nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối tượng cây xoan ta (melia azedazach l.) bằng công nghệ gen thực vật

Các gen này đã được thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi gen tăng cường khả năng chống chịu điều

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Biến đổi khí hậu ngày càng diễn ra mạnh mẽ là nguyên nhân làm tăng những bất lợi từ môi trường, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài cây trồng Do sự thay đổi khí quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm dần lên, băng tan ở hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp Lũ lụt, hạn hán và

sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến phát triển nông lâm nghiệp Để thích ứng với những biến đổi khí hậu và những hệ quả của chúng, chiến lược chung của ngành nông lâm nghiệp là ưu tiên tạo ra những giống cây trồng chống chịu được khô hạn, mặn, ngập úng, lạnh và chống chịu với đất có vấn đề như acid, thiếu lân, ngộ độc sắt, ngộ độc nhôm

Những tác động bất lợi từ môi trường như khô hạn, đất nhiễm mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan thường làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của nhiều loài cây trồng (Linhui

et al., 2012) Một trong những phản ứng thường gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nước đó là tăng cường tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa như các loại đường tan, axít amin, v.v để tăng cường áp suất thẩm thấu cho tế bào Proline

và glycine betaine được biết đến là một trong những chất đóng vài trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như khô hạn, mặn, lạnh (Sávio et al., 2012) Trong tế bào thực vật, glycine betaine (GB) được tổng hợp từ choline thông qua hai phản ứng liên tiếp được xúc tác bởi choline monooxygenase (CMO) và betain aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al., 1997) Cũng giống như thực vật

bậc cao, ở vi khuẩn E coli và ở một số động vật, con đường sinh tổng hợp GB cũng

trải qua hai bước là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành GB (Takabe et al., 1998) Ngược lại, con đường sinh tổng hợp GB ở

vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens lại rất đơn giản, từ

choline chuyển hóa thành sản phẩm trực tiếp là GB chỉ cần xúc tác bởi choline oxydase (COD) (Ikuta et al., 1977) Sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể được thực hiện qua hai con đường hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine Con đường sinh tổng hợp proline từ glutamate được chứng minh đầu tiên ở vi khuẩn bởi Leisinger (Leisinger, 1987) và sau đó là ở nhiều loài sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn

khác nhau Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ được xác định sau khi các nhà khoa học thành công trong việc phân lập được đoạn cDNA của gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992) P5CS là một enzyme giữ hai chức năng, thứ nhất enzyme hoạt hóa glutamate trở thành dạng hoạt động là glutamic semialdehyde và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5-carboxylate Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo proline

Từ những hiểu biết sâu sắc về con đường sinh tổng hợp glycine betaine và proline ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen Các nhà khoa học đã phân lập được các

gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT, SDMT, P5CS và P5CR

từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB và proline Các gen này đã được thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi gen tăng cường khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường (Amudha

& Balasubramani, 2011) Các kết quả công bố cho thấy : Cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA,COX, GSMT/SDMT tăng cường khả năng chi ̣u la ̣nh , nhiê ̣t đô ̣ cao,

chịu mặn và băng giá (Ali et al., 1998a, 1998b; Hayashi et al., 1997, 1998; Sakamoto et al., 2000; Huang et al., 2000), cây cải be ̣ (Brassica juncea) chuyển gen codA có khả năng chịu mă ̣n tốt hơn cây đối chứng (Waditee et al., 2005) Tương tự,

cây lúa (Oriza sativa) chuyển gen codA, betA,COX, CMO, cây cà chua, cây hồng, cây bạch đàn chuyển gen codA cũng tăng cườ ng kh ả năng chi ̣u la ̣nh , hạn, mă ̣n và oxy hóa (Sakamoto et al., 1998, Takabe et al., 1998; Su et al., 2006; Shirasawa et al., 2006; Mohanty et al., 2002; Park et al., 2004, 2007a; Yu et al., 2009) Cây thuốc

lá chuyển gen COX, betA, CMO, BADH (Lilius et al., 1996; Nuccio et al., 1998; Yang et al., 2008), cây cà rốt chuyển gen BADH (Kumar et al., 2004); cây bông và ngô chuyển gen betA (Lv et al., 2007; Quan et al., 2004a, 2004b) cũng đã được

chứng minh là chống chịu tốt hơn với các điều kiện cực đoan của môi trường Kết

quả nghiên cứu chuyển gen P5CS, P5CR,  -OAT tham gia sinh tổng hợp proline vào cây thuốc lá, lúa nước, lúa mì, cà rốt, chanh, đậu tương, Arabidopsis cho thấy

cây chuyển gen chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường sống bị mặn, hạn, oxy hóa, nhiệt cao và băng giá (Kavi Kishor et al., 1995; Zhu et al., 1998; Hong et al.,

2000; Anoop et al., 2003; Su & Wu, 2004; Sawahel & Hassan, 2002; Han & Hwang, 2003; Hur et al., 2004; Molinari et al., 2004; De Ronde et al., 2004)

Việt Nam là một trong những quốc gia bị tác động mạnh mẽ của việc biến đổi khí hậu, do đó hạn hán và đất nhiễm mặn hoang hóa đang ngày một gia tăng, đây sẽ là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng cây trồng nông lâm nghiệp và thu hẹp diện tích đất canh tác Vì vậy, việc triển khai các nghiên cứu nhằm ta ̣o ra được các giống cây trồng nông lâm nghiệp có khả năng chống chi ̣u được các điều kiê ̣n bất lợi của môi trường nhưng vẫn đảm bảo được năng suất và chất lượng tốt đang là vấn đề cấp bách và cần thiết nhất hiê ̣n nay Trên thế giới, các nghiên cứu tạo cây trồng biến đổi gen tăng cường chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi chủ yếu tập chung vào nhóm cây nông nghiệp, còn nhóm cây lâm nghiệp (cây gỗ) mới chỉ có một vài công trình công bố (Yu et al., 2009, Yu

et al., 2010) Trong lâm nghiệp, cây dương (Populus sp.) được sử dụng như là cây

mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen Tuy nhiên, hạn chế duy nhất củ a loài cây này đó là khó sinh trưởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam Vì vậy, việc tìm kiếm một loài cây dễ thích ứng và phổ biến ở Việt Nam để làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hướng quan tâm trên đối tượng cây lâm nghiệp trở nên rất cần thiết Cây Xoan ta được đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lược phát triển lâm nghiệp ở nước ta Nó có mặt ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó 3 vùng: Vùng Trung tâm, vùng Đồng bằng Sông Hồng và vùng Nam Trung bộ Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng được ưu tiên phát triển theo quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bước đầu trong việc xây dựng phương pháp chuyển gen ở đối tượng cây Xoan ta là rất có triển vọng (Bui Van Thang et al., 2007a; Nirsatmanto & Gyokusen, 2007; Ngo Van Thanh et al., 2010) cho phép các nhà khoa học có thể tiến hành các nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt

là nâng cao tính chống chịu của loài cây này và có thể sử dụng như một loài cây mô hình cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam Xuất phát từ

những lý do nêu trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường trên đối

tượng cây Xoan ta (Melia azedarach L.) bằng công nghệ gen thực vật”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

2.1 Mục tiêu chung:

Thông qua công nghệ chuyển gen để nghiên cứu khả năng tăng cường tính chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi trên đối tượng cây Xoan ta nhằm bổ sung thêm cơ sở khoa học và thực tiễn cho việc tạo giống cây trồng lâm nghiệp có khả năng chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta thông qua

Agrobacterium tumefaciens;

(2) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A::gus intron và đánh giá hoạt động của promoter rd29A điều khiển biểu hiện gen gus trong điều kiện bình

thường và xử lý hạn nhân tạo;

(3) Tạo các dòng Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen rd29A:: P5CSm và đánh

giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn nhân tạo;

(4) Tạo các dòng thuốc lá và Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen codA/35S::codA và đánh giá kiểu hình, đặc tính sinh lý, sinh hóa của cây chuyển

35S::TP-gen trong điều kiện xử lý hạn, mặn nhân tạo

4 Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam cũng như trên thế giới xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua

Agrobacterium tumefaciens Luận án là công trình đầu tiên tạo được các dòng cây Xoan ta chuyển gen P5CSm/codA và chứng minh được khả năng tăng cường tính

chịu hạn và chịu mặn ở các dòng cây chuyển gen Luận án cũng là công trình đầu

tiên sử dụng gen codA đã được thích ứng mã di truyền ở thực vật để chuyển vào cây

thuốc lá và cây Xoan ta, kết quả cho thấy cây chuyển gen sinh tổng hợp và tích lũy hàm lượng glycine betaine cao hơn rất nhiều lần so với các công trình công bố trước đây Luận án đã góp phần bổ sung thêm cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ chuyển gen trong tạo giống cây trồng nông lâm nghiệp nói chung

và cây Xoan ta nói riêng chống chịu tốt với các điều kiện môi trường bất lợi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÁC ĐỘNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI ĐẾN CÂY TRỒNG

Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trình phát triển Do đó, khác với động vật, thực vật thường xuyên đối mặt trực tiếp với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển Những tác động bất lợi từ môi trường có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh

và hình thái; từ đó ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây trồng

1.1.1 Tác hại của hạn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm của cây trồng Khi môi trường hạn hán cây bị stress mất nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013): (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo Sự co nguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp Khi cây sống trong môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên mềm yếu và sự héo xảy ra Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu

sự thiếu nước xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài (ii) Môi trường sống bị khô hạn cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ Khi thiếu nước do khô hạn sự cung cấp nước cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thương lớp ngoài vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hưởng đến đẩy cột nước lên cao trong mạch

gỗ Đặc biệt khi thiếu nước sẽ hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá

vỡ tính liên tục của cột nước nên cột nước trong mạch gỗ không được đẩy lên liên tục (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nước qua biểu bì (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độ quang hợp Khi hàm lượng nước

trong lá còn khoảng 40 -50% quang hợp của lá bị đình trệ (v) Đặc biệt, hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng Thiếu nước ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý, nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng

1.1.2 Tác hại của đất nhiễm mặn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Đất mặn là loại đất chứa hàm lượng muối cao (>0,2%) có nhiều ion độc Nếu hàm lượng muối trong đất cao, áp suất thẩm thấu của dung dịch đất rất cao, có thể đạt 200 - 300 atm Do đất nhiễm mặn có áp suất thẩm thấu cao nên cây không thể hút được nước từ môi trường gây nên hiện tượng hạn sinh lý Cây bình thường không thể sống trong môi trường có áp suất thẩm thấu trên 40 atm Ngoài ra, trong đất nhiễm mặn còn chứa nhiều ion độc Các ion này cạnh tranh với chất dinh dưỡng trong quá trình hút của rễ làm cho rễ khó hút chất dinh dưỡng dẫn đến cây trồng sinh trưởng chậm và giảm năng suất mạnh Trong đất nhiễm mặn có các muối NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2,, v.v các muối này có hàm lượng cao trong đất đều gây độc cho cây Khi cây hút các ion độc vào trong tế bào sẽ gây ra rối loạn các quá trình trao đổi chất của tế bào Các ion độc sẽ ức chế hoạt động của các enzyme, các chất điều hòa sinh trưởng dẫn đến làm rối loạn các quá trình trao đổi chất và các hoạt động sinh lý bình thường của tế bào Các ion độc còn làm ảnh hưởng bất lợi đến nguyên sinh chất, làm giảm mạnh độ nhớt, tính thấm của nguyên sinh chất làm cho tế bào mất chất dinh dưỡng Các hoạt động sinh lý của tế bào cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng khi cây bị tác động của muối mặn Quá trình quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố quang hợp ít do các chất độc ức chế quá trình tổng hợp các sắc tố quang hợp Quá trình hô hấp tăng mạnh, các cơ chất bị phân hủy mạnh nhưng hiệu quả tạo năng lượng thấp do phần lớn năng lượng của các quá trình dị hóa bị thải ra dưới dạng nhiệt làm cho tế bào thiếu năng lượng ATP để duy trì các hoạt động bình thường Phân hủy mạnh, tổng hợp lại yếu nên không bù đủ lượng vật chất do hô hấp phân hủy, dẫn đến các chất dự trữ bị hao hụt mạnh, do đó cây không sinh trưởng hoặc sinh trưởng chậm, còi cọc và năng suất

thấp Cây sẽ bị chết nếu bị tác động của môi trường nhiễm mặn cao hay nhiễm mặn trong thời gian dài (Jouyban, 2012)

1.1.3 Tác hại của nhiệt độ cao đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng Thực vật là sinh vật biến nhiệt nên nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của cây Biên độ nhiệt độ sinh lý của cây khoảng 1 – 45oC Stress nhiệt do nhiệt độ môi trường xung quanh cao là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với cây trồng sản xuất trên toàn thế giới (Hall, 2001; Harrison et al., 2011) Nhiệt độ cao gián đoạn hoặc liên tục là nguyên nhân gây ra một loạt thay đổi về hình thái giải phẫu, sinh lý và sinh hóa ở thực vật, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của thực vật và có thể dẫn đến suy giảm sản lượng

Sự tiếp xúc của thực vật tới nhiệt độ cao, hạt giống có thể đẩy nhanh quá trình lão hóa, làm giảm sự đậu quả, trọng lượng hạt giống và làm giảm năng suất Điều này là do thực vật có xu hướng chuyển hướng các nguồn năng lượng để chống lại stress do nhiệt và do đó hạn chế sinh trưởng và sinh sản Một ảnh hưởng khác của stress do nhiệt cao cho nhiều loài thực vật là gây ra vô sinh khi nhiệt cao tác dụng ngay trước hoặc trong khi nở hoa Cây họ đậu đặc biệt nhạy cảm với stress do nhiệt

ở giai đoạn nở hoa, chỉ có một vài ngày tiếp xúc với nhiệt độ cao (30 – 35o

C) có thể gây ra tổn thất nặng cho năng suất thông qua giảm lượng hoa hoặc tình trạng không phát triển đầy đủ của vỏ quả Ở nhiệt độ rất cao gây tổn thương tế bào nghiêm trọng

và thậm chí làm cho tế bào bị chết trong vòng vài phút, dẫn đến sự sụp đổ nhanh chóng của các tổ chức tế bào (Schoffl et al., 1999) Ở nhiệt độ cao vừa phải, tổn thương hoặc chết chỉ có thể xảy ra sau khi tiếp xúc lâu dài Tổn thương trực tiếp do nhiệt độ cao bao gồm sự biến tính protein và sự kết tụ, tăng tính lưu động của màng lipid Tổn thương gián tiếp hoặc tổn thương nhiệt chậm hơn bao gồm bất hoạt các enzyme trong lục lạp và ty thể, ức chế tổng hợp protein, suy thoái protein và màng

tế bào mất tính linh hoạt (Howarth, 2005)

Stress nhiệt cao cũng ảnh hưởng đến tổ chức của các cấu trúc vi ống bằng cách chia tách và/hoặc kéo dài của chúng, hình thành các thể sao hình ống trong các

tế bào phân bào và kéo dài của vi ống hạt vách Tổn thương này cuối cùng dẫn tới

ức chế sự tăng trưởng, giảm dòng ion, tạo ra hợp chất độc hại và các loại ôxy phản ứng (reactive oxygen species = ROS) gây độc cho tế bào (Howarth, 2005)

Sinh trưởng của cây trồng giảm sút là kết quả chính của việc cây sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ cao Nguyên nhân chủ yếu là do nhiệt độ cao làm giảm năng suất quang hợp, năng lượng tạo ra giảm sút nghiêm trọng Có giả thiết cho rằng trong các phản ứng của pha sáng, nhiệt độ của lá tăng lên do việc tổng hợp ATP liên tục (bằng quá trình vận chuyển điện tử có tính chu trình) cho đến khi cân bằng với lượng ATP tiêu thụ (Bukhov et al., 1999) Trong các phản ứng pha tối của quá trình quang hợp, sự hoạt hóa Rubisco trong chu trình Calvin đã được xác định như là bước trung gian, sự hoạt hóa này bị ức chế ở 35–40◦C dẫn đến việc giảm tiêu thụ CO2 và giảm tạo ra các carbohydrates (Dubey, 2005; Wahid et al., 2007) Trong

ty thể, điều kiện bất lợi thông thường sẽ là nguyên nhân phá hủy NAD+, ATP tiêu thụ vượt trội và việc hô hấp sẽ tăng lên Việc phá vỡ NAD+ một phần do nguyên nhân của việc tăng cường hoạt động của poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), chất sử dụng NAD+ như là cơ chất để tổng hợp ADP-ribose Quá trình poly(ADP) ribosyl hóa này là quá trình điều hòa sau dịch mã của các protein nhân, là bước được khởi đầu bởi sự oxi hóa và các dạng khác của việc phá hỏng DNA Sự suy yếu gây ra bởi điều kiện bất lợi mang lại sự suy yếu của năng lượng khi mà các phân tử ATP đòi hỏi để tái tổng hợp NAD+ (Zidenga, 2005) Cuối cùng, có thể nói rằng việc chống chịu nhiệt độ của cây là một quá trình tiêu tốn nhiều năng lượng nội bào đáng kể để đối phó nhiệt độ cao Nói chung các phản ứng đó làm suy yếu năng lượng và tăng cường sản xuất ROS, rốt cuộc có thể gây chết tế bào, mô và cả cơ thể (De Block et al., 2005)

1.1.4 Tác hại của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trường vẫn đủ nước do nhiệt

độ thấp ức chế sự hút nước của hệ rễ và sự vận chuyển nước của hệ mạch Nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quá trình quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế các quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp các phân tử protein do các enzyme hoạt động yếu Ở nhiệt độ thấp làm cho màng nguyên sinh chất bị tổn thương dẫn đến tăng tính ngoại thấm nên thất thoát chất dinh dưỡng của tế bào ra bên ngoài Nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của hệ rễ Sự hút nước và chất khoáng bị giảm mạnh làm cho cây thiếu nước và chất dinh dưỡng Nhiệt độ thấp còn làm tổn hại màng lục lạp, ty thể dẫn đến ảnh hưởng nghiêm trọng đến các quá trình sinh lý của cây như quá trình quang hợp, hô hấp Nói chung nhiệt độ thấp làm giảm mạnh sinh trưởng, năng suất và chất lượng sản phẩm của cây trồng (Gulzar et al., 2011)

1.1.5 Phản ứng của thực vật đối với các điều kiện môi trường bất lợi

Các yếu tố cực đoan như nhiệt độ cao, băng giá, ánh sáng, oxy hóa,v.v thường tác động lên lá Hạn, úng và mặn muối thường tác động lên bộ rễ Các yếu

tố cực đoan thường gây ra diện rộng về các phản ứng của thực vật, từ việc thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến tốc độ sinh trưởng và năng suất cây trồng Những biến đổi lớn liên quan đến mức độ sinh trưởng và trao đổi chất khi gặp các yếu tố cực đoan của môi trường sẽ làm thay đổi sự biểu hiện của gen Điều đó bắt đầu từ việc nhận biết tín hiệu ở mức độ tế bào, lan truyền tín hiệu này trong tế bào và tiếp sau đó lan truyền khắp cơ thể sinh vật

Sự biểu hiện của các gen phản ứng đối với các yếu tố cực đoan thể hiện đầu tiên là

ở mức độ tế bào, sau đó đến mức độ toàn bộ cơ thể, tiếp theo là sự thay đổi về hình thái, sinh trưởng, phát triển và cuối cùng làm ảnh hưởng đến khả năng tạo năng suất

và chất lượng sản phẩm của cây trồng (Trần Thị Phương Liên, 2010)

Sự biểu hiện các gen phản ứng với các yếu tố cực đoan của môi trường phụ thuộc vào khả năng nhận biết chúng Bằng chứng là tăng cường các chất điều khiển

những phản ứng của cây trồng đối với các yếu tố cực đoan như xuất hiện abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JA), ethylene, sau đó xuất hiện các phản ứng thứ cấp như xuất hiện Ca2+

(Shinozaki et al., 2007) Mức độ biểu hiện của một số gen tăng hẳn lên, một số khác yếu hẳn đi Điều hòa việc biểu hiện các gen này khi gặp các yếu tố cực đoan của môi trường đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trước khi phiên mã, sau phiên mã, dịch mã, sau dịch mã và từng bước làm sáng tỏ dần cơ chế phân tử liên quan đến tích chống chịu các điều kiện cực đoạn của thực vật Như vậy, khi gặp các yếu tố cực đoan đột ngột, thực vật phải điều chỉnh để thích ứng với sự thay đổi môi trường sống nhằm kéo dài khả năng tồn tại, sinh trưởng và phát triển Phản ứng của thực vật khi gặp điều kiện như hạn, mặn, v.v gây mất nước tế bào, chúng thường tăng cường biểu hiện các gen liên quan đến tổng hợp các chất thứ cấp như các loại đường tan, proline, glycine betaine, v.v để tăng cường áp suất thẩm thấu của tế bào (Khan et al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009) hoặc biểu hiện các gen mã hóa cho các protein chịu hạn, mặn như protein LEA (Porcel et al., 2005) Đối với hiện tượng nhiệt độ cao, chúng sẽ tăng cường mức độ biểu hiện các gen mã hóa cho các protein sốc nhiệt (Hsp – heat shock protein) (Simões-Araújo et al., 2003)

Thời gian, mức độ khốc liệt của các yếu tố cực đoan ảnh hưởng khác nhau đến khả năng phản ứng của cây trồng Hiện tượng mất nước cục bộ chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhưng hạn hán, nhiễm mặn kéo dài sẽ gây thiệt hại cho nhiều loài cây trồng trên một vùng rộng lớn, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm cây trồng (Trần Thị Phương Liên, 2010) Ngoài ra, các cơ quan, các mô tế bào khác nhau

sẽ phản ứng với các yếu tố cực đoan không giống nhau Các loài thực vật khác nhau

sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan của môi trường phụ thuộc vào bản chất di truyền (hệ gen) của chúng Vì vậy, khi đối mặt trực tiếp với các yếu tố bất lợi của môi trường có loài cây có thể chống chịu được để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, có loài cây sẽ bị chết Ngay trong cùng một loài cây, các cá thể khác nhau cũng có mức độ phản ứng khác nhau với yếu tố cực đoan của môi trường (Buchanan et al., 2000)

