di truyền phân tử 04

Toàn bộ những nhân tố vật chất trong tự nhiên phân tử, nguyên tử, nhiệt độ, ánh sáng… gọi chung là hệ gen bào t với sự biến đổi thờng xuyên đã là cơ sở phát sinh sự sống và cơ thểsống..

Chơng 5 di truyền học phát triển cá thể

và di truyền học tiến hóa

5.1 di truyền học phát triển cá thể

5.1.1 Các đối tợng mô hình nghiên cứu di truyền học phát triển cá thể

Dựa vào những khám phá sau Watson và Crick (1953) về cấu trúc và chứcnăng của acid nucleic, ngày nay đã phát triển những kỹ thuật ứng dụng nh các

kỹ thuật gen (geneomic) và các kỹ thuật protein (proteomic) vào chon giống vànghiên cứu ở ngời

Bộ gen là tập hợp tất cả các yếu tố di truyền trong tế bào; nhìn chung nógồm các thành phần hệ gen nhân (genom), hệ gen ty thể (mitochondrom), hệgen lục lạp (plastom = plastidom) và hệ gen phân tán (plasmidom) Hệ gen củacác bào quan (ty thể, lục lạp, …) gọi chung là hệ gen bào t) gọi chung là hệ gen bào tơng (plasmon) Sinhvật khác nhau thì bộ gen cũng khác nhau ở thành phần và cấu trúc gen

Bộ gen ở Procaryota gồm hai thành phần là hệ gen vùng nhân (genome –98-99% bộ gen) và hệ gen phân tán (plasmidom – 1-2% bộ gen) Hệ gen vùngnhân là phân tử AND gấp khúc cuộn xoắn; tính siêu xoắn chịu sự kiểm soát củamen topoisomerase AND của của E coli có kích thớc 300 m (dạng mở xoắn)μm (dạng mở xoắn)

và chỉ còn 1,5 m (dạng siêu xoắn) Procaryota chứa AND trần (không bọcμm (dạng mở xoắn)histon), chuỗi kép (15%) và đơn (85%), dạng vòng Một số loài bộ gen chỉ có mộtthành phần là hệ gen vùng nhân, ví dụ E coli chỉ có một phân tử AND dậng vòngchứa 3000-4000 gen

5.1.2 Tổ chức bộ gen ở Eucaryota

Bộ gen ở sinh vật Eucaryota gồm 3 thành phần

là hệ gen nhân, hệ gen ty thể và hệ gen lục lạp

AND nhân có dạng mạch kép, chủ yếu là β-AND

AND ty thể và lục lạp có dạng kép vòng AND nhân

đợc bọc protein (histon dạng 8 phân tử – octamer)

tậo thành thể nhân (nucleosom) Histon đợc phân

biệt gồm 5 loậi với tỷ lệ tơng đơng nhau là H1,

H2A, H2B, H3 và H4 Trong đó 2 phân tử H3 và H4

liên kết ở vùng trung tâm, 2 phân tử H2A và 2 phân

tử H2b liên kết ở vùng ngoài của AND

Các nucleosom kết nối với nhau bởi một đoạn

AND (15-100 bp) tạo thành sợi cơ bản có cấu trúc

xoắn (đờng kính 100Å), sợi cơ bản xoắn thành sợi nhiễm sắc (solenoit, đ ờng kính250Å), sợi nhiễm sắc xoắn thành ống nhiễm sắc (đờng kính 2000Å) và ống nầyxoắn một lần nữa thành sợi nhiễm sắc (chromatid, đờng kính 6000Å)

Sợi cơ bản Sợi solenoit

đờng kính 2000Å ống nhiễm săc

đờng kính 6000Å Sợi chromatid

 Hệ gen lục lạp (plastidom)

ADN và ribosome trong lục lạp đợc phát hiện năm 1963 [Chu Hoàng Mậu,2005] Lợng ADN lục lạp (ct.ADN) chiếm 15% tổng lợng tế bào thực vật, lợngribosme chiếm 60% lợng ribosome tế bào ct.ADN có cấu trúc mạch vòng (gần85% là mạch đơn), có MW khoảng 83-128.106

ADN Kích thớc (bp) Chu vi vòng (μm)Plasmid

Trực khuẩn E coli (chromosome)

Trùng roi (Euglena) (ct.ADN)

Thuốc lá (Tabaco) (ct.ADN)

Ngô (Zea mais) (ct.ADN)

đậu xanh (mungbean) (ct.ADN)

- Hệ gen ty thể (mitochondrom)

Phơng pháp tách chiết ADN ty thể (Salech và cộng sự, 1989) gồm các bớc:

