ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔITRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM DOÃN LÂN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÒ NUÔI TẠI TỈNH HÀ GIANG VÀ BÒ HOANG DÃ Ở VIỆT NAM BẰNG CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀ
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHẠM DOÃN LÂN
NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÒ NUÔI TẠI TỈNH HÀ GIANG VÀ BÒ HOANG DÃ Ở VIỆT NAM BẰNG
CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHÂN TỬ
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 GS.TS LÊ ĐÌNH LƯƠNG
2 TS Jean-Charles MAILLARD
HÀ NỘI - 2010
Trang 2MỤC LỤC
CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN 4
1.1.1 Khái niệm 4
1.1.2 Tầm quan trọng của đa dạng di truyền 4
1.1.3 Bảo tồn sự đa dạng di truyền 5
1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5
1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 10
1.3.1 Giới thiệu 10
1.3.2 Sự phân bố của microsatellite trong cơ thể sinh vật 11
1.3.3 Phân loại microsatellite và các dạng trình tự của microsatellite 12
1.3.4 Vai trò của microsatellite 13
1.3.5 Phương pháp xác định microsatellite 14
1.4 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA) 16 1.5 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ NUÔI 18
1.5.1 Sự phân loại bò nuôi 18
1.5.2 Nguồn gốc thuần hoá bò nuôi 21
1.5.3 Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay 22
1.6 ĐẶC ĐIỂM QUẦN THỂ BÕ NUÔI Ở TỈNH HÀ GIANG 23
1.6.1 Điều kiện địa lý, xã hội của tỉnh Hà Giang 23
1.6.2 Đặc điểm quần thể bò nuôi ở tỉnh Hà Giang 24
1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÕ NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25
1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền của bò nuôi trên thế giới 25
1.7.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền của vật nuôi nói chung và của bò nói riêng ở Việt Nam 28
1.8 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÕ RỪNG (BOS JAVANICUS) 29
1.8.2 Đặc điểm và sự phân bố của bò tót (Bos gaurus) 30
1.8.3 Hiện trạng và sự phân bố bò tót ở Việt Nam 32
1.8.4 Đặc điểm và sự phân bố của bò rừng (Bos javanucus) 35
1.8.5 Hiện trạng và sự phân bố bò rừng ở Việt Nam 36
1.9 NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Ở BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 39
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 41
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đối với quần thể bò nuôi tại Hà Giang 41
2.2.1.1 Thu thập mẫu 41
2.2.1.2 Tách chiết ADN 41 2.2.1.3 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân 42
Trang 32.2.1.4 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể 45
2.2.1.5 Phương pháp phân tích thống kê 46
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đối với quần thể bò hoang dã 50
2.2.2.1 Thu thập mẫu 50
2.2.2.2 Tách chiết ADN từ mẫu phân 51
2.2.2.3 Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN 52
2.2.2.4 Xác định loài và giới tính 53
2.2.2.5 Phân tích đa dạng di truyền 54
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56
3 1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ NUÔI TẠI HÀ GIANG 56
3.1.1 Tính đa dạng về kiểu hình 56
3.1.1.1 Đa dạng về màu sắc lông 56
3.1.1.2 Đa dạng về hình dáng sừng 56
3.1.2 Tính đa dạng về di truyền 57
3.1.2.1 Kết quả phân tích kích thước alen của các locút microsatellites 57
3.1.2.2 Tính đa hình của các locút microsatellites 61
3.1.2.3 Tính đa dạng di truyền và cân bằng Hardy-Weinberg 61
3.1.2.4 Tính đa dạng và sự sai khác di truyền giữa các quần thể bò phân bố ở các huyện 66 3.1.2.5 Mối tương quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý 70 3.1.2.6 Đặc điểm cấu trúc di truyền quần thể bò nuôi ở Hà Giang 71
3.1.2.7 Tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể 75
3.1.2.8 Mối quan hệ di truyền của bò ở Hà Giang với một số quần thể bò khác 77 3.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 81
3.2.1 Kết quả tách chiết ADN 81
3.2.2 Ảnh hưởng của mốt sô yếu tố bảo quản mẫu đến kết quả tách ADN 85
3.2.2.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu phân 85
3.2.2.2 Ảnh hưởng của dung dịch bảo quản đến kết quả tách chiết ADN 86
3.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản mẫu phân 87
3.2.3 Kết quả xác định loài 87
3.2.4 Kết quả xác định giới tính 92
3.2.5 Đa dạng di truyền của quần thể bò tót 93
3.2.6 Đa dạng di truyền của quần thể bò rừng 100
KẾT LUẬN 1045
ĐỀ NGHỊ 106
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 107
TÀI LIỆU THAM KHẢO 108
Trang 4MỞ ĐẦU
Đánh giá tính đa dạng và những đặc điểm di truyền của quần thể, giống vật nuôi và động vật hoang dã ở mức độ phân tử được coi là công việc mở đầu và rất cần thiết đối với một chương trình bảo tồn [88] Chính vì vậy, từ những năm 1990
tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã xây dựng một chương trình tổng thể sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền trong bản thân một quần thể và giữa các quần thể vật nuôi nhằm định hướng cho việc quản lý, bảo tồn
và sử dụng nguồn gen động vật nuôi trên toàn cầu