1.2 TÍNH CHỐNG CHỊU VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI CỦA THỰC VẬT

1.2.1 Cơ chế chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi

Điều kiện bất lợi từ môi trường sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học như mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn, nhiều loài thực vật có các chiến lược đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau Sự phản ứng của cơ thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng loài, kiểu gen, thời gian tác động và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn phát triển, dạng đặc thù của các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng Khi bị tác động bởi các yếu tố bất lợi của môi trường, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc hoặc hoormon giúp chúng có khả năng thích ứng

Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trường ở thực vật đang được tập trung vào hướng nghiên cứu làm tăng cường các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nước Sự tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu được phát hiện trong nhiều trường hợp môi trường bất lợi như hạn hán, muối mặn và lạnh giá (Khan et al., 2009; Szabados & Savoure´, 2009) Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nước do lạnh, muối hoặc hạn Những thực vật sống trong môi trường thiếu nước bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó

Một trong những phương thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan tương tích, protein hoặc các axít amin đặc hiệu (Ashraf et al., 2009) Hiện tượng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước

Sự tích lũy các chất này không làm ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của các enzyme nội bào Ngược lại, sự tích lũy lượng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nước vào tế bào Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và các phức hệ protein Về mặt hóa học, chúng thường là những phân

tử trung hòa về điện, có kích thước rất nhỏ, đóng vai trò quan trọng giúp các phân

tử protein và màng tế bào chống lại sự biến tính dưới tác động của các điều kiện bất lợi phi sinh học (Trần Thị Phương Liên, 2010) Chất bảo vệ áp suất thẩm thấu hay các chất hòa tan tương thích được chia làm 4 nhóm chất sau đây: (1) glycine betaine (là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của axít amin), (2) proline và ectoine (axít amin), (3) polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đường) và (4) các loại đường tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol

Glycine betaine, proline và các nhóm đường thực hiện chức năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất nước Quá trình này liên quan đến một số enzyme chức năng đã được phân lập và phân tích về mặt sinh hóa như các enzyme chủ chốt tham gia sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất điều hòa áp suất thẩm thấu, các enzyme giải độc và các loại protease khác Protein vận chuyển nước qua màng, chất vận chuyển các đường đơn, proline và glycine betaine được xem như có chức năng chuyển nước, proline, glycine betaine, các chất đường đơn qua màng nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện môi trường cực đoan

1.2.2 Cơ chế phân tử liên quan đến tính chống chịu điều kiện môi trường bất lợi

Dưới tác động của yếu tố cực đoạn của môi trường, đầu tiên tế bào thực vật sẽ nhận biết tín hiệu, cảm ứng với điều kiện môi trường, tiếp đến tổng hợp các hormone như ABA, sau đó hoạt hóa các yếu tố phiên mã – TF (transcrition factor) Phần lớn các protein cảm ứng với ABA được xếp vào nhóm RAB Tuy nhiên, có một số gen có thể biểu hiện trong điều kiện thiếu ABA Đa số các gen cảm ứng điều kiện môi trường bất lợi đều đáp ứng với xử lý ABA ngoại sinh, một số khác thì không (Ingram & Barttels, 1996; Shinozaki et al., 1997) Vì vậy, sự biểu hiện gen liên quan đến các đặc tính chống chịu điều kiện môi trường bất lợi không chỉ có các con đường phụ thuộc ABA

mà còn có cả các con đường độc lập ABA (không phụ thuộc ABA)

ABA là một hormone thực vật, điều chỉnh sự phát triển cây trồng, hạt giống ngủ, nảy mầm, phân chia tế bào và phản ứng của tế bào với các áp lực môi trường như hạn hán, mặn muối, lạnh giá, các tác nhân gây bệnh và bức xạ UV (Ueno, 1998; Albinsky et al., 1999) ABA thường thấy trong các loài thực vật bậc thấp và bậc cao Con đường sinh tổng hợp và dị hóa của ABA đã được làm sáng tỏ (Zeevaart, 1999) ABA hoạt động để thực hiện các thay đổi trên nhiều quá trình sinh lý, ví dụ như

nhanh chóng gây đóng các lỗ khí khổng bằng việc bơm các ion từ tế bào bảo vệ, do

đó hạn chế sự mất nước thông qua sự thoát hơi nước (Hetherington et al., 1998; Assmann & Shimazaki, 1999) và bằng cách kích hoạt sự biểu hiện gen, được cho là

để tái lập trình các tế bào để chống chịu được áp lực do mất nước gây ra (Ingram & Bartels, 1996; Leung & Giraudat, 1998) Hạt trong giai đoạn phát triển, ABA đạt mức cao nhất trong giai đoạn phôi muộn khi các protein lưu trữ và dự trữ dinh dưỡng, sau

đó giảm dần (Rock & Quatrano, 1995) Khi mô thực vật bị stress (hạn, mặn,v.v.), mức ABA tăng gấp nhiều, có thể đến 40 lần trong vài giờ và giảm dần sau khi được

bù nước (Zeevaart, 1999) Các bằng chứng hiện có cho thấy, quá trình này ít nhất là

do sự điều khiển phiên mã của các gen sinh tổng hợp và dị hóa ABA (Cutler et al., 1997; Qin & Zeevaart, 1999)

Khi gặp điều kiện cực đoan, các gen liên quan đến tính chống chịu thường biểu hiện với tốc độ nhanh Bởi vậy, vấn đề khởi động phiên mã cũng như cấu trúc của promoter và các protein tham gia vào điều khiển sự biểu hiện gen thông qua việc nhận biết và hoạt hóa quá trình khởi động được đặc biệt quan tâm Trong quá trình này, có thể đồng thời tham gia của nhiều gen tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên mã cũng như các protein/enzyme liên quan đến tính chống chịu Phần lớn các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn đều cảm ứng với các điều kiện lạnh, mặn (điều kiện mất nước sinh lý) Sự điều hòa biểu hiện gen được điều khiển ở nhiều bước khác nhau, từ trước phiên mã, sau phiên mã và dịch mã Nhưng nhìn chung, kiểu điều hòa cơ bản nhất là ở giai đoạn khởi đầu phiên mã Gen được biểu hiện khi RNA-polymerase có thể liên kết vào vùng promoter (trình tự khởi động) của nó và tiến hành tổng hợp bản phiên mã mRNA chứa vùng mã hóa của gen Mức độ biểu hiện của gen trong tế bào được xác định bằng mức gắn kết (ái lực) của RNA-polymerase và các yếu tố phiên mã với promoter

Promoter hay vùng gen khởi động là trình tự DNA rất cần thiết để biểu hiện gen Phần lớn các gen đều được biểu hiện mạnh hay yếu dưới sự điều khiển của các yếu tố phiên mã – TF (transcription factor) TF là các protein có khả năng nhận biết

các trình tự cis đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã Các đoạn trình tự cis – yếu tố cis còn được gọi là các yếu tố điều hòa (regulatory element)

Yếu tố điều hòa phiên mã – TF có rất nhiều loại khác nhau thích hợp với

nhiều loại đoạn trình tự cis, các nghiên cứu ở cây đậu tương cho thấy có trên

1.200 loại TF đặc hiệu cho các loại mô và trong các điều kiện ngoại cảnh môi trường khác nhau Trong đó, biết đến có trên 180 loại TF đặc hiệu ở mô rễ liên

quan đến tính chịu hạn, mặn, v.v Khoảng 5,9% hệ gen của cây Arabidopsis

mã hóa cho trên 1.500 loại TF (Trần Thị Phương Liên, 2010) Các protein tham gia điều khiển biểu hiện gen có thể có chức năng trong việc phản ứng với các điều kiện cực đoan như là protein kinase và các TF TF có các motif có khả năng gắn với trình tự DNA như bZIP (ABI5, ABF và ABREB), MYB, MYC, CBF4, DREB2, v.v (Choi, 2000) Các yếu tố cực đoan của môi trường tác động lên các TF, tiếp theo các TF hoạt hóa khả năng phát hiện và gắn với trình

tự cis trên promoter của gen tạo thành đường truyền tín hiệu phức tạp Từ sự

nhận biết, cảm ứng với điều kiện môi trường đến việc tổng hợp hormone như ABA, sau đó hoạt hóa các TF Phần lớn các protein cảm ứng với ABA được xếp vào nhóm RAB (Choi, 2000) Tuy nhiên, có một số gen có thể biểu hiện trong điều kiện thiếu ABA Phụ thuộc vào phản ứng với ABA, những yếu tố điều hòa trên promoter có thể chia thành 2 loại (hình 1.1): Các yếu tố điều hòa phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA (Shinozaki et al., 2007)

Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế biểu hiện gen khi thực vật bị tác động bởi điều kiện môi trường bất

lợi (Shinozaki et al., 2007)

1.2.3 Vai trò của proline và con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật

1.2.3.1 Proline đối với tính chống chịu điều kiện môi trường bất lợi ở thực vật

Proline là một trong những axít amin được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất đối với tính chống chịu điều kiện môi trường bất lợi ở thực vật Ở nhiều loài thực vật khác nhau hàm lượng proline tăng lên rất cao khi gặp các điều kiện môi trường bất lợi như hạn, mặn, lạnh, nóng, nồng độ chất kim loại cao, nhiễm các loại bệnh, thiếu dinh dưỡng và bị chiếu tia tử ngoại (Hare & Cress, 1997; Saradhi et al., 1995; Siripornadulsi et al., 2002) Mức độ tích lũy proline ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau và có thể cao hơn 100 lần so với cây sống trong điều kiện bình thường Chính vì vậy, sự tích lũy proline được khẳng định là có vai trò rất quan trọng trong các

cơ chế chống chịu với các điều kiện môi trường bất lợi của thực vật Proline được cho

là phản ứng như một loại chất trao đổi thích ứng và là chất để cây dự trữ nguồn carbon

và nitơ (Hare & Cress, 1997) Proline còn là một chất có chức năng khử các gốc oxy phản ứng sinh ra trong tế bào khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi oxy hóa (oxidative stress) (Smirnoff & Cumbes, 1989) Ngoài ra, proline cũng giữ chức năng trong quá trình ổn định các cấu trúc protein và tạo ra trạng thái cân bằng pH và oxy hóa khử của

tế bào Với những chức năng của proline nêu trên, nó được xem là tham gia vào cơ chế truyền tín hiệu của tế bào trong các đáp ứng thích ứng (Maggio et al., 2002)

Ngoài những chức năng nêu trên, proline còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng mặc dù proline không phải là một trong những axít amin không thay thế Sự tích lũy proline được xác nhận ở các loại

mô và cơ quan sinh sản của khá nhiều loài cây, bởi vậy proline còn có vai trò trong quá trình phát triển các loại cơ quan sinh sản ở thực vật Hai quá trình phát triển đã được chứng minh đó là proline tham gia vào quá trình kéo dài cuống hoa và thời gian nở hoa (Mattioli et al., 2009)