- Ly tâm chậm để loại bỏ nhân, lục lạp và các thành phần khác của tế bào

Sản phẩm do mt.ADN mã hóa là một số lợng nhỏ protein rất quan trọng chohoạt động tại chỗ, nh 3 tiểu phần của cytochromoxydase, 2 tiểu phần của phứccytochrome bc và một số thành phần khác [ADNre, 1991] Ngoài ra mt.ADN còn

đóng vai trò quan trọng trong hiện tợng bất dục đực của tế bào chất (CMS) đợckhai thác sản xuất các dòng lai nh lúa, ngô…) gọi chung là hệ gen bào t [Spruill và cộng sự, 1981] CMS cókhả năng tổng hợp chuỗi polypeptid MW =130.000, nhng mất khả năng tổng hợpchuỗi polypeptid MW = 21.000 ở nguyên sinh chất tế bào cây bình th ờng

Trong tế bào cây CMS có mang 2 phân tử ADN mạch thẳng (giống plasmid)

ở ty thể với kích thớc 6,2 kb và 5,2 kb Trong ADN nhân mã UGA là mã kết thucnhng trong mt.ADN lại là mã cho tryptophan Ngợc lại mã CGG ở ADN nhân mãcho tryptophan nhng ở mt.ADN lại mã cho arginine Ngoài ra trong ty thể thực vậtcòn phát hiện dạng mới của m-ARN (gọi là ARN-editing) thích nghi tốt hơn với

điều kiện ngoại cảnh

 Hệ gen nhân (genome)

Hệ gen này có khối lợng và số lợng lớn nhất trong bộ gen tế bào ADN nhân

đợc sắp xếp thu gọn trong nhiễm sắc thể có liên kết hoặc không liên kết vớihiston Khối lợng ADN nhân khác nhau tùy loài (nhỏ nhất là 0,07 picogram ởArabidosis thaliana, = 33,5 pg ở Allium cepa)

Hệ gen nhân ở Eucaryota có 3 thành phần là các đoạn ADN không lặp lại

(chiếm 45% genom), các đoạn ADN lặp lại ít (25%) và các đoạn ADN lặp lạinhiều (30%); trong khi hệ gen nhân ở Procaryota chỉ có một thành phần là các

đoạn ADN không lặp lại kác nhau [Chu Hoàng Mởu, 2005]

5.1.3 Các nhân tố tác động đến sự phát triển

Sự phát triển đợc hiểu trong nghĩa khái quát bao hàm sự tồn tại có tích lũy (sinh trởng) và sự nhân bản trong sinh sản (di truyền) diễn ra ở tế bào hay cơ thểsinh vật

Trớc hết chúng ta sơ bộ khảo sát chu trình của một tế bào:

Các sự kiện chính diễn ra trong chu kỳ tế bàoM: phân kỳ

G1: gian kỳ1 (tổng hợp các chất)S: tổng hợp và tích lũy

G2; dừng tích lũy, tái bản ADN

Cơ sở của sự sống là vật chất, nghĩa là nó tập trung những chất hữu cơ trongmột giới hạn không gian nhất định Những hoạt động hóa học của các phân tửnày là nền tảng biểu hiện của hoạt động sống Do có xuất xứ vật chất nên cơ thểsống cũng sử hữu thuộc tính vĩnh cửu của vật chất đó là th ờng xuyên vận động

và thờng xuyên biến đổi phơng thức vận động

Toàn bộ những nhân tố vật chất trong tự nhiên (phân tử, nguyên tử, nhiệt độ,

ánh sáng…) gọi chung là hệ gen bào t) với sự biến đổi thờng xuyên đã là cơ sở phát sinh sự sống và cơ thểsống Cũng chính sự biến đổi thờng xuyên của các nhân tố môi trờng là nguyênnhân quyết định hình thành những phơng thức hoạt động sống mới, nói cáchkhác nó quyết định sự phát triển của sự sống

Lần theo quá trình phát triển sự sống, nhóm thể sống sơ khai (th ờng gọi làgiọt sống - coacerva ch

“giọt sống - coacerva” ch ” ch a phải là cơ thể sống chính thức vì trong nó cha có yếu

tố acid nucleic Những giới sinh vật khác trong tế bào của chúng đã có yếu tốnày và vì thế chúng đã có một cơ thể chính thức đáp ứng đủ thuộc tính của sựsống là tồn tại và phát triển

Khi đã quan niệm nh vậy thì các nhân tố ảnh hởng tới sự phát triển là nhữngnhân tố tác động vào hoạt động của protein (gốc của sự tồn tại) và vào hoạt

động của acid nucleic (gốc của sự phát triển) Ngoài ra cần phân biệt hai nộidung của sự phát triển là phát triển số lợng và phát triển chất lợng

 Các nhân tố tác động phát triển số lợng

Thực chất của phát triển số lợng là sản xuất đợc nhiều cá thể hay nói cách khác

là sản xuất đợc nhiều protein Muốn vậy ngoài nhân tố nguyên liệu để sản xuấtprotein còn nhân tố quy trình sản xuất protein và môi trờng sản xuất protein

