CHƯƠNG IV: ENZYM (Men - ferment) ppt

Ngược lại, nếu thiếu enzyme thì có thể dừng một phản ứng do enzyme xúc tác làm cho dừng các quá trình chuyển hoá khác nhau liên quan đến trạng thái bệnh.. Đặc điểm của E: •Không tham gia

ra một cách dễ dàng (trong điều kiện có thể không có nhiệt độ cao, áp suất cao, không có pH quá acid hoặc quá kiềm), nhịp nhàng Ngược lại, nếu thiếu enzyme thì có thể dừng một phản ứng do enzyme xúc tác

làm cho dừng các quá trình chuyển hoá khác nhau liên quan đến trạng thái bệnh Nếu kéo dài gây tử vong

Vai trò đặc biệt của enzyme trong cơ thể:

Enzyme có thể xúc tác chuyển hoá trong hoặc ngoài cơ thể

Vd: Trong dạ dày có pepsin phân giải thức ăn giàu protein tạo thành pepton (5÷8% acid amin).

Amilasa (có nhiều trong khoang miệng, nhiều nhất ở ruột non) có khả năng phân giải tinh bột thành đường glucoz

Theo quy trình chung:

Tinh bột → Dextron → Maltose (đường nha) → α.glucose

Amilasa là enzyme có thể lấy từ đường ruột (màng nhầy ruột non) hoặc từ ngũ cốc nẩy mầm, nuôi vi sinh vật

Nguồn thu enzyme khá rộng rãi: từ động vật, thực vật, vi sinh vật

4.1.2 Đặc điểm của E:

•Không tham gia vào thành phần cuối của phản ứng

•Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra

ở điều kiện không có enzyme

•Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc

độ của phản ứng

•Theo cấu trúc hóa học thì tất cả enzyme là protein

• Có hiệu suất xúc tác sinh học cao hơn gấp nhiều lần xúc tác hóa

học, tuy nhiên vận tốc có thể tăng khi có xúc tác hóa học

• Enzyme có tính đặc hiệu cao và có tính chọn lọc đối với cơ chất

•

Có tính chất lý hóa học của protein

Đa số có dạng hình cầu và không đi qua được màng bán thấm do kích thước lớn

Tan tốt trong nước và trong dung dịch muối loãng (buffer)

Cũng như protein enzyme không bền với nhiệt độ Bị gây biến tính bởi acid, base mạnh hay muối kim loại nặng

Thực hiện sứ mệnh điều phối tất cả các quá trình trao đổi chất của

cơ thể

Trong các phản ứng enzyme hầu như kết quả cho ra 100% sản

phẩm

4.2 Cấu tạo Enzyme:

Dựa vào thành phần cấu tạo của enzyme chia hai nhóm:

+ Nhóm enzyme đơn giản (một cấu tử): trong thành phần chỉ có acid amin liên kết (chỉ có protein)

+ Nhóm enzyme phức tạp (hai cấu tử): trong thành phần gồm có acid amin liên kết cộng phần nhóm ngoại (thường là các vitamin, các kim loại, một số nhóm chức khác (dẫn xuất của nucleotit, NAD, NADP, dẫn xuất quinov…))

Vai trò của nhóm ngoại rất quan trọng; vì nếu tách nhóm ngoại thì hoạt tính sinh học sẽ mất

Vd: Catalase: protein + sắt

Fenol oxydase: protein + đồngCytocrom: hệ chuyển electron: protein + sắtEnzyme Amino - transferasa: enzym chuyển nhóm amin Cấu tạo protein + dẫn xuất vitamin B6

Các enzyme Dehydrogenase (chuyển hydro) có cấu tạo:

protein + FAD; protein + FMN; protein + NADprotein + NADP; protein + UQ

Trung tâm hoạt động của enzyme: không phải toàn bộ phân tử enzyme tham gia liên kết với cơ chất mà chỉ có một phần nhỏ liên kết được với

cơ chất quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme, phần đó gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Một phân tử enzyme có thể có một hoặc nhiều hơn trung tâm hoạt động

Cấu tạo trung tâm hoạt động bao gồm:

+ Nhóm ngoại: các vitamin, kim loại, nhóm chức khác

+ Nhóm bên (gốc bên) của acid amin có khả năng phản ứng cao.Vd: các nhóm −OH, −NH2, −COOH, −SH, − histidin

Trung tâm hoạt động có thể được chia làm 2 bộ phận:

•Tâm xúc tác: tham gia kết hợp trực tiếp với cơ chất

•Miền tiếp xúc: gắn cơ chất lên vị trí tác dụng

Trung tâm hoạt động có kích thước không lớn so với toàn bộ enzyme

Nếu như trung tâm hoạt động bị phá vỡ vì tác động (lý - hoá) thì hoạt tính xúc tác của enzyme cũng mất đi

4.3 Tên gọi Enzyme:

a) Tên thông dụng: không theo quy tắc (Vd: pepsin, renin, trypsin…) có

ưu điểm là ngắn gọn, dễ nhớ ⇒ không nói được cơ chế cũng như phản ứng bị phân hủy

b) Tên hệ thống: quy định việc gọi tên enzym theo quy tắc chung gồm

cơ chất phản ứng

4.4 Phân loại enzyme

Enzyme được phân loại thành 6 nhóm chính:

Là nhóm xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử

Nếu chất chuyển hay chất nhận rõ ràng thì gọi tên theo chúng

Vd Dehydrogenase (NAD, FAD, FMN,…), oxygenase (kết hợp trực tiếp với oxy)

Nếu chất cho hydro không rõ ràng thì gọi là reductase

Các enzyme thường gặp trong nhóm này là: dehydrogenase,

oxydase, peroxidase, catalase,…

Cách gọi tên: theo chất nhận nhóm chuyển vận transferase

Nhóm transferase được chia ra làm 7 nhóm phụ

chuyển nhóm carbon đơn như methyl, carboxyl,…

chuyển nhóm aldehyde hoặc cetone, có 2 enzyme điển hình là transketolase (chuyển 2C) và transaldolase (chuyển 3C)

chuyển gốc acyl, acyltransferase

chuyển gốc glycosyl, glycosyl transferase

chuyển nhóm đạm, aminotransferase

chuyển nhóm phosphate, phosphotransferase

chuyển nhóm lưu huỳnh, sulphurtransferase

Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ với sự tham gia của nước

Phản ứng tổng quát XY + H 2 O  XOH + YH

Cách gọi tên: tên của cơ chất được tách ra hydrolase

Nhóm này được chia ra 11 nhóm phụ

Các enzyme thường gặp là esterase, phosphatase, nuclease, peptidase, lipase

Đây là nhóm E nhiều E nhất

Vd: Aspactate ammonia lyase

Các enzyme thường gặp: decarboxylase, aldolase, hydratase,…

* Cường lực xúc tác E:

E có khả năng xúc tác lớn rất nhiều so với các xúc tác vô cơ thông thường; xúc tác khác Chỉ cần 1 lượng nhỏ E (0,5 - 1%) so với

cơ chất thì nó chuyển hóa được lượng lớn hơn

Ví dụ: 1g pepsin có thể thủy phân được 50kg Pr-trứng trong 2giờ, t0

thường

E có khả năng xúc tác mạnh vì E có khả năng làm giảm NL hoạt hóa phản ứng (NL hoạt hóa là NL cần thiết để cung cấp cho quá trình xảy ra) = Qhh (NL hoạt hóa phản ứng)

Ví dụ: H2O2 → H2O + O2

Khi không xúc tác: Qhh = 18000cal/mol

Nếu xúc tác vô cơ là Platin Qhh = 11700cal/mol

Nếu dùng E catalase xúc tác Qhh = 5500cal/mol

Phản ứng: E + S ↔ ES → P + E (cơ chất) (Phức trung gian)

Điều kiện để E tương tác với cơ chất (S) để tạo thành phức trung gian (ES) Theo phương trình thì giữa E và S phải có cấu trúc không gian tương ứng phù hợp theo quy tắc chìa khóa và ổ khoá

Phức hợp enzyme – cơ chất [ES]

Theo thuyết cải tiến của Kosland thì sự tương ứng của E và S trong cấu hình KG không hoàn toàn cứng nhắc mà nó có thể biến đổi một chút cho thực sự phù hợp →

thuyết “tiếp xúc - cảm ứng”

Sơ đồ thuyết tiếp xúc cảm ứng theo Kosland

sự tương tác cảm ứng về cấu trúc không gian tạo nên phức hợp enzyme cơ chất

Một số E, đặc biệt là E tiêu hóa thì khi mới tiết ra ở trạng thái tiền E ko hoạt động.