Proline được xem là một chất thẩm thấu có vai trò bảo vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử (DNA, protein) khi tế bào bị tác động bởi các điều kiện bất

lợi về áp suất thẩm thấu (Szabados & Savoure, 2009) Tuy nhiên, sự tích lũy proline trong tế bào có thể ảnh hưởng đến khă năng chống chịu của cơ thể thực vật theo nhiều con đường khác nhau Hình 1.2 khái quát về vai trò của proline đối với đặc tính chống chịu ở thực vật

Hình 1.2: Vai trò của proline ở thực vât (Szabados & Savoure, 2009)

Vai trò của proline như là một chất định hình phân tử trong việc bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính xúc tác của nhiều loại enzyme khác nhau Như là, proline có vai trò ổn định hoạt tính của enzyme M4 lactate dehydrogenase khi tế bào bị các tác động bất lợi về nhiệt độ; Proline bảo vệ enzyme nitrate reductase khi tế bào bị các tác động bất lợi về áp suất thẩm thấu và kim loại nặng; Proline cũng có vai trò ổn định hoạt tính của enzyme ribonuclease và protease trong điều kiện tế bào bị tác động bởi nồng độ arsen bên ngoài môi trường tăng cao (Sharma & Dubey, 2005; Mishra & Dubey, 2006) Một số các công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng proline có vai trò như một chất chống oxy hóa, với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và làm bất hoạt các gốc oxy tự do (Matysik et al., 2002) Khi nuôi tế bào nấm men trên môi trường bổ sung proline cho thấy rằng nồng độ các gốc oxy phản ứng giảm mạnh, nên làm chậm quá trình gây chết theo chương trình định sẵn của tế bào (Chen & Dickman, 2005) Proline

có thể bảo vệ các tế bào người chống lại stress oxy hóa gây ung thư (Krishnan et

al., 2008) và đối với các tế bào tảo nuôi cấy ở các điều kiện có nồng độ kim loại nặng cao thì proline có thể làm giảm quá trình phân giải các hợp chất béo (Mehta

& Gaur, 1999) Nghiên cứu ở cây lúa cho thấy proline có vai trò làm giảm độc tính của thủy ngân thông qua quá trình phân cắt các gốc oxy phản ứng như hydroperoxide (Wang et al., 2009) Khi nghiên cứu trên hệ màng thylakoid cũng nhận thấy rằng proline có vai trò ức chế hiệu ứng phá hủy của các gốc oxy tự do tới bộ máy quang hợp II (Alia & Mohanty, 1997) Tác động tiêu cực của tia phóng

xạ đến các tế bào tảo và cây thuốc lá chuyển gen P5CS tăng cường sinh tổng hợp

và tích lũy proline cũng bị giảm mạnh (Hong et al., 2000; Siripornadulsil et al., 2002)

Mặc dù những dẫn chứng về vai trò bảo vệ và phân cắt các gốc oxy tự do trong tế bào của proline là khá đầy đủ, ngược lại những bằng chứng về khả năng duy trình sự ổn định trạng thái cân bằng nội bào còn rất hạn chế Sự tích lũy của các enzyme P5CS1 và P5CR trong lục lạp cho thấy, trong các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, quá trình sinh tổng hợp proline tăng lên ở lạp thể (Székely et al., 2008) Khi cây gặp các điều kiện bất lợi thì tốc độ chu trình Calvin giảm đi nhằm mục đích giảm thiểu quá trình oxy hóa NADPH và dự trữ NAPD+ Khi kết hợp với ánh sáng, dòng điện tử trong chuỗi vận chuyển điện tử bị ức chế bởi không đủ lượng NADP+, điều này dẫn đến sự tăng cường sản xuất các gốc oxy tự do ở trung tâm hệ quang hợp I và tích lũy các gốc oxy phản ứng (ROS) (Chaves et al., 2009) Vì quá trình sinh tổng hợp proline là quá trình khử và cần có NADPH để khử glutamate thành P5C và từ P5C thành proline, nên quá trình này sẽ tạo ra nhiều phân tử NADP+ Bên cạnh đó, quá trình phosphoryl hóa glutamate thành glutamic semialdehyde tiêu thụ ATP và tạo ra ADP, các phân tử ADP này sau đó có thể làm cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp ATP thông qua quá trình quang hợp Chính vì vậy nếu tăng cường tốc độ sinh tổng hợp proline trong lục lạp khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi

có thể giúp duy trì trạng thái cân bằng của NADPH:NADP+, do đó ổn định dòng điện tử, trạng thái oxy hóa khử và ngăn ngừa những hư tổn đến bộ máy quang hợp

(Hare et al., 1997) Ở các dòng đậu tương chuyển gen đối mã với P5CR cho thấy

khi ức chế quá trình sinh tổng hợp proline và phản ứng chuyển hóa NADPH - NADP+ thì các dòng chuyển gen này trở nên nhạy cảm hơn với các điều kiện hạn,

nhưng khi tăng cường hoạt động của gen P5CR thì các dòng chuyển gen có tính

kháng tốt hơn đối với hạn, kết quả này cho thấy khẳng định rằng quá trình sinh tổng hợp proline rất quan trọng đối với việc duy trì hàm lượng NADP+ ở trong tế bào khi cây gặp các điều kiện bất lợi (De Ronde et al., 2004)

Trong ty thể, proline có những chức năng bảo vệ rất riêng biệt Sau khi cây gặp phải các điều kiện môi trường bất lợi, sự tích lũy proline cung cấp thế năng khử cho ty thể thông qua quá trình oxy hóa proline bởi 2 enzyme PDH và P5CDH, cung cấp điện tử cho chuỗi phản ứng hô hấp và do đó cung cấp năng lượng để cây phục hồi quá trình sinh trưởng Proline cũng giữ chức năng bảo vệ phức hệ phản ứng II của chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể trong điều kiện mặn và do đó ổn định các phản ứng hô hấp của ty thể Những phát hiện gần đây về chu trình P5C-proline cho thấy trong một vài điều kiện đặc biệt chu trình này có thể cung cấp điện tử cho chuỗi vận chuyển điện tử của ty thể mà không tạo ra glutamate Quá trình dị hóa proline cũng còn được xem là nhân tố điều hòa quan trọng đối với trạng thái cân bằng các gốc oxy phản ứng của tế bào và có thể ảnh hưởng đến nhiều quá trình điều hoàn khác của ty thể (Szabados & Savoure, 2009)

Sinh tổng hợp và tích lũy proline đã được chứng minh rằng là có tính đặc hiệu cho mỗi loài Tuy nhiên, liệu sự khác nhau này có liên quan đến tính thích ứng của mỗi loài hay không vẫn còn là câu hỏi đối với các nhà khoa học Hai loài cây

chịu mặn Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium tích lũy proline nhiều hơn hẳn so với cây Arabidopsis ở trong điều kiện mặn, mặc dù chúng có họ hàng với nhau Sự tích lũy proline ở cây Thellungiella halophila là kết quả của sự tăng cường hoạt động của gen P5CS và giảm hoạt động của gen PDH (Taji et al., 2004) Nghiên cứu cho thấy rằng, ở loài cây ưa mặn Pancratium maritimum có hàm lượng

proline tích lũy cao trong tế bào đã cải thiện tính chịu mặn thông qua khả năng ổn định hoạt động của các enzyme khử độc, bộ máy vận chuyển protein và kích thích

sự tích lũy các protein có chức năng bảo vệ Ở các loài cây ưa mặn khác như

Camphorosma annua và Limonium spp hàm lượng proline tích lũy không cao

nhưng thay vào đó ở các loài cây này lại tích lũy mạnh nhiều chất thẩm thấu khác như các loại carbohydrate hay các chất tổng hợp từ betain (Murakeözy et al., 2003) Các nghiên cứu này cho thấy rằng, sự tích lũy proline trong tế bào thường đi kèm với những đặc tính chống chịu ở các loài cây bởi vậy có thể cho rằng quá trình tích lũy proline là để giúp cây tăng cường tính chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi Tuy nhiên, sự tích lũy proline không phải là một yếu tố quá cần thiết cho sự thích ứng của các loài thực vật khác nhau khi sống trong điều kiện môi trường bất lợi (Szabados & Savoure, 2009)

1.2.3.2 Con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật

Hình 1.3: Con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao (Delauney & Verma, 1993)

Con đường sinh tổng hợp proline ở thực vật bậc cao có thể được thực hiện qua hai con đường hoặc từ glutamate hoặc từ ornithine (hình 1.3) Proline được sinh tổng hợp từ tiền chất glutamate được coi là một trong những chu trình sinh tổng hợp quan trọng nhất của thực vật ở những điều kiện sinh lý nhất định, khi thực vật bị

giới hạn về nguồn nitơ hoặc sống trong môi trường bất lợi về áp suất thẩm thấu Ngược lại, con đường sinh tổng hợp proline thông qua tiền chất ornithine thường xảy ra khi thực vật sống trong điều kiện môi trường thừa nitơ (Delauney & Verma, 1993) Con đường sinh tổng hợp proline từ tiền chất glutamate được chứng minh đầu tiên ở vi khuẩn (Leisinger, 1987) Ở thực vật bậc cao, chu trình này chỉ được xác định sau khi các nhà khoa học thành công trong việc phân lập được đoạn cDNA của gen mã hóa cho enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) (Hu et al., 1992) P5CS là một enzyme giữ hai chức năng chính, thứ nhất enzyme hoạt hóa tiền chất glutamate trở thành dạng hoạt động của nó là glutamic-semi-aldehyde (GSA) và sau đó xúc tác cho phản ứng đóng vòng để tạo ra pyrroline-5-carboxylate (P5C) Dẫn xuất này sau đó sẽ bị khử bằng phản ứng xúc tác bởi enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase để tạo L-proline

Ở thực vật, proline không chỉ được tổng hợp từ glutamate mà còn từ ornithine Trong quá trình sinh tổng hợp này gốc amin của ornithine có thể được chuyển thành glutamic-semi-aldehyde bởi sự xúc tác của enzyme ornithine-

aminotransferase (-OAT) hoặc thành α-keto-aminovalerate (KAV) bởi sự xúc tác của enzyme -OAT Theo con đường thứ nhất glutamic-semi-aldehyde sẽ được đóng vòng để tạo pyrroline-5-carboxylate do hoạt tính của enzyme pyrroline-5-carboxylate reductase Ở con đường thứ hai α-keto-aminovalerate được đóng vòng tạo pyrroline-2-carboxylate (P2C) do hoạt tính của enzyme pyrroline-2-carboxylate reductase (P2CR) (Delauney và Verma, 1993) Các phân tích về sự biểu hiện của gen -OAT ở cây đậu cho thấy gen này biểu hiện rất yếu trong điều kiện môi trường bình thường và điều kiện môi trường bất lợi, nhưng trong điều kiện môi trường thừa nitơ thì gen này lại biểu hiện rất mạnh (Armengaud et al., 2004) Bởi vậy, quá trình tổng hợp proline từ tiền chất ornithine được cho là diễn ra trong các điều kiện môi trường sống thừa nitơ Trong một số trường hợp đặc biệt như ở cây

cỏ ngọt và cây Arabidopsis gen -OAT biểu hiện rất mạnh, lượng mARN tăng cao

ở các điều kiện môi trường bất lợi về áp suất thẩm thấu Bởi vậy, các nhà khoa học

cũng cho rằng sự tích lũy proline theo con đường sinh tổng hợp từ ornithine có vai trò đối với tính chống chịu của một số loài thực vật khi gặp các điều kiện môi trường bất lợi về áp suất thẩm thấu (Trovato et al., 2008)

