cả tháng); theochúng tôi có thể là do mô PLB khá cứng, tương đối trơn láng tạo độ bám ít, có thể trongcây lan có hợp chất không thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn; h ơn nữa môi trườngnuôi chung lại khá đơn giản (khoáng 1/2 MS) Sự xử lý kéo d ài thời gian nuôi chung

thường ít được sử dụng trừ ở một v ài đối tượng cây trồng và tuỳ loại mô như trường hợp