Ví dụ: các tiền E:

pepsinogen → pepsin hoạt động + peptitkiềmhãm

E không hoạt động nhằm bảo vệ cho các cơ quan tiêu hoá không bị phân giải bởi các E của chính nó

* Tính đặc hiệu (Về cơ chất)

Mỗi E sẽ tác động lên 1 cơ chất nhất định hoặc 1 nhóm chất tương tự nhau về cấu tạo hoá học

Mỗi E ↔ mỗi cơ chất S

Mỗi E ↔ mỗi nhóm cơ chất S tương tự

protit Protease

Tinh bột AmilaseDựa vào khả năng (sự chọn lọc) tác động lên cơ chất, người ta chia cơ chất đặc hiệu ra các mức độ

Đặc hiệu quang học:

Mỗi E chỉ tác động lên 1 trong những dạng đồng phân quang học

Ví dụ: E chỉ tác động lên dạng L (hoặc dạng D)

E chỉ tác động lên dạng trans (hoặc dạng cis)

Đặc hiệu tương đối:

Giả sử có 1 cơ chất bao gồm 2 phần A, B E yêu cầu liên kết giữa A & B phải nhất định, cấu tạo thì tùy ý

Ví dụ: Esterase cắt liên kết ester

Peptidase cắt liên kết peptit

Đặc hiệu nhóm: 2 điều kiện

Liên kết giữa A & B phải nhất địnhCấu tạo A hoặc B phải nhất định

Ví dụ: Amino-peptidase (có trong ruột non)

Liên kết cắt là liên kết peptit -CO-NH

Cạnh liên kết peptit phải có gốc -NH2 tự do

Carboxyl-peptidase (có trong ruột non)Liên kết cắt là liên kết -CO-NH

Cạnh liên kết -CO-NH phải có nhóm - COOH tự do

- Đặc hiệu tuyệt đối: 2 điều kiện

Liên kết giữa A & B phải nhất địnhCấu tạo A & B phải nhất định (hay nói cách khác là 1 chất duy nhất)

Ví dụ: Urease là E chỉ phân cắt Urea mà không phân cắt 1 dẫn xuất nào của Urea

Kết luận: do có tính chất đặc hiệu cao nên chúng ta có E có thể biết được cơ chất tác dụng và ngược lại → biết được sản phẩm tạo thành

*Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thường vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, tăng 10 o C thì vận tốc tăng 1,4 – 2 lần Quá 70 o C, đa số enzyme mất hoạt tính

Nhiệt độ mà enzyme đạt vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích (khác nhau tùy enzyme)

Nhiệt độ tối thích của enzyme tv (50-60 o C) > enzyme đv (40-50 o C)

Một số enzyme có khả năng chịu nhiệt cao: papain

Nhiệt độ thấp ức chế hoạt tính E nhưng E có khả năng phục hồi hoạt tính trở lại khi đưa về nhiệt độ thích hợp (ứng dụng để bảo quản E)

Tương tác với các yếu tố khác: bản chất enzyme, pH môi trường, nồng độ cơ chất,…

t t ín

* Chất kiềm hãm

Là những chất khi cho vào môi trường làm cho hoạt động của E giảm

đi, hoặc hoạt tính = 0

Thông thường các chất kiềm hãm có thể là muối của KL nặng (Cu, Pb, Hg) hoặc TCA (acid tricloacetic); tanin; acid mạnh; kiềm mạnh; formol

Dựa vào mức độ kiềm hãm, có thể chia chất kiềm hãm ra các loại như sau:

-Kiềm hãm thuận nghịch: khi ta tách bỏ chất kiềm hãm thì E trở lại hoạt động

- Kiềm hãm bất thuận nghịch: khi ta tách bỏ chất kiềm hãm thì E không trở lại hoạt động

Khi trong trường hợp S và I tương tự nhau thì E sẽ tác động với cả S và I.