Phân tử protein đợc đặc trng bởi số lợng, số loại và trình tự các acid amin.Bởi vậy nguyên liệu cũng phải đáp ứng đủ l ợng và tỷ lệ các loại acid amin đối vớitừng protein Đặc biệt trong chăn nuôi nhân tố này là rất quan trọng vì cơ thể

động vật không tự tổng hợp đợc những acid amin thiết yếu

Trong một thời gian nhất định mỗi gen mã hóa cho một protein chỉ hoạt độngvới công suất nhất định nên hiệu suất sản xuất protein cũng chỉ là giới hạn Từ

đó nhân tố tái bản gen đáp ứng đủ nhu cầu phát triển l ợng protein là rất quantrọng Đặc điểm chu kỳ sinh trởng và sinh sản ở động vật nói chung dài gấpnhiều lần ở sinh vật đơn bào (vi khuẩn, nấm) Hiện nay xu h ớng sử dụng khảnăng sinh sản nhanh của những sinh vật đơn bào làm môi tr ờng sản xuất gencũng nh sản xuất protein rất đợc chú ý

Nhiều động vật sở hữu những quy trình sản xuất những loại protein hiếm, quý

đang có nguy cơ tiệt chủng do nhiều nguyên nhân Nhân tố bảo tồn nhữngnguồn gen trở nên cần thiết Việc xây dựng những ngân hàng gen đang pháttriển với hai ý nghĩa là bảo tồn gen quý hiếm (ngân hàng hệ gen) và cung cấpgen (ngân hàng cADN) để sản xuất protein

khi thay đổi do yếu tố môi trờng hầu hết dẫn đến biến tính Cơ sở để phát triển chấtlợng protein chỉ có thể dựa vào sự thay đổi gen hay chí ít cũng là thay đổi quan hệgiữa các gen cùng tơng tác ảnh hởng đến quy trình sản xuất protein.

Sử dụng các phơng pháp lai để tạo giống có phẩm chất protein tốt hơn đã đ

-ợc vận dụng để tận dụng u thế lai trong phơng thức biểu hiện của gen Ngày nay,

để phát triển chất lợng protein ngời ta đang quan tâm nhiều tới phơng thức gây

đột biến gen nhân tạo, chọn lọc và bảo tồn đột biến gen Kết quả đã tạo đ ợcnhiều giống rau quả biến đổi gen đã đợc sử dụng Hậu quả việc sử dụng các sảnphẩm biến đổi gen ảnh hởng ở mức độ nào tới sự sống con ngời cần đợc kiểm trachặt chẽ và cẩn thận

5.1.4 Chu trình phân bào, sự chết của tế bào

 Nguồn gốc sự phân bào

Tế bào sinh dỡng ở Eucaryota có bộ NST lỡng bội 2n và là sân bãi diễn ra

hầu hết các quá trình sinh hóa sản xuất các chất cần thiết (chủ yếu là protein)cho cấu tạo và năng lợng cho hoạt động tế bào làm cho lợng (đồng thời là thểtích) bào chất (Vtbc) liên tục tăng lên; trong khi đó số l ợng NST trong nhân bàokhông đổi, nói cách khác diện tích màng nhân = Smn cũng không đổi Mặt khácvới số lợng NST đó, bộ NST chỉ có thể điều hành một thể tích tế bào chất giớihạn Tỷ số Vtbc/Smn khi đạt giá trị tối đa nếu không giảm đợc tỷ số đó thì quátrình trao đổi chất trong tế bào sẽ buộc không tiến triển nữa (quy luật hóa học).Biện pháp duy nhất bảo tồn thuộc tính biến đổi không ngừng của vật chấthữu cơ là phân bào (tiền đề mọi quá trình sinh sản) Qua biện pháp này, thể tíchbào chất (Vtbc) đợc chia làm hai phần, số lợng NST tăng gấp đôi và khi phối hợp1/2 Vtbc với 1/2 số NST đã gấp đôi sẽ đợc tỷ lệ Vtbc/Smn (Smn: diện tích màngnhân) bằng nửa tỷ lệ này ban đầu Nh vậy sự trao đổi chất trong tế bào mới lại

có thể tiếp tục

Tuy nhiên trong giới sinh vật Eucaryota, tồn tại nhiều phơng thức phân bào

khác nhau nhng kết quả cuối cùng thống nhất ở một nội dung là tạo ra đ ợcnhững tế bào mới giữ đợc những đặc điểm cơ bản trong cấu tạo và hoạt độngsống của thế hệ tế bào xuất phát

 Chu trình phân bào ở Eucaryota

Phân bào là quá trình diễn ra ở tất cả sinh vật, nó thể hiện nền tảng cho sinhsản, sinh trởng, bổ sung tế bào vầ bảo tồn loài