1.2.3.3 Sự điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật

Việc nghiên cứu về quá trình trao đổi proline ở thực vật đã được thực hiện nhiều, nhưng đến nay kiến thức về cơ chế điều hòa quá trình trao đổi proline vẫn còn rất hạn chế Sơ đồ hình 1.4 mô tả cơ chế và các tác nhân có vai trò trong quá trình điều hòa trao đổi proline ở thực vật Quá trình sinh tổng hợp proline được hoạt hóa và quá trình dị hóa proline bị hạn chế khi cây trồng bị xử lý hạn Khi cung cấp

đủ nước trở lại cho cây trồng sau xử lý hạn thì các quá trình này sẽ hoạt động theo hướng ngược lại, nghĩa là quá trình di hóa proline được hoạt hóa mạnh và quá trình tổng hợp bị hạn chế (Xue et al., 2009)

Hình 1.4: Cơ chế điều hòa quá trình trao đổi proline ở thực vật (Szabados & Savoure,

2009) Đường màu xanh lá cây là tổng hợp và đường màu đỏ là dị hóa proline

Quá trình sinh tổng hợp proline được kiểm soát chính bởi sử biểu hiện của 2

gen (P5CS1, P5CS2) mã hóa cho enzyme P5CS Hai gen này có độ tương đồng rất

cao về trình tự mã hóa nhưng biểu hiện gen lại rất khác nhau trong những điều kiện

môi trường khác nhau (Armengaud et al., 2004) Các nghiên cứu cho thấy ở cây

Arabidopsis, gen P5CS2 là một gen chủ chốt, hoạt động của gen P5CS2 chủ yếu ở

các mô phân sinh, như: đỉnh chồi, chóp rễ, ở hoa và các tế bào nuôi cấy (Székely et

al., 2008) Hai gen P5CS đều biểu hiện ở các mô phân sinh của hoa nhằm cung cấp proline cho quá trình phát triển của hoa (Mattioli et al., 2009) Ở cây Arabidopsis gen P5CS1 biểu hiện rất mạnh khi được cảm ứng bởi các yếu tố bất lợi về thẩm thấu và

cũng được cảm ứng bởi acid abscisic (ABA) Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy

sử biểu hiện của gen P5CS1 và sự tích lũy proline cũng bị kích thích bởi ánh sáng và

bị ức chế bởi các hợp chất brassinosteroid (Hayashi et al., 2000; Abrahám et al., 2003) Cây sống trong điều kiện môi trường bình thường, enzyme phospholipase D (PLD) giữ chức năng như một chất tham gia vào quá trình điều hòa tích lũy proline Còn khi cây sống trong môi trường bất lợi về mặn, Ca2+ và enzyme phospholipase C

(PLC) kích thích quá trình phiên mã của gen P5CS để tham gia sinh tổng hợp và tích

lũy proline (Thiery et al., 2004) Ngược lại, kết quả nghiên cứu của Knight và đtg

(1997) ở cây Thellungiella halophila chịu mặn cho thấy, PLD lại là một chất điều hòa

có tác dụng kích thích sinh tổng hợp và tích lũy proline, còn PLC được cho là chất điều hòa có tác dụng bất hoạt sự tích lũy proline Ca2+

có chức năng như một chất truyền tín hiệu tương tác với nhân tố phiên mã MYB2 để hoạt hóa sự biểu hiện của

gen P5CS1 khi cây bị stress về muối (Szabados & Savoure, 2009)

Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp và tích lũy proline không chỉ thông qua quá

trình điều hòa sự biểu hiện của các gen P5CS, mà hoạt tính của enzyme P5CS cũng

được kiểm soát bởi quá trình trao đổi proline Zhang và đtg (1995) nghiên cứu cho thấy, khi hàm lượng proline tích lũy trong tế bào tăng cao sẽ dẫn đến sự ức chế phản hồi ngược hoạt tính của enzyme P5CS Còn khi enzyme P5CS không bị ức chế phản hồi ngược bởi proline thì sự tích lũy axít amin này sẽ tăng rất mạnh trong tế bào Quá trình chuyển hóa tiền chất pyrroline-5-carboxylate (P5C) thành proline không phải là bước giới hạn trong chu trình sinh tổng hợp proline Bởi vậy, sự điều hòa hoạt tính của enzyme P5CR cho thấy sự phức tạp trong cơ chế điều hòa sự biểu hiện

của gen P5CR Kết quả phân tích trình tự đoạn promoter điều khiển hoạt động của

gen P5CR phân lập từ cây Arabidopsis đã xác định được một đoạn trình tự có chiều

dài 69 bp quy định hoạt động đặc hiệu mô của gen này Đến nay, các nhà khoa học

vẫn chưa xác định được các nhân tố tác động dạng trans liên kết đặc hiệu với đoạn trình tự cis này (Hua et al., 1999)

Quá trình sinh tổng hợp proline ở thực vật bị kích hoạt bởi ánh sáng và các yếu tố bất lợi về áp suất thẩm thấu (hạn, mặn) Ngược lại, quá trình dị hóa proline lại được hoạt hóa trong điều kiện môi trường sống không có ánh sáng và điều kiện môi trường bình thường Quá trình di hóa proline được kiểm soát bởi hai enzyme là proline dehydrogenase(PDH) và pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase(P5CDH)

(hình 1.4) Quá trình biểu hiện của gen PDH mã hóa cho enzyme PDHđược hoạt hóa bởi chính proline khi cây được cung cấp đủ nước sau khi bị hạn Sự phiên mã

của gen PDH lại bị ức chế khi cây bị stress nước do đó đảm bảo proline không bị phân giải khi cây sống trong môi trường bị stress nước Sự biểu hiện của gen PDH

bị ức chế vào ban ngày nhưng lại được hoạt hóa vào buổi tối do đó hoạt động của

gen này ngược với hoạt động của gen P5CS1 Kết quả phân tích promoter điều khiển hoạt động của gen PDH đã xác định được nhân tố cảm ứng với trạng thái

thẩm thấu và proline, là nhân tố giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình hoạt hóa của gen này (Satoh et al., 2002) Yếu tố phiên mã liên kết với promoter điều khiển

biểu hiện gen PDH là họ protein giàu leucine Kết quả phân tích hoạt động của gen P5CDH ở các mô của cây Arabidopsis cho thấy gen này biểu hiện rất yếu và khi bổ

sung proline vào môi trường thì sự biểu hiện của gen này tăng lên Phân tích đoạn

promoter của gen P5CDH phân lập từ cây lúa và Arabidopsis cũng xác định được các trình tự đặc trưng tương tự trên promoter của gen PDH Borsani và đtg (2005) khi phân tích cơ chế điều hòa sau phiên mã của gen P5CDH cho thấy tồn tại các

đoạn đối mã trong tự nhiên tạo ra các cấu trúc ức chế RNA nhỏ (24 nucleotides và

21 nucleotides siRNA) hoạt hóa cho quá trình cắt các phân tử RNA thông tin của

gen P5CDH, nên làm giảm mức độ biểu hiện của gen này khi cây gặp các điều kiện

bất lợi từ môi trường Kết quả này cho thấy rằng, cơ chế ức chế hoạt động biểu hiện của gen ở mức độ sau phiên mã là rất quan trọng trong việc điều khiển hoạt động

của gen P5CDH ở thực vật Ở cây lanh (Linum usitatissimum) gen FIS1 mã hóa cho

enzyme P5CDH được hoạt hóa khi cây nhiễm virus hoặc bị tổn thương (Ayliffe et al., 2002)

1.2.4 Vai trò của glycine betaine (GB) và con đường sinh tổng hợp GB ở sinh vật

1.2.4.1 Glycine betaine đối với tính chống chịu điều kiện môi trường bất lợi ở thực vật

Glycine betaine (GB) một hợp chất amoni bậc bốn, là một trong những chất hòa tan tương thích hiệu quả nhất và được tìm thấy trong một phạm vi rộng của các loài động vật, vi khuẩn và một số loài thực vật hạt kín chịu hạn hán và chịu mặn (Chen & Murata, 2002) Trước đây GB đã được đề xuất, tăng tích lũy các betaine trong các loài thực vật đóng một vai trò sinh lý quan trọng làm giảm bớt căng thẳng thẩm thấu (Wyn Jones, 1984) Trong tự nhiên, rau bina, ngô, củ cải đường và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy GB xảy ra trong quá trình cây bị căng thẳng (stress) với muối, hạn hán và nhiệt độ thấp (Bohnert et al., 1995) GB bảo vệ cây bằng cách hoạt động như một chất hữu cơ có ảnh hưởng đến thẩm thấu (osmolyte), duy trì cân bằng nước giữa các tế bào thực vật và môi trường, ổn định các đại phân tử dưới điều kiện khô hạn và nồng độ muối cao (Papageorgiou & Murata, 1995)

GB tích lũy ở nồng độ cao không gây cản trở chức năng của tế bào chất và

có tác dụng đảm bảo tính ổn định cấu trúc và chức năng của các đại phân tử GB xuất hiện như một yếu tố quyết định tới khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở cây trồng Chất này có hiệu quả lớn và liên quan mật thiết đến khả năng sinh trưởng của cây trồng trong điều kiện môi trường hạn hán và nhiễm mặn Mức độ tích lũy GB tương quan với khả năng chống chịu điều kiện bất lợi GB được tích lũy chủ yếu trong lục lạp, nó đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh và duy trì màng thylacoid,

do đó duy trì hiệu quả quang hợp (Yang et al., 2003)

Trong nhiều loài cây trồng, sự tích lũy tự nhiên của GB đủ để cải thiện tác động tiêu cực của tình trạng mất nước gây ra bởi những vấn đề môi trường khác nhau Bên cạnh đó, một số loài cây trồng như lúa, khoai tây, cà chua, thuốc lá, v.v

tự nhiên không sản xuất GB trong điều kiện stress hoặc không stress Các ứng dụng của GB ngoại sinh có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của môi trường bên ngoài GB ngoại sinh có thể thâm nhập qua lá và được vận chuyển đến các cơ quan nơi nó sẽ góp phần tăng cường khả năng chịu đựng stress Ngoài ra, những loài cây này là mục tiêu tiềm năng cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền của quá trình sinh tổng hợp GB (McCue & Hanson, 1990) Với kiến thức ngày càng hiểu biết sâu rộng về genomics và proteomics cùng với các công nghệ kỹ thuật gen, một số loài thực vật đã được chuyển các gen mục tiêu liên quan đến con đường sinh tổng hợp