Theo pt (1) thì ES là phức không bền và sẽ phân giải ngay tạo sản phẩm P và giải phóng E.

Theo pt (2) thì E + I thành phức EI là phức bền Vì vậy 1 lượng E bị giam giữ lại, làm giảm nồng độ E chung → giảm hoạt tính và nồng độ E.

- Kiềm hãm không cạnh tranh: E có khả năng tác dụng đồng thời với cơ chất và với chất kìm hãm vì E này có nhiều trung tâm hoạt động.

Trong một số trường hợp, còn gặp 1 số E là E dị thể hoặc E dị không gian (Allosteric)

E dị không gian có nhiều tâm hoạt động, các trung tâm đó có thể đồng thời liên kết với cơ chất, có thể liên kết với chất kìm hãm hay với 1 chất trao đổi trung gian nào đó thành phức hệ làm cho cấu hình phân tử không gian của E bị biến dạng làm thay đổi hoạt tính của E.

Các E dị thể thường tồn tại song song với các E bình thường trong tế bào và có chức năng điều hoà các hoạt tính E trong cơ thể.

Sơ đồ biểu diễn cơ chế hoạt động của chất kìm hãm

Phức hợp [EI] không hoạt động

Phức hợp [ES] hoạt động

* Các chất hoạt hoá:

Là những chất làm cho E từ hoạt động yếu thành hoạt động mạnh hoặc

từ hoạt tính = 0 thành có hoạt tính

Các chất hoạt hóa rất đa dạng, nhiều chất khác nhau, thông thừơng

chứa chất hoạt hóa là KL, vitamin, 1 số nhóm chức khác, 1 số E hoạt hoá cho tiền E

Ví dụ:

E-Renin là E có khả năng đông tụ sữa (làm phomat) phân giải casein

có trong sữa; E-Renin hoạt động mạnh khi có ion Ca+2

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất

Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

+ Phương trình Michaelis – Menten (tham khảo)

Km đặc trưng cho ái lực của [E] với [S] Km có trị số càng nhỏ thì ái lực

của [E] với [S] càng lớn, nghĩa là vận tốc của [E] càng lớn

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

+ Khi S<<<Km: vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất, phản ứng bậc 1

+ Khi S>>>Km, phản ứng đạt giá trị cực đại, không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất tăng thêm

+ Khi S = Km: vận tốc phản ứng bằng ½ giá trị cực đại

Đồ thị tổng quát biểu diễn tốc độ phản ứng của enzyme vào nồng độ cơ chất

Phương trình xác định giá trị Km và Vmax

Phương trình này có dạng y = ax + b

Sự phân bố enzyme trong tế bào

Enzyme có mặt khắp mọi mô, mọi tế bào

Có tính chuyên biệt cho từng loại mô

Nhân tế bào chứa các enzyme liên quan đến biến dưỡng nucleic acid

Ty thể chứa hệ enzyme liên quan đến quá trình hô hấp

Ribosome chứa hệ enzyme tổng hợp protein

Lục lạp chứa enzyme liên quan đến quang hợp, biến dưỡng chất béo

4.6 Ứng dụng của E:

4.6.1 Đặc tính ưu việt của E:

-E có thể được thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau

-Điều kiện xúc tác của E: “nhẹ nhàng, ôn hoà”

-Tính đặc hiệu cơ chất cao

-Vận tốc phản ứng của E có thể điều chỉnh bởi những yếu tố khác

nhau: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, nồng độ E, lượng O2 đưa vào

hoặc không, thời gian tác động, các chất kìm hãm, các chất hoạt hoá

- E có cường lực xúc tác lớn: chỉ cần 1 lượng nhỏ E có thể chuyển hoá

1 lượng cơ chất lớn

Trong công nghệ thực phẩm:

+ Sản xuất đồ hộp: làm mềm thịt, cá, các E protease sẽ cắt đứt bớt 1 số liên kết peptit làm mạch polypeptit ngắn hơn, giúp cho thịt mềm, sản xuất thức ăn cho trẻ em, người bệnh (sử dụng Bromelin, papain)

+ Sản xuất phomat: các protease như renin, pepsin làm đông tụ sữa dùng trong sản xuất phomat.