Protein là vật chất chủ yếu nhất biểu hiện mọi tính trạng của tế bào; nh ngphân bào lại không đảm bảo phân chia đầy đủ loại và khối l ợng protein của tếbào thế hệ trớc cho các tế bào thế hệ sau mà chỉ phân chía đều đặn quy trìnhtổng hợp (các mã thông tin di truyền) cho tất cả các chất cần thiết, trong đó chủyếu là cho protein Vì vây khảo sát sự phân bào chính là tìm hiểu những biến đổi

các NST trong hệ genom của tế bào Eucaryota

Tế bào Eucaryota có ba phơng thức phân bào là trực phân, nguyên phân và

giảm phân [ABC Biologie, 1967, tr 902]

 Trực phân (amitose): thắt đứt một tế bào kể cả nhân thành 2 tế bào con.

Trực phân tồn tại chủ yếu ở những tế bào đặc biệt đã biệt hóa sâu sắc ởnhững tế bào loại này dễ xuất hiện tác động gián đoạn chức năng đối với cơthể Sự phân chia nhân lớn (macronucleus) ở trùng tơ cũng diễn ra theo kiểutrực phân Trực phân diễn ra ở tế bào hoặc nhân bào sinh dục tất nhiên làhiện tợng bệnh lý

 Nguyên phân (mitose – phân chia gián tiếp): xảy ra phổ biến, tại đó nhân

bào trải qua biến thái đặc trng và cũng qua đó vật chất nhiễm sắc cũng chính

là thông tin di truyền đợc phân chia đều về số lợng và chất lợng cho hai tếbào con Sự biến thái NST (nhân đôi NST tạo thể tứ, phân ly cặp NST t ơng

đồng tạo NST kép, Phân ly NST kép, tái tổ hợp cặp NST t ơng đông) diễn ratrong 4 thời kỳ chính (kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối) Trong kỳ cuối(telophase) ở thực vật,ớau khi các NST đã hình thành các cặp t ơng đồng ở haicực tế bào thì một phiến màng bào xuất hiện ở mặt phẳng xích đạo tế bào, lớndần lên và nối liền với thành dọc của tế bào chủ thành hai tế bào con Trong

kỳ cuối nguyên phân ở tế bào động vật sau khi các NST đã hình thành cặp t

-ơng đồng ở hai cực tế bào, màng sinh chất thắt dần lại ở mặt phẳng xích đạo

tế bào chủ và tế bào chủ đứt ra thành hai tế bào con Sự phân chia bào chấtsau khi sự phân chia nhân diễn ra nhiều lần và kết quả có số l ợng tế bào con

đúng bằng số nhân đợc hình thành trong tế bào chủ; hiện tợng này gọi là đaphân (multiple mitose)[ABC Biologie, 1967, tr 903]

 Giảm phân (meiose): là sự phân bào gồm hai lần phân chia tế bào từ một tế

bào ban đầu (tế bào sinh dục nguyên thủy) Lần một là lần phân bào giảmnhiễm, cũng có 4 kỳ tơng tự nh ở nguyên phân Tuy nhiên trong kỳ cuối khôngxảy ra sự phân ly cặp NST kép mà chỉ diễn ra sự phân ly cặp NST t ơng đồng.Mỗi tế bào con chỉ có những NST kép nguuồn gốc từ 1 trong 2 NST của cặp t -

ơng đồng Bộ NST (đơn bội) của chúng về chất lợng thông tin di truyền chỉbằng nửa của bộ NST (lỡng bội) ở tế bào ban đầu Lần phân bào thứ haikhông có kỳ đầu và trong kỳ cuối là sự phân ly NST kép Sau hai lần phânbào, từ một tế bào ban đầu đã hình thành 4 tế bào với bộ NST (đơn bội) bằngnửa bộ NST (lỡng bội) ở tế bào ban đầu cả về chất l ợng thông tin di truyền lẫn

về số lợng NST Những tế bào đơn bội ngợc giói tính sau khi hợp nhất vớinhau se cho tế bào lỡng bội giống nh tế bàop ban đầu về số lợng NST nhng

có thể thay đổi về chất lợng thông tin di truyền

5.1.5 Sự ung th

5.2 Các biến động của bộ gen

Tái tổ hợp di truyền là hiện tợng tổ chức lại hệ gen cá thể để đảm bảo sự tồntại của cá thể (bảo tồn cấu trúc hệ gen) và để cá thể phát triển thích ứng với cácyếu tố môi trờng (đổi mới cấu trúc hệ gen)

Tái tổ hợp nội phân (intramolecular recombination) là quá trình đó phụ thuộccác men Các kiểu cách khác nhau gồm có:

+Trao đổi chéo tơng đồng (homologous recombination): đòi hỏi sự tơng đồnggiữa hai đoạn ADN (còn gọi là tái tổ hợp chung – general recombination)