Trong những năm gần đây, các phương pháp sinh học phân tử đã đóng một vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và đa dạng di truyền Nhiều kỹ thuật di truyền phân tử được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: RFLP, RAPD, minisatellites, microsatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể Trong đó, kỹ thuật microsatellite và phân tích trình tự hệ gen ty thể đã nhanh chóng trở thành những kỹ thuật hữu hiệu và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu di truyền quần thể ở nhiều loài vật nuôi và hoang dã khác nhau
Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng tài nguyên thiên nhiên sinh vật cao Tuy nhiên, tính đa dạng của hệ động vật ở Việt Nam, đặc biệt là một số quần thể vật nuôi bản địa ở các khu vực miền núi và quần thể động vật hoang dã có giá trị sinh học và di sản đang bị đe doạ do nền kinh tế thị trường phát triển và khai thác, sử dụng quá mức của con người
Bò nuôi ở Hà Giang là một trong những giống vật nuôi bản địa được thuần hoá, chọn lọc, nuôi dưỡng từ lâu đời của người H’mông vì vậy chúng đáp ứng tốt với điều kiện khí hậu khô rét của vùng cao và rất có giá trị về văn hoá đồng thời mang tính đặc hữu của tỉnh Hà Giang Tuy nhiên, do hệ thống chăn nuôi thâm canh, nhập giống ngoại có năng suất cao được đầu tư lớn đã dẫn đến nguy cơ mất đi giống
bò này
Bên cạnh đó, hai loài bò hoang dã là bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus), ngoài những giá trị sinh học nội tại còn là giá trị di sản đối với quốc gia
Trang 5và là những nguồn gen quý cần được bảo tồn Nhưng do nạn săn bắt trái phép, phá huỷ môi trường sống và dịch bệnh đã dẫn đến tình trạng suy giảm nhanh các loài bò hoang dã này Số lượng bò tót trên cả nước đã giảm xuống mức rất thấp, còn khoảng 300 cá thể Trong khi đó, số lượng bò rừng chỉ còn khoảng dưới 100 cá thể Hiện nay, hai loài bò hoang này đang đứng bên bờ tuyệt chủng và rất có thể chúng
sẽ chịu chung số phận với loài bò xám (Bos sauveli), ngày nay đã bị coi là tuyệt
chủng ở Việt Nam
Hiện tại, bò H’mông nuôi tại Hà Giang và hai loài bò tót và bò rừng hoang dã
là những đối tượng được bảo tồn đặc biệt của các chương trình và dự án bảo tồn cấp Quốc gia Vì vậy, những thông tin về hiện trạng di truyền của các quần thể bò này là rất cần thiết và quan trọng để hoạch định các chiến lược bảo tồn bền vững Xuất
phát từ ý nghĩa thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính
đa dạng di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà Giang và bò hoang dã ở Việt Nam bằng các kỹ thuật di truyền phân tử”
Mục đích của đề tài
Xác định tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà Giang ở mức độ phân tử làm cơ sở cho việc hoạch định kế hoạch chọn lọc, lai tạo, phát triển và bảo tồn lâu dài
Sử dụng các công cụ phân tử để xác định tính đa dạng di truyền của quần thể bò tót và bò rừng hoang dã đang tồn tại ở một số khu vực của Việt Nam từ các mẫu phân sinh học nhằm phục vụ cho việc xây dựng những hoạt động bảo tồn phù hợp
Nội dung nghiên cứu của đề tài
Sử dụng kỹ thuật microsatellite phân tích tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang
Phân tích tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ở bò nuôi tại Hà Giang sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop
Trang 6Chuẩn hoá phương pháp và tách chiết ADN từ các mẫu phân sinh học của các mẫu bò hoang dã
Xác định loài và giới tính từ các mẫu phân
Xác định tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ở quần thể bò tót và bò rừng sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop
Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá tính đa dạng và cấu trúc di truyền ở bò nuôi và bò hoang dã phục vụ cho mục đích bảo tồn được thực hiện ở Việt Nam Lần đầu tiên ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tiến hành nghiên cứu di truyền trên quần thể bò tót và bò rừng từ các mẫu sinh học được thu thập một cách gián tiếp không gây ảnh hưởng tới con vật như các mẫu phân, lông
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những thông tin cần thiết về những đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử, góp phần làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng các kế hoạch bảo tồn quần thể bò nuôi tại Hà Giang và hai loài bò hoang dã là
bò tót và bò rừng ở Việt Nam
Trang 7TÓM TẮT
Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử đánh giá tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền bò nuôi ở Hà Giang
và hai quần thể bò hoang dã (tót và bò rừng) hiện có ở Việt Nam
Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền ở bò nuôi tại Hà Giang cho thấy tính đa dạng di truyền cao ở cả hệ gen nhân và hệ gen ty thể Đã xác định được 205 alen của
23 locút microsatellite, trung bình số alen trên một locút là 8,9, tần số dị hợp tử quan sát và lý thuyết tương ứng là 0,67 và 0,73 Giá trị thông tin đa hình (PIC) của từng locút microsatellite nằm trong khoảng từ 0,50 đến 0,84 Sự sai khác di truyền giữa bò
nuôi ở các huyện là rất nhỏ với giá trị FST = 0,013
Quần thể bò nuôi ở Hà Giang không ở trạng thái cân bằng di truyền Hardy-Weinberg và cấu trúc di truyền tồn tại 2 nhóm bò (quần thể phụ) khác nhau về di truyền phân bố chính ở vùng núi đá (Đồng Văn, Mèo Vạc) và vùng núi đất (Hoàng Su Phì, Sín Mần) Ngoài ra, qua kết quả phân tích sự đa dạng di truyền hệ gen ty thể đã cho thấy
quần thể bò nuôi ở Hà Giang có nguồn gốc từ sự lai tạp giữa hai loài phụ Bos indicus
và Bos taurus.