+ Sản xuất các loại bánh nở xốp: Cho 1 lượng nhỏ amylase làm cho chuyển hóa 1 phần tinh bột thành đường, ủ nấm men → chuyển đường thành rượu + CO2; khi

Trong công nghệ thuộc da:

da động vật ngâm trong nước + E protease giúp rút ngắn thời gian, làm

bề mặt da mịn hơn, mỏng hơn, giảm đáng kể ô nhiễm môi trường

Trong công nghiệp tơ tằm:

những bó sợi tơ tằm được tách rời bằng nhiệt độ, kiềm, → cải tiến

bằng nhiệt độ ấm và E protease giúp giảm thời gian do các sợi tơ nối nhau bằng các protit và xerexin

Bản chất sợi tơ cũng là protit nên cần phải nghiên cứu [E ] thích hợp

Trong công nghệ mỹ phẩm:

gồm 1 phần nhỏ E protease trong kem xoa, dầu gội giúp tẩy tế bào già trên da, tóc

Cho E protease vào bột giặt để tẩy các vết bẩn có bản chất là protit.

Trong sản xuất dược liệu:

Dùng E xellulaza phân giải màng tế bào thực vật: để tăng hiệu suất

trích ly các chất trong tế bào thực vật ra

Trong Y học:

Dùng E cố định urease để điều trị bệnh thận

Chiết E và chuyển E thành dạng dung dịch E

Sử dụng dung môi thích hợp (nước, dung dịch đệm có pH phù hợp với E hoặc dung dịch muối loãng, )

sử dụng trong công nghiệp, công nghệ thực phẩm, .

kết tủa E từ dung dịch E

+ Dùng dung môi hữu cơ (dung môi làm giảm hằng số điện môi) làm giảm độ hoà tan

và gây kết tủa E, thường dùng aceton hoặc etanol.

+ Dùng muối trung tính (ở nồng độ muối cao thì muối tranh giành vỏ nước bên ngoài; khi mất vỏ nước thì nó dễ ngưng tụ lại với nhau) Thường dùng NaCl và (NH4)2SO4 Nồng độ bão hoà của NaCl ≈ 22-23% Nồng độ bão hoà của (NH4)2SO4 ≈ 70-72%.

+ Dùng điểm đẳng điện P I để kết tủa E Điểm đẳng điện tại pH = PI thì tổng điện tích (+) + (-) = 0; phân tử E trung hoà điện và kết tủa Mỗi E có 1 PI riêng.

v

E dd môi dung = ÷

Sau khi kết tủa E, ta ly tâm hay lọc bỏ dung dịch để lấy kết tuả E

Sấy kết tủa E để được dạng bột E khô

(sấy ≤ 500C) Có thể sấy bằng quạt gió , chân không Sau khi sấy được chế phẩm E thô dạng khô → bảo quản được lâu

Sơ đồ thu Enzyme:

Quy trình thu nhận Pepsin:

Tinh chế và tinh sạch E để được E tinh khiết cao để

phục vụ trong Y Dược, nghiên cứu khoa học

+ Phương pháp Dialise (thẩm tích): đây là phương

lượng phân tử khác nhau

+ Phương pháp trao đổi ion: sử dụng nhựa trao đổi ion

Do khả năng trao đổi ion khác nhau của các cấu tử

mà chúng ta có thể tách các tạp chất ra khỏi E.

+ Phương pháp hấp phụ: sử dụng những chất hấp phụ thích hợp hấp phụ tạp chất và cho E chảy qua

+ Phương pháp điện di: di chuyển trong điện trường, dựa trên cơ

sở các cấu tử khác nhau thì có khả năng dịch chuyển với những tốc độ khác nhau theo hướng khác nhau trong điện trường.Sau 1 thời gian t các cấu tử sẽ tách rời khỏi nhau

+ Phương pháp sắc ký: sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, dựa vào

sự phân bố khác nhau của các cấu tử vào 2 pha

Pha tĩnh: nước + chất mangPha động: dung môi dịch chuyển

Do sự phân bố khác nhau của các cấu tử ở 2 pha, các cấu tử sẽ tách khỏi nhau