GB, các cây chuyển gen đã được chứng minh tăng cường khả năng chống chịu các điều kiện stress phi sinh học (Sakamoto & Murata, 2002)

1.2.4.2 Các con đường sinh tổng hợp glycine betaine ở sinh vật

a) Sinh tổng hợp glycine betaine ở thực vật

Ở thực vật bậc cao, GB được tổng hợp từ serine qua ethanolamine, choline

và betaine aldehyde Quá trình sinh tổng hợp GB ở thực vật trải qua hai bước như sau: (1) Đầu tiên, tiền chất choline được chuyển thành betaine aldehyde (một hợp chất trung gian độc với thực vật) nhờ sự xúc tác của choline monooxygenase (CMO) (2) Tiếp theo, betaine aldehyde được chuyển thành glycine betaine dưới hoạt động của betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al 1997) Mặc dù, con đường tổng hợp GB trực tiếp từ sự N-methyl hóa glycine cũng được biết đến, nhưng sự tích lũy GB ở tất cả các loài thực vật được xác định là con đường tổng hợp từ choline (hình 1.5)

Hình 1.5: Sinh tổng hợp glycine betaine ở thực vật bậc cao (Rathinasbapathi et al., 1997)

b) Sinh tổng hợp glycine betaine ở vi khuẩn Escherichia coli và động vật

Ở E coli và ở một số động vật, con đường sinh tổng hợp GB cũng trải qua

hai bước là khử choline thành betaine aldehyde và oxy hóa betaine aldehyde thành

GB (hình 1.6) Tương ứng, hai bước đó được xúc tác bởi choline dehydrogenase (CDH) và betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) (Takabe et al., 1998)

Hình 1.6: Sinh tổng hợp glycine betaine ở E.coli (Takabe et al., 1998)

c) Sinh tổng hợp glycine betaine ở vi khuẩn Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens

Ngược lại, con đường sinh tổng hợp GB ở Arthrobacter globiformis và A panescens rất đơn giản, choline được chuyển hóa thành GB chỉ cần xúc tác bởi một

enzyme choline oxidase (COD) (hình 1.7) Kết quả là từ tiền chất choline chuyển hóa thành sản phẩm trực tiếp là GB không thông qua hợp chất trung gian (Ikuta et al., 1977)

Hình 1.7: Sinh tổng hợp glycine betaine ở A globiformis (Ikuta et al., 1977)

d) Sinh tổng hợp glycine betaine ở Actinopolyspora halophilia và Ectothiorhodospira halochloris

Ngoài các con đường tổng hợp GB từ choline như trên, một con đường sinh tổng hợp GB bắt đầu từ glycine đã được phát hiện trong hai loài vi sinh ưa mặn là

Actinopolyspora halophilia và Ectothiorhodospira halochloris (hình 1.8) Quá trình

sinh tổng hợp GB được thực hiện bằng 2 enzyme: đầu tiên glycine sarcosine methyltransferase (GSMT) xúc tác bước methyl hóa glycine thành sarcosine (N-monomethylglycine), tiếp theo sarcosine dimethylglycine methyltransferase (SDMT) xúc tác 2 phản ứng liên tiếp chuyển hóa sarcosine thành dimethylglycine

và cuối cùng thành GB (Nyyssölä et al., 2000)

Hình 1.8: Sinh tổng hợp GB ở Actinopolyspora halophilia (Nyyssölä et al., 2000)

Từ các con đường sinh tổng hợp GB ở các đối tượng sinh vật khác nhau như

nêu ở trên, nhận thấy con đường sinh tổng hợp GB ở Arthrobacter globiformis và

A panescens là đơn giản nhất Từ tiền chất choline được chuyển hóa thành GB chỉ cần xúc tác bởi enzyme choline oxidase (COD) được mã hóa bởi gen codA nên chúng tôi chọn gen codA làm gen mục tiêu để nghiên cứu

1.3 CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VỚI ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI

1.3.1 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp proline chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi

Các nhà khoa học đã phân lập được các gen: P5CS, P5CR, P2CR, α-OAT,

v.v mã hóa cho các enzyme tham gia vào chu trình sinh tổng hợp proline Các gen này đã được thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng Các cây trồng biến đổi các gen này đã được chứng minh là tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi

trường Thuốc lá là loài cây đầu tiên được chuyển gen P5CS phân lập từ cây nho

được điều khiển bởi promoter 35S Phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen này cho thấy hoạt động của enzyme P5CS rất mạnh và hàm lượng proline tích lũy

tăng lên từ 10 - 18 lần so với cây đối chứng không chuyển gen Tăng cường tích lũy proline ở các dòng thuốc lá này còn kích thích sự phát triển của sinh khối rễ khi cây bị xử lý mặn Do hàm lượng proline tăng lên rất mạnh ở các dòng thuốc

lá chuyển gen nên kết quả này cho thấy hoạt tính của enzyme P5CS giữ vai trò

quyết định trong chu trình sinh tổng hợp proline ở thực vật Đặc biệt hơn, khi bổ sung thêm nitơ vào môi trường nuôi cấy các dòng thuốc lá này thì hàm lượng proline tăng lên đáng kể so với dòng thuốc lá chuyển gen nuôi trên môi trường không được bổ sung nitơ (Kavi Kishor et al., 1995) Những nghiên cứu về enzyme P5CS tinh sạch từ cây đậu xanh cũng cho thấy enzyme này bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng ức chế phản hồi ngược của proline và hoạt tính của enzyme này giảm tới 50% khi bổ sung 5mM proline ngoại bào (Hu et al., 1992) Bên cạnh đó, nitơ đóng vai trò như là cơ chất và cũng là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi proline và cũng giữ chức năng điều hòa hoạt động của proline

Nghiên cứu trên cây Arabidopsis các nhà khoa học đã chứng minh được

mối quan hệ chặt chẽ giữa hoạt động của enzyme P5CS và sự tích lũy proline trong điều kiện cây bị stress về thẩm thấu (Savouré et al., 1995); Sự xuất hiện hiệu ứng ức chế phản hồi ngược của proline tới hoạt tính của enzyme P5CS cũng

bị ảnh hưởng dưới các điều kiện bất lợi của môi trường Khi chuyển gen P5CS

đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngược (feedback inhibition) bởi

proline vào cây thuốc lá, kết quả các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến

tăng cường tích lũy proline nhiều hơn gấp 2 lần so với các dòng thuốc lá chuyển

gen P5CS kiểu dại (gen P5CS không đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngược) tách từ cây V aconitifolia (Kavi Kishor et al., 1995; Zhang et al., 1995) Thêm vào đó, khi xử lý các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến với 200mM

NaCl thì kích thích sự tích lũy proline Tương tự, loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược đối với enzyme P5CS, Nguyễn Thị Thúy Hường và đtg (2010) đã chứng

minh cây thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến dưới sự điều khiển của promoter

rd29A chống chịu tốt hơn rõ rệt so với cây không chuyển gen ở điều kiện gây hạn nhân tạo Phân tích hàm lượng proline cho thấy các dòng thuốc lá chuyển

gen P5CS đột biến tích lũy proline ở mức độ cao hơn hẳn so với cây đối chứng

không chuyển gen Những kết quả này là dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức chế phản hồi ngược enzyme P5CS bởi proline giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp proline của thực vật trong cả điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu

Ở các loài thực vật tổng hợp mạnh proline thì cây có tính chống chịu tốt hơn

so với các loài thực vật khác trong các điều kiện môi trường bị hạn và mặn (Kavi

Kishor et al., 1995) Cây lúa chuyển gen P5CS phân lập từ cây đậu có tính kháng mặn

tốt hơn hẳn các dòng lúa đối chứng không chuyển gen (Zhu et al., 1998) Tương tự,

khi các nhà khoa học tiến hành chuyển trực tiếp gen P5CS vào hạt phấn của của cây

lúa mì và tiến hành kiểm tra tính kháng trong điều kiện mặn thì cũng cho thấy các kết quả tương tự như ở cây lúa mì (Sawahel & Hassan, 2002) Thêm vào đó, ở cây carot

chuyển gen P5CS cho thấy các dòng tế bào carot chuyển gen có tính kháng muối cao

hơn tới 6 lần so với dòng đối chứng không chuyển gen (Han et al., 2003), cây ôliu

(Olea europaea) chuyển gen P5CS tích lũy proline cao ở điều kiện môi trường mặn 200mM NaCl (Behelgardy et al., 2012) Những kết quả này không chỉ được chứng minh ở thực vật bậc cao mà còn cả ở loài vi tảo Chlamydomonas reinhardtii khi được chuyển gen P5CS Các dòng vi tảo chuyển gen tích lũy proline cao hơn 80% so với

các dòng không chuyển gen Những dòng chuyển gen này sinh trưởng nhanh hơn trong môi trường có chứa 100 µM cadmium và khả năng tích lũy cadmium cao hơn tới 4 lần so với dòng hoang dại không chuyển gen (Siripornadulsil et al., 2002) Gần

đây, gen P5CS phân lập thành công từ cây lúa và khi được chuyển trở lại vào cây lúa

nhằm tăng cường hoạt động của gen này, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh được cải thiện rõ rệt (Hong et al., 2000; Hur et al., 2004)

Bảng 1.1: Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp

proline, chống chịu tốt với điều kiện môi trường bất lợi

Loài cây Gen chuyển Khả năng chống

chịu bất lợi

Tài liệu tham khảo

Lúa P5CS Chịu hạn và mặn Zhu et al., 1998

Lúa OsP5CS2 Chịu lạnh và muối Hur et al., 2004

Đậu tương P5CR Chịu nhiệt và hạn De Ronde et al., 2004

Arabidopsis PRODH Chịu băng giá và mặn Nanjo et al., 1999

Thuốc lá δ-OAT Chịu mặn và hạn Roosens et al., 2002

Lúa δ-OAT Chịu mặn và hạn Wu et al., 2003

1.3.2 Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi

Với những hiểu biết sâu sắc về con đường sinh tổng hợp GB ở sinh vật, cùng với sự phát triển mãnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây

trồng biến đổi gen Các nhà khoa học đã phân lập được các gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT và SDMT từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho

các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp GB Các gen này đã được thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi các gen đã được phân tích có sự tích lũy GB dẫn

đến tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trường như mặn muối, khô hạn, lạnh, băng giá, nhiệt độ cao và tác nhân oxy hóa