Lần đầu tiên tại Việt Nam đã thành công trong việc tách chiết ADN của bò hoang
dã từ các mẫu phân, sử dụng cặp mồi xác định giới tính và cặp mồi nhân vùng D-loop
ty thể của bò nuôi để xác định giới tính, xác định loài và xác định tính đa dạng di truyền ở bò tót và bò rừng
Đã xác định được 5 kiểu haplotype hệ gen ty thể trong quần thể bò tót ở khu vực Đông Dương bao gồm Việt Nam (2), Campuchia (2) và Lào (1) Trong đó ở quần thể
bò tót của Việt Nam đã xác định được 2 kiểu haplotype có khoảng cách di truyền rất xa nhau Qua đó cho thấy trong quần thể bò tót của Việt Nam tồn tại ít nhất 2 nhóm rất khác nhau về di truyền
Trang 8Đã xác định được 2 kiểu haplotype ở quần thể bò rừng Việt Nam và 1 kiểu haplotype ở quần thể bò rừng Campuchia Không có sự sai khác di truyền đáng kể giữa các kiểu haplotype của bò rừng Việt Nam và bò rừng ở Campuchia
Từ kết quả có rất ít kiểu haplotype hệ gen ty thể được xác định đã cho thấy quần thể
bò tót và bò rừng ở Việt Nam có tính đa dạng di truyền rất thấp
12 Khả năng ứng dụng trong thực tiễn:
Các kết quả nghiên cứu của luận án sẽ góp phần làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng các kế hoạch chọn lọc, phát triển đồng thời bảo tồn tính đa dạng di truyền ở bò nuôi tại tỉnh Hà Giang Trong đó cần đặc biệt chú ý bảo tồn hai nhóm bò khác nhau về
di truyền phân bố ở vùng núi đá (Đồng Văn, Mèo Vạc) và vùng núi đất (Hoàng Su Phì, Sín Mần) Góp phần xây dựng kế hoạch và chiến lược bảo tồn các quần thể bò tót, bò rừng ở Việt Nam và các nước trong khu vực
13 Những hướng nghiên cứu tiếp theo:
Cần tiến hành nghiên cứu so sánh sự sai khác di truyền của bò nuôi ở Hà Giang với các nhóm bò vàng khác hiện có ở Việt Nam
Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của toàn bộ quần thể bò tót
và bò rừng được ghi nhận tồn tại ở tất cả các khu vực của Việt Nam
14 Các công trình đã công bố có liên quan đến luận án:
1 Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Trần Xuân Hoàn, Vũ Chí Cương, Lê
Đình Lương và J.C Maillard (2008), “Phân tích đa dạng trình tự nucleotide ADN ty thể và
mối quan hệ di truyền của bò H’mông với một số quần thể bò khác”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi Số 13, trang 51-57.
2 Taiana Rivière-Dobigny, Lan Pham Doan, Nam Le Quang, Jean-Charles
Maillard and Johan Michaux (2008), “Species Identification, Molecular Sexing and
Genotyping Using Non-invasive Approaches in Two Wild Bovids Species: Bos gaurus and Bos javanicus” Journal of Zoo Biology 28 (2), pp 127-136
Trang 93 Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Vũ Chí Cương, Jean-Charles Maillard
(2008), “Sử dụng kỹ thuật microsatellite để đánh giá tính đa dạng di truyền và cấu trúc di
truyền của quần thể bò nuôi ở tỉnh Hà Giang” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Số 4 (24), trang 310-317.
Ngày 4 tháng 12 năm
2009
Nghiên cứu sinh
Phạm Doãn Lân