+Trao đổi chéo đặc hiệu (site-specific recombination): xảy ra ở những vị trí

đặc hiêu trên hai đoạn ADN và đòi hỏicác men tam gia nhận biết đ ợc vị trí đặchiệu (đoạn ngắn) có thể xảy ra giữa hai đoạn bất kỳ không nhất thiết t ơng đồng.+Sự chuyển chỗ các đoạn ADN (các transposon) liên quan đến các yếu tố cókhả năng vận động (mobile genetic element) giữa hai vị trí tách ra và ghép vàotrên một hay hai phân tử ADN

+Trao đổi chéo sai lệch (illegitimate recombination) liên quan đến sự thêm

đoạn, mất đoạn hay nối sai các đoạn ADN với nhau trong quá trình tái bản hoặctrao đổi chéo không cân bằng (unequal crossing over) giữa các nhiễm sắc thể

Đột biến là tạo ra thông tin di truyền mới cho hệ gen (khác với tái tổ hợp).Tuy nhiên đột biến và tái tổi hợp thờng đi đôi với nhau Ví dụ trao đổi chéo sailệch hoặc di chuyển các yếu tố ADN (transposon) có khả năng di truyền có thểgây ra những đột biến làm thay đổi cấu trúc của gen Ng ợc lại, tái tổ hợp là một

Trên vi khuẩn E coli phức protein Rec-BCD (có hoạt tính nuclease và

helicase) có khả năng tạo vết đứt trên sợi đơn ADN và giải phóng sợi này khỏicấu trúc kép (cần ATP)

Trao đổi chéo thờng đợc khởi động tại vị trí Chi (trình tự GCTGGTGG); cứ

khoảng 5 kb lại có một vị trí nh vậy Phức Rec-BCD nhận biết vị trí này và cắtliên kết bổ sung cách đấy khoảng 5 nucleotid về phía đấu 3 Sau đó helicase t’ Sau đó helicase t -

ơng tác với ADN để mở xoắn tạo sợi đơn Protein Rec-A nhận biết sợi đơn tạophức nucleo-protein Khi tìm thấy đoạn tơng đồng trên NST, phức này (Rec-

AADN dạng đơn) mở xoắn và tạo liên kết bổ sung giữa sợi đơn của phức với một trong hai sợi đơn của NST

Trao đổi chéo sợi đơn giữa hai đoạn ADN tơng đồng ở Procaryota

Trao đổi đoạn ADN ở Eucaryota

Tại vị trí nối dị hợp có xảy ra lỗi tạo cặp base; Lỗi này đ ợc khắc phục nhờ cơchế sửa chữa ADN Nhóm protein RAD (trong đó có RAD51 rất t ơng đồng với

RecA của E coli) tham gia trao đổi chéo ở Eucaryota đợc phân lập đầu tiên từ tế

bào nấm không có khả năng sửa chữa ADN hoặc bị rối loạn phân bào nguyênphân Sau đó các dạng tơng đồng với RAD51 tìm thấy ở ruồi giấm, chuột và ng ời.Gen mã cho các dạng RAD51 đều đợc hoạt hóa khi ADN bị tổn thơng

Gen DST1 (thuộc họ gen rad51) mã cho sản phẩm chỉ có vai trò trong mitose.Gen rad50 mã cho protein tơng tác với ADN (sửa chữa ADN bị đứt gẫy của tếbào soma nhng kích thích đứt gẫy ADN trong tế bào meiose)

Gen rad52 mã cho protein RAD52 cần cho tái tổ hợp chung ở cả tế bào soma

và tế bào sinh dục.

Trao đổi đoạn mạch đơn ở Eucaryota

 Trao đổi gen do tái tổ hợp chung và do tổng hợp ADN có giới hạn

 Trao đổi gen do tái tổ hợp chung

Trao đổi chéo đoạn NSTử (gen E) giữa hai NST tơng đồng

Đoạn e không bổ sung với E, đ“giọt sống - coacerva” ch ” ch ợc cắt bỏ

Đoạn E đợc dùng làm khuôn tổng hợp E

 Trao đổi gen do tổng hợp ADN có giới hạn

Thay thế gen giữa hai NSTử của một NST

do tổng hợp ADN có giới hạn

 Tái tổ hợp ADN ở vị trí đặc hiệu

 Phage Mu

Tái tổ hợp đặc hiệu phát hiện lần đầu tiên ở E coli Khi xâm nhập tế bào chủ,

men integrase của phage (thể thực khuẩn) và protein IHF của tế bào chủ liên kếtvới vị trí đặc biệt trên -ADN (của phage) và bám vào hệ gen của tế bào vi

khuẩn Lúc này xảy ra trao đổi chéo giữa hai genomee (phage và E coli); Phage

có thể ở dạng tiềm tan

Tùy theo chiều sắp xếp của các vị trí đặc hiệu trên ADN mà trao đổi chéo

đặc hiệu có thể diễn ra theo 3 cách khác nhau:

+Trao đổi chéo đặc hiệu ngoại phân tử (intermolecular site-specific

recombination): sự ghép vào hoặc tách ra giữa hai phân tử ADN (nh ghép

-ADN vào genome của E coli).

Cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu ở E coli

+Trao đổi chéo đặc hiệu nội phân tử (intramolecular site-specific recombination): giữa các đoạn nucleotid lặp lại cùng chiều hay ngợc chiều của một phân tử ADN Ví dụ sự trao đổi chéo đặc hiệu tại vùng G (3000 bp) của phage Mu Đoạn G (có 34 nucleotid lặp lại ngợc chiều ở hai đầu) có khả năng

đổi chiều ngay tại vị trí của mình Sự đổi chiều của G phụ thuộc hai đoạn lặp lại này và protein GIN (mã bởi gen gin).

Trao đổi chéo giữa hai chuỗi lặp lại ngợc chiều gixL và gixR gây ra sự đổichiều đoạn G Do vậy hoạt động của các gen S và U bị thay thế bởi S và U ’ Sau đó helicase t ’ Sau đó helicase t

Sản phẩm của hai cặp gen này của Mu qui định giới hạn tế bào chủ E coli.

5.2.2 Tái tổ hợp chuyên biệt

 Gen tái tổ hợp

Ngày nay nhờ kỹ thuật tách dòng và tái tổ hợp ADN có thể thu đ ợc số lợngkhông hạn chế những đoạn ADN cần nghiên cứu, cần xác định trình tự nucleotidtrên chúng hay cần phân lập và tách một gen bất kỳ ra khỏi genomee Gen tái tổhợp có thể mang những đột biến theo yêu cầu và đ ợc cấy vào phôi Những gentái tổ hợp hoạt động trong genomee của cá thể chuyển gen vào vật chủ và đ ợc ditruyền cho các vật chủ thế hệ sau

Ví dụ sự tách dòng và tái tổ hợp gen ngời; trong đó plasmid mang gen lạ đợc gọi là vector (cloning vector – vật mang vô tính) Có nhiều loại vector khác nhau mang các đoạn ADN kích thớc khác nhau Từ đó có thể tổng hợp những protein tơng ứng với số lợng theo ý muốn dẫn đến sản xuất hormon hay vaccine

dễ dàng và hiệu quả hơn Mặt khác vấn đề bảo tồn giống, tạo giống mới, chẩn

đoán và điều trị bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền nh ung th hoặc AIDS có nhiều hứa hẹn khả quan.

Kỹ thuật tách dòng gen ngời

 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotid

Phân cắt ADN bởi men giới hạn (restriction enzym)

Kích thớc genome ở Eucaryota là rất lớn (105-1011 nucleotid) Để có thể cắt chính xác một gen (đoạn ADN) mong muốn nhất thiết có sự tham gia của men giới hạn (restriction enzym hay restriction nuclease) Chúng nhận biết vị trí đặc hiệu (gồm 4-8 nucleotid) trên ADN và cắt phân tử này thành những đoạn khác nhau:

Men Hpd cắt thành các đoạn đầu bằng blunt ends“giọt sống - coacerva” ch ” ch

Men EcoR cắt thành các đoạn đầu dính cohensive ends“giọt sống - coacerva” ch ” ch

Mỗi đầu dính của ADN này có thể liên kết bổ sung với các đoạn đầu dính của ADN khác

phân tử ADN tái tổ hợp

Hiện nay đã sản xuất hơn 100 men giới hạn nhân tạo khác nhau Các đoạn bị cắt bởi các men giới hạn gọi là các đoạn giới hạn (restriction fragment) Sử dụng riêng biệt và sử dụng phối hợp các men khác nhau để cắt cùng một phân tử ADN cho phép xác định chính xác trật tự các nucleotid của phân tử ADN đó Nh vậy, cuối cùng thiết lập đợc bản đồ giới hạn.

Lặp lại sử dụng các men khác và sự phối hợp cắt sẽ xác định trật tự các vị trí cắt

và luận ra trình tự các nucleotid tơng ứng các vị trí cắt

Kỹ thuật sử dụng các men giới hạn để cắt phân tử ADN giúp lập bản đồ giớihạn, so sánh cùng một đoạn ADN ở sinh vật khác nhau, nghiên cứu quá trìnhtiến hóa và giúp cho tách dòng và công nghệ gen

Phân ly các đoạn ADN

Phân tử ADN tích điện âm sẽ dịch chuyển về cực dơng trong môi trờng điệnmột chiều Các phân tử ADN kích thớc khác nhau dịch chuyển đoạn đờng khácnhau do điện di ngang trên gel agarose hoặc điện di đứng trên gelpolyacrylamid Các ADN lớn (105-107 cặp nucleotid) đợc điện di trong điện trờng

đẩy pulsed-field ; Các ADN có kích th“giọt sống - coacerva” ch ” ch ớc 300-10.000 cặp nucleotid đợc phân lytrên gel agarose hoăc acrylamid với nồng độ khác nhau Những đoạn hơn kémnhau một nucleotid đợc xác định nhờ gel polyacrylamid (phơng pháp xác địnhtrình tự nucleotid)

Sau khi điện di, các đoạn ADN trên gel có thể quan sát bằng mắt th ờng khinhuộm bạc hoặc nhuộm ethidium bromid dới tia tử ngoại

Khi ADN đợc gắn nguyên tố phóng xạ (P32, S35) hoặc chất phát huỳnh quangthì chúng đợc phát hiện rất nhanh nhạy ngay ở lợng rất nhỏ (cỡ nano-gram = ng)

Ghép đoạn ADN vào vector

Các vector nhận ADN có kích thớc khác nhau Plasmid thờng có kích thớc nhỏkhông mang đợc ADN có kích thớc lớn (<7 kb) Tuy nhiên vector nhân tạo YAC(yeast artifical chromosom) có thể mang đoạn ADN cỡ 1 Mb

Các vector hiện nay hay dùng là plasmid, phage, cosmid, BAC (bacteria

artifical chromosom)

Để đa một đoạn ADN vào vector (vật mang) thì các đầu dính (-NH2) củavector phải liên kết với ADN theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung Th ờng dùng cùngmột loại men giới hạn cắt vector và ADN để tạo các đầu dính Sau đó chúng đ ợcnối với nhau nhờ men ligase Ưu điểm của phơng pháp này là dùng chính mengiới hạn đó để lấy lại đoạn ADN từ vector chứa chúng

ADN tái tổ hợp đợc đa vào tế bào nhận, thờng là vi khuẩn Chúng đợc nuôi cấy tăng số lợng Để phân lập vi khuẩn chứa vector cần dựa vào dấu hiệu nhận biết chúng (vector mang gen chống chịu kháng sinh mọc đợc trong môi trờng có kháng sinh), hoặc dựa vào vị trí nằm trong vùng chứa mã di truyền của gen đánh dấu khi ghép ADN lạ làm cho hoạt động của gen này bị thay đổi (nhận biết qua

sự thiếu vắng sản phẩm từ gen đó) Nh vậy dể dàng nhận biết và phân lập tế bào mang vector chứa ADN lạ khỏi những tế bào khác

Khi ADN lạ là vùng mang mã di truyền của một gen (ADNc) đợc đa vào vector có sẵn promotor thì sản phẩm của gen đợc tổng hợp ngay trong tế bào nhận Loại vector này gọi là vector biểu hiện (expession vector); thông thờng vector loại này chứa nhiều promotor tổng hợp m-ARN (promotor nguồn gôc vi khuẩn, virus).

Loại vector biểu hiện – expression vector

Ví dụ vector có đoạn nucleotid mã cho protein đánh dấu “fusion protein” (nh phát huỳnh quang: GFP = Green Fluoresence Protein) Biểu hiện của gen lạ

là khi đợc ghjép vào vector thì sản phẩm của ADNc (protein) dung hợp với protein đánh dấu GFP Nhờ sự phát huỳnh quang của GFP mà nhận biết hàm l- ợng protein, sự phân bố và chức năng của mã bởi gen lạ trong tế bào sống.

Loại vector chứa gen đánh dấu

 Xây dựng ngân hàng gen cADN (cADN library)

Kích thớc của một gen bất kỳ chiếm một phần rất nhỏ so với toàn bộgenome Genome của động vật có vú khoảng 109 bp; một gen dài 10.000 bp chỉchiếm 0,001% tổng số ADN trong tế bào Để tách chính xác một gen phải có mồi

đặc hiệu (m-ARN từ gen đó) Đối với những protein hiếm, m-ARN của nó rất ít;mặt khác m-ARN dễ biến tính nên rất khó thao tác trong thực nghiệm với độchính xác cao

Khắc phục nhợc điểm này nhờ vào các men reverse transcriptase và ADN polymerase Qua đó tạo ra đợc rất nhiều ADN trên số lợng rất nhỏ khuôn mẫu m-ARN gọi là cADN (complementary ADN) Các cADN khác nhau đợc đa vào vector và tách dòng cADN dễ dàng theo mong muốn Các vector chứa cADN đ-

ợc biến nạp vào tế bào nhận Tập hợp các tế bào nhận chứa cADN tạo thành ngân hàng cADN.

Cơ chế tạo cADN (sợi kép, đầu bằng) theo khuôn m-ARN tách chiết từ tế bàoCác cADN đầu bằng rất khó đợc đa vào vector Do vậy các Linker (L) thờng

đợc nối vào hai đầu của cADN nhờ ADN-ligase Những đoạn nucleotid của mengiới hạn chứa vị trí nhận biết đợc tổng hợp nhân tạo Sau đó các cADN mangLinker chứa vị trí nhận biết cũng nh vector sẽ đợc xử lý với men tơng thích (có vịtrí nhận biết nằm trong Linker) Với các Linker, các cADN có đầu so le (đầu dính)

và dễ dàng đợc đa vào vector

 Xây dựng ngân hàng hệ gen (genomeic ADN library)

Một phân tử cADN chỉ tơng ứng với các exon của một gen, trong khi gen

Eucaryota còn chứa các intron Kích thớc trung bình của một gen khoảng 15-20

kb Để có thể đa toàn bộ các gen của hệ gen ở Eucaryota vào ngân hàng, trớc hết

hệ gen phải bị cắt bởi men giới hạn thành các đoạn ADN có kích th ớc thích hợpvới vector nhận chúng

Các men nhận biết 4-8 nucleotid thực hiện cắt genome thành các đoạn Vớimột genome, đoạn cắt này sẽ càng dài và số lợng chúng càng ít khi số nucleotid

ở vị trí cắt càng nhiều (ví dụ 8 nucleotid) Hơn nữa không dễ có đ ợc đoạn cắtchứa nguyên vẹn một gen Trong thực tế một gen thờng bị phân bố ở nhiều đoạncắt do vị trí nhận biết nằm ngay trong gen

Để mọi vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời cần khống chế nồng độ mennhận biết và thời gian cho phản ứng cắt sao cho phản ứng chỉ xẩy ra ở từng phầncủa genome Sau đó đa các đoạn cắt vào vector thích hợp Tập hợp các vectorchứa các đoạn ADN tạo thành ngân hàng hệ gen (genomic ADN library) Bảoquản ngân hàng này bằng cách ghép vào phage (ghép đoạn ADN 10-15 kb),cosmid (ghép đoạn ADN 50 kb) hay BAC (ghép đoạn ADN 100 kb)

Các giai đoạn chính tạo một clone (thể mang ADN lạ)

Xây dựng nhân hàng hệ gen dùng vector (hệ gen thực khuẩn)

Sử dụng loại vector khác nhau sẽ có những ngân hàng khác nhau cho mộtcá thể Từ ngân hàng hệ gen, muốn tìm đợc một clone với xác xuất P thì sốvector N mang clone (ADN) cần phải sử dụng là:

N =

)11ln(

)1ln(

Ví dụ genome của ngời khoảng 2,8.109 bp bị cắt thành các đoạn 20 kb Ta có

n = 1,4.105 Để tìm một clone với sác xuất 95% thì cần lấy từ ngân hàng N = 4,2.105 phân tử ADN tái tổ hợp Nếu muốn tìm thấy với xác xuất cao hơn (99%) thì số phân tử cần phải lấy là N = 6,5.105

Từ các mô khác nhau có thể xây dựng đợc một ngân hàng hệ gen nhngnhiều ngân hàng cADN (từ các m-ARN) vì từ các mô khác nhau thu đ ợc các m-ARN khác nhau Nh vậy mỗi cá thể có thể xây dựng một ngân hàng hệ gen vànhiều ngân hàng cADN khác nhau đặc trng cho từng mô khác nhau

Ngân hàng hệ gen

cADN library

Sự khác nhau giữa các clone của hai ngân hàng gen

 Các phơng pháp lai ghép acid nucleic

Kỹ thuật lai ghép acid nucleic đợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứugenome, gen và biểu hiện của gen Nguyên tắc của phơng pháp là tạo sợi acidnucleic liên kết bổ sung giwax hai sợi đơn ARN, ADN hay ADN/ARN

Khi ở nhiệt độ cao hay nồng độ muối thấp, phân tử lai (dạng sợi kép) chỉ đ ợchình thành nếu độ tơng đồng giữa hai sợi cao Do vậy tùy mục đích nghiên cứu(phát hiện số lợng bản sao gen trong genome hay số lợng m-ARN của gen, …) gọi chung là hệ gen bào t)

mà thay đổi điều kiện của phản ứng lai

Phơng pháp này nhằmphân biệt một đoạn ADN nhất định trong số các đoạn bịcắt bởi men giới hạn do Edward Souther phát minh Phơng pháp đòi hỏi một đoạnADN hoặc ARN đã biết đợc sử dụng làm mồi (làm đầu dò probe để lai với ADN“giọt sống - coacerva” ch ” ch

cần tìm Mồi thờng đợc đánh dấu bởi chất phóng xạ hoặc chất phát mầu