1.3.2.1 Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng

chống chịu mặn muối

Độ mặn cao gây ra sự mất cân bằng ion, gây độc hại cho tế bào chất và tăng áp lực thẩm thấu của tế bào (Ward et al., 2003) Thực vật đã phát triển thành hai loại khác nhau liên quan đến các cơ chế để ứng phó với điều kiện môi trường mặn muối Cây chịu mặn tích lũy muối dư thừa trong các không bào, kiểm soát nồng độ muối trong tế bào chất và duy trì một tỷ lệ K+/Na+ trong các tế bào chất (Glenn et al., 1999) Trong khi đó, các cây nhạy cảm với muối, tích tụ các chất hoà tan tương thích, giúp hạn chế sự hấp thu muối và điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào Trong nhiều loài thực vật, GB được tích lũy khi phản ứng với stress muối (Rathinasbapathi

et al., 2001) Nghiên cứu sinh lý học đã chứng minh rằng mức độ tích lũy GB tương quan với mức độ chịu mặn (Saneoka et al., 1995) Các nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng, sử dụng GB ngoại sinh cũng gia tăng khả năng chịu mặn ở một số loài cây không có khả năng tích lũy GB (Hayashi et al., 1998) Trong vài năm gần đây, một số loài thực vật đã được chuyển các gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp GB (Bảng 1.2) Mặc dù sự tích lũy GB thấp, nhưng các cây trồng chuyển gen cho thấy đã cải thiện được khả năng chống chịu với điều kiện stress muối (Sakamoto & Murata,

2002) Ví dụ, Arabidopsis chuyển gen codA tăng cường khả năng chịu muối trong

quá trình nảy mầm hạt giống và các giai đoạn sinh trưởng, phát triển tiếp theo của cây (Hayashi et al., 1997) Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở cây thuốc lá

chuyển gen CDH, mặc dù mức độ tích lũy GB tương đối thấp (Holmström et al., 2000) Thêm vào đó, các loài thực vật chuyển gen codA, bao gồm lúa, hồng Nhật Bản (Diospyros kaki), cà chua (Salanum tuberosum, S lycopersicum) và cải bẹ (Brassica juncea), cho thấy sự tích lũy GB tương quan với khả năng chống chịu điều kiện môi

trường bị stress muối cao (Sakamoto et al., 1998; Gao et al., 2000; Prasad et al., 2000a; Park et al., 2007a; Ahmad et al., 2008)

Cây lúa chuyển gen CDH và codA phân lập từ vi khuẩn có khả năng tích lũy

một lượng lớn chất GB trong tế bào đã được báo cáo (Takabe et al., 1998; Sakamoto et al., 1998) Cây lúa chuyển gen cho thấy có sự tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện bị stress muối, lạnh và hạn Sự cải thiện khả năng chịu

mặn đã được quan sát thấy ở các cây lúa chuyển gen COX, hàm lượng GB tích lũy thậm chí thấp hơn so với hàm lượng GB tích lũy ở cây lúa chuyển gen CDH và codA (Su et al., 2006) Kết quả tương tự cũng được công bố ở cây lúa chuyển gen CMO biểu hiện tích lũy GB ở lục lạp (Shirasawa et al., 2006) Những kết quả này

cho thấy rằng, mặc dù hàm lượng GB tổng hợp và tích lũy ở cây chuyển gen là khá thấp, nhưng cây lúa chuyển gen tăng cường khả năng chịu mặn Có thể, ở cây lúa sự vận chuyển choline từ tế bào chất tới lục lạp hiệu quả hơn, nơi GB tích lũy được sử dụng hiệu quả để giảm thiểu các tác hại của muối lên bộ máy quang hợp

Cây cà rốt (Daucus carota) chuyển gen BADH biểu hiện, tích lũy GB ở lục lạp

cũng đã được chứng minh có khả năng chịu mặn Cây cà rốt chuyển gen tăng trưởng trong điều kiện xử lý muối lên đến 400 mM NaCl, nồng độ mà tại đó các loài cây chịu mặn chỉ có thể tồn tại, trong khi các cây đối chứng không chuyển gen chậm phát triển nghiêm trọng ngay khi xử lý ở nồng độ muối 200 mM NaCl (Kumar et al., 2004) Gần

đây, Waditee và đtg (2005) cũng đã chứng minh biểu hiện của gen ApGSMT và ApDMT ở tảo Synechococcus và cây Arabidopsis Synechococcus và Arabidopsis chuyển gen cho thấy có sự tích lũy hàm lượng GB cao, Synechococcus phát triển mạnh

dưới điều kiện độ mặn cao, lên đến 0,6 M NaCl So với các enzyme oxi hóa choline,

enzyme GSMT và SDMT tăng khả năng chịu mặn lớn ở Synechococcus Sự biểu hiện của các enzyme oxi hóa choline cải thiện khả năng chịu mặn của Synechococcus

khoảng 0,03 M NaCl, trong khi biểu hiện đồng thời 2 enzyme GSMT và SDMT cải

thiện khả năng chịu mặn của Synechococcus khoảng 0,2 M NaCl, từ 0,35 lên đến 0,5 - 0,6 M NaCl Cây Arabidopsis chuyển gen tích lũy betaine trong rễ, thân, lá, hoa và cho

thấy năng suất hạt giống được cải thiện dưới điều kiện môi trường sống bị stress muối, hạn hán và nhiệt độ thấp

1.3.2.2 Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng

chống chịu khô hạn

Thiếu nước hoặc hạn hán là một trong những hạn chế nghiêm trọng nhất của môi trường đến sản xuất nông nghiệp Những nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng, ứng dụng GB ngoại sinh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tham gia sinh tổng hợp GB đều tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng Quan và đtg

(2004b) báo cáo, cây ngô chuyển gen CDH biểu hiện và lích lũy GB ở trong lục

lạp có khả năng chịu hạn Ngô chuyển gen cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn ở các giai đoạn phát triển khác nhau, năng suất hạt của cây chuyển gen cao hơn đáng

kể so với các cây đối chứng không chuyển gen Cây bông chuyển gen CDH cho

thấy cải thiện khả năng chịu hạn (Lv et al., 2007) Các cây bông biến đổi gen tích lũy hàm lượng GB lên đến 2,3 - 2,9 lần cao hơn so với các cây đối chứng không chuyển và cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn hẳn so với cây không chuyển gen từ giai đoạn cây con đến giai đoạn cây ra hoa Tương tự như

vậy, cây lúa chuyển gen codA cũng tăng cường tích lũy GB và cải thiện khả năng

chịu hạn (Sawahel, 2003) Hơn nữa, một vài thí nghiệm cho thấy những tác động tích cực của việc ứng dụng GB ngoại sinh trên các loài thực vật bị stress về nước Hiệu quả tương tự cũng được tìm thấy ở cây Hướng dương và cây thuốc lá dưới điều kiện hạn hán (Iqbal et al., 2005; Ma et al., 2007) Ứng dụng GB ngoại sinh cải thiện tình trạng stress nước, kết quả sản xuất sinh khối tăng lên trong các loài thực vật này

1.3.2.3 Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng

trường bị stress nhiệt độ thấp (Chen et al., 2000) Ứng dụng kỹ thuật di truyển về sinh tổng hợp GB trong một số loài cây trồng đã cho thấy tăng cường tính chống chịu với điều kiện môi trường bị stress nhiệt độ thấp ở tất cả các giai đoạn khác

nhau của sự phát triển của cây chuyển gen Cây Arabidopsis chuyển gen codA, tăng

cường chịu stress lạnh đã đạt được trong quá trình nảy mầm (Alia et al., 1998a) Cây chuyển gen cho thấy tỷ lệ nảy mầm tăng cao so với cây đối chứng không

chuyển gen Kết quả tương tự cũng được báo cáo ở cây lúa chuyển gen codA và cây thuốc lá chuyển gen BADH (Sakamoto et al., 1998; Holmström et al., 2000)

Trong cây cà chua chuyển gen codA, mặc dù hàm lượng GB tích lũy rất thấp

nhưng cây cà chua biến đổi gen biểu hiện tăng cường khả năng chịu lạnh ở tất cả các giai đoạn phát triển, từ hạt giống nảy mầm đến giai đoạn sinh sản Tăng cường khả năng chịu lạnh trong sự hiện diện của mức độ rất thấp GB có thể là do mức ngưỡng rất thấp GB nội sinh (0,1 mmol/g trọng lượng tươi) là đủ để cung cấp bảo

vệ đầy đủ chống lại stress lạnh trong cà chua biến đổi gen (Park et al., 2004) Thêm

vào đó, cây cà chua chuyển gen codA nhắm mục tiêu tích lũy GB ở trong tế bào

chất và trong lục lạp, cho thấy một mối tương quan giữa tích lũy GB trong các khoang này với khả năng chịu nhiệt độ thấp, muối và oxy hóa (Park et al., 2007a)

Cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB ở trong tế bào chất

(cytosolic) cho thấy sự tích lũy GB tăng gấp 5 - 6 lần so với cây cà chua chuyển gen

codA hướng mục tiêu tích lũy GB ở trong lục lạp Mặc dù, sự tích lũy GB thấp ở cây chuyển gen codA hướng mục tiêu lục lạp nhưng vẫn cho thấy cây chuyển gen

tăng cường khả năng chịu lạnh, muối và các căng thẳng về oxy hóa

Stress nhiệt độ thấp gây ra rối loạn chức năng màng tế bào hoặc biến tính protein, gây ra một sự xáo trộn trong hệ thống vận chuyển điện tử vào trong màng

ty lạp thể hoặc chloroplastic và dẫn đến việc sản xuất chất oxy phản ứng (ROS) (Nishiyama et al., 2001) Nồng độ ROS cao trong tế bào sẽ gây tổn hại, ảnh hưởng đến các thành phần tế bào và cũng cản trở việc sửa chữa phức hợp PSII bằng cách

ức chế sinh tổng hợp de novo protein (Nishiyama et al., 2001) Park và đtg (2007a)

cho rằng một trong những lý do có thể bảo vệ tốt hơn chống lại stress nhiệt độ thấp

ở cây cà chua chuyển gen codA hướng mục tiêu tích lũy GB trong lục lạp có thể là

cải thiện khả năng vận chuyển oxy của phức hợp PSII do các sửa chữa được cảm ứng bởi GB Một lý do khác, có thể là GB ổn định toàn vẹn cấu trúc của màng tế bào chống lại nhiệt độ khắc nghiệt, làm giảm peroxy lipid màng và bảo vệ PSII electron vận chuyển (Chen et al., 2000; Hamilton & Heckathorn, 2001) Tác dụng tương tự về chức năng bảo vệ của GB đã được quan sát thấy ở cây ngô chuyển gen

CDH (Quan et al., 2004a)

Một khía cạnh khác có hại của stress nhiệt độ thấp là nó gây ra việc sản xuất hydrogen peroxide (H2O2), mà lần lượt kích hoạt sự tổng hợp của catalases (Prasad

et al., 1994) Việc ứng dụng GB ngoại sinh và nội sinh làm tăng cường hoạt động catalase và do đó tăng cường khả năng chịu stress nhiệt độ thấp Sự gia tăng hoạt

động catalase đã được quan sát thấy trong các cây cà chua chuyển gen codA hướng

mục tiêu tích lũy ở lục lạp, các cây cà chua chuyển gen đã được chứng minh tăng khả năng chịu lạnh và oxy hóa (Park et al., 2007a)

GB tích lũy trong lục lạp và kết quả tăng cường khả năng chịu nhiệt độ thấp

là một dấu hiệu cho thấy tăng GB cấp trong các lục lạp liên quan chặt chẽ với phức

hệ PSII hoạt động trong quá trình stress lạnh (Park et al., 2004) Tương tự như vậy,

trong lá cà chua chuyển gen codA nhắm mục tiêu lục lạp cho thấy hầu hết GB được

tích lũy trong lục lạp Kết quả tương tự cũng được tìm thấy ở cây lúa và

Arabidopsis chuyển gen codA (Sakamoto et al., 1998; Sakamoto et al., 2000)

Những phát hiện này cho thấy rằng sự tích lũy GB trong lục lạp có hiệu quả bảo vệ

bộ máy quang hợp khỏi các tác hại gây ra bởi stress nhiệt độ thấp

1.3.2.4 Cây trồng chuyển gen tổng hợp glycine betaine tăng cường khả năng

chống chịu nhiệt độ cao

Các nghiên cứu trước đó cho thấy quang hợp là mục tiêu chính trong nghiên cứu về ức chế bằng nhiệt độ cao và PSII là thành phần nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong hệ thống này (Berry & Björkman, 1980) Các kết quả cho thấy, khi nhiệt độ cao

hơn 45o

C, PSII bị ảnh hưởng rõ rệt nhất bởi nhiệt độ (Havaux, 1996) Nhiệt độ cao vừa phải thường ức chế sự cố định CO2 và không có khả năng phá hủy PSII (Haldimann & Feller, 2004) Nhiệt độ cao thường có ảnh hưởng đến quá trình quang hợp, trong khi tiếp xúc với nhiệt độ cao vừa phải làm suy yếu hoạt tính của ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) qua đó làm giảm khả năng quang hợp (Haldimann & Feller, 2005) Cơ chế của các quá trình này thường có liên quan tới sự loại bỏ hoạt tính của một số vị trí hoạt động của Rubisco dẫn đến tỷ lệ quang hợp giảm và việc loại bỏ hoạt tính tăng dần theo sự tăng của nhiệt độ (Salvucci

& Brandner, 2004) Hiện tượng này đã được chứng minh qua các nghiên cứu trên cây

bông, cây thuốc lá, Arabidopsis, và cây lúa mạch (Haldimann & Feller, 2005)

Một vài nghiên cứu in vitro cho thấy GB bảo vệ các enzyme và phức hợp

protein chống lại sự bất hoạt do tác dụng của hơi nóng (Gorhan, 1995) GB có hai chức năng là sửa chữa phức hợp PSII trong quá trình ức chế quang năng và bảo vệ phức hợp protein khỏi tác dụng của hơi nóng (Allakhverdiev et al., 2007) GB ổn định phức hợp PSII bằng cách kích thích sự sửa chữa của phức hợp khi cây tiếp xúc với nhân tố gây ức chế là hơi lạnh và độ mặn (Park et al., 2004) Một cơ chế tương

tự có thể xảy ra trong quá trình gây ức chế bằng nhiệt độ Cây Arabidopsis chuyển gen codA (làm tích lũy GB) cho thấy sự kích thích khả năng chống chịu với nhiệt độ

cao trong quá trình sinh trưởng của các cây con Có thể sự chống chịu với nhiệt độ

cao được cảm ứng trong cây Arabidopsis chuyển gen do sự bảo vệ enzyme hoạt hóa

Rubisco được hoạt hóa bởi GB Sự phát hiện này đươc củng cố bằng sự tăng hoạt

động quang hợp ở cây thuốc lá chuyển gen BADH (Yang et al., 2005) Cơ sở sinh lý

cho sự tăng khả năng chống chịu với nhiệt độ cao (25 – 45oC) của cây thuốc lá chuyển gen có liên quan tới sự tăng khả năng chống chịu của sự quang hợp với nhiệt độ cao Nhiệt độ cao vừa phải không ảnh hưởng đến hoạt động hoặc hiệu quả của PSII và tỷ lệ đồng hóa CO2 tăng do cảm ứng với GB có liên quan tới sự hoạt hóa của Rubisco nhờ các enzyme trung gian (Yang et al., 2005) Sự tích tụ GB làm tăng sự chống chịu của các enzyme hoạt hóa Rubisco với nhiệt độ cao, dẫn đến sự tăng khả năng chống chịu của việc đồng hóa CO2 trong cây chuyển gen so với cây không chuyển gen Trong nghiên cứu gần đây, sự tích tụ GB trong cây thuốc lá

chuyển gen BADH làm tăng sự chống chịu của PSII với nhiệt độ rất cao (lên tới

50oC) và cải thiện tính bền ở nhiệt độ cao của phức hợp vận chuyển oxy và của trung tâm phản ứng của PSII (Yang et al., 2007)

Bảng 1.2: Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp

glycine betaine, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi

Loài cây Gen Sự tích lũy GB (cơ quan)

Cơ quan đích

Khả năng chống chịu bất lợi

Tài liệu tham khảo

Arabidopsis

thaliana

codA (COD) 1.0 µmol g

-1 trọng lượng tươi(lá/hạt) Lục lạp

Nhiệt độ thấp, mặn

Waditee et al

2005

Hồng codA 0.1-0.3 µmol g

-1 trọng lượng tươi (lá)

Tế bào chất Hạn, mặn

Huang et al

2000

Bạch đàn codA 0.17-0.29 mmol g

-1trọng lượng tươi (lá)

Chưa xác định (N.A)

Mặn Yu et al 2009

-1 trọng lượng tươi (lá)

Lục lạp/tế bào chất

Nhiệt độ thấp, mặn

Sakamoto et

al 1998

-1trọng lượng khô (lá) Lục lạp Mặn

Mohanty et

al 2002

Cà chua codA 0.1-0.3 µmol g

-1 trọng lượng tươi (lá) Lục lạp

Nhiệt độ thấp

Park et al

2004

Cà chua codA

2.0 µmol g-1 trọng lượng tươi (cơ quan sinh sản)

Lục lạp/tế bào chất

Nhiệt độ thấp, mặn, oxy hóa

Park et al 2007a

Cà chua codA 0.9-1.43 µmol g

-1trọng lượng tươi (lá) Lục lạp

oxy hóa, mặn, hạn

0.8–1.7 mmol g-1trọng lượng tươi (hạt)

Tế bào chất Hạn, mặn

Kumar et al

2004

lá)

(CDH)

130.2–142.0 mmol g-1trọng lượng khô (lá) N.A Hạn Lv et al 2007

Thuốc lá COX 13 mmol g

-1 trọng lượng khô (lá)

Nuccio et al

1998

Thuốc lá BADH 0.44–4.92 mmol g

-1trọng lượng tươi (lá) Lục lạp Mặn

Yang et al

2008

Thuốc lá BADH 0.46–4.6 mmol g

-1trọng lượng tươi (lá) Lục lạp

Nhiệt độ cao

Yang et al

2008

-1 trọng lượng tươi (N.A.) Ty thể Hạn, mặn

Takabe et al

1998

-1trọng lượng tươi (lá) Lục lạp Mặn Su et al 2006

-1trọng lượng khô (lá) Lục lạp Mặn

Shirasawa et

al 2006

1.7–4.2mmol g-1trọng lượng tươi (lá, hạt)

Lục lạp Lạnh Quan et al

2004a

-1trọng lượng tươi (lá) Lục lạp Hạn

Quan et al 2004b

1.4 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ THÀNH

TỰU VỀ CÂY LÂM NGHIỆP CHUYỂN GEN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG BẤT LỢI

1.4.1 Điều kiện về cấu trúc gen chuyển vào tế bào thực vật

Các điều kiện cần thiết cho việc chuyển gen ở thực vật là yếu tố mang gen cần chuyển (vector), gen cần chuyển (gen mục tiêu), đoạn khởi động phiên mã (promoter) và đoạn kết thúc phiên mã (terminator) Vector sử dụng trong chuyển gen thực vật cần có những thành phần gồm: Một đoạn khởi đầu cho tái bản (tâm tái

bản); một gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng thao tác trong vi khuẩn E.coli và một gen

chỉ thị để chọn lọc ở tế bào thực vật được chuyển gen Plasmid T-DNA được sử

dụng để chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

được gắn thêm một đoạn khởi đầu, hai đoạn lặp lại (bờ trái và bở phải) của T-DNA

để trợ giúp cho đoạn T-DNA được gép nối vào bộ gen của tế bào chủ Trong trường hợp cần biến nạp gen vào DNA lục lạp người ta dùng đoạn khởi động tái bản của DNA lục lạp nhằm giúp cho gen biến nạp được tồn tại trong một thể tái bản độc lập trong lục lạp của tế bào nhận (Lê Trần Bình, 2008)

Đoạn khởi động phiên mã – Promoter dùng để chuyển gen vào thực vật có thể chia làm 3 loại: promoter thường trực (constructive promoter) – promoter biểu hiện hoàn toàn, như promoter CaMV 35S biểu hiện gen trong mọi bộ phận, mọi giai đoạn và mọi hoàn cảnh ở cây một lá mầm và hai lá mầm (Jefferson et al., 1987; Battraw và Hall, 1990) Đoạn khởi động này rất cần cho các nghiên cứu bước đầu

về chuyển gen vào thực vật như biểu hiện gen tạm thời, xây dựng quy trình chuyển gen Loại thứ 2 là promoter biểu hiện đặc hiệu mô, như ở củ, hạt, quả, rễ,… hoặc ở các giai đoạn phát triển như khi ra hoa, khi ngủ nghỉ Loại thứ 3 là promoter cảm ứng: điểm khác biệt của các promoter nhóm này là hoạt động của chúng không phụ thuộc vào các yếu tố nội sinh nhưng lại phụ thuộc vào các yếu tố bên ngoài hoặc các yếu tố kích thích nhân tạo Trong nhóm này, hoạt động của nhiều promoter được kích hoạt bởi các nhân tố sinh học như ánh sáng, sốc nhiệt, bị tổn thương, bị nấm, hạn hán, v.v Promoter thường có cấu trúc khá đồng bộ cho phép nhận được những mức độ thể hiện gen khác nhau thông qua hoán vị và tổ hợp các vùng khác nhau của một promoter Điều này được thể hiện rất rõ ở promoter CaMV 35S Hoạt lực của promoter có thể được tăng cường khi lắp gép hai hoặc nhiều trình tự promoter nối tiếp hoặc tổ hợp với nhau Trình tự kết thúc phiên mã của thực vật thường chứa một tín hiệu polyadenyl hóa, như AATAAA; AATTAA hoặc AACCAA Hai đoạn trình tự kết thúc thường dùng trong chuyển gen thực vật là đoạn kết của CaMV 35S và đoạn kết Nos Terminator Trình tự đuôi polyA có tác dụng bảo vệ phân tử mRNA bền vững chống lại sự phân hủy

1.4.2 Promoter cảm ứng rd29A

Promoter rd29 phân lập từ Arapidopsis thaliana là một trong các promoter

điều khiển biểu hiện gen bị cảm ứng dưới điều kiện khô hạn Khi phân tích trình tự

promoter rd29A thu được cho thấy promoter có chứa các trình tự box cần thiết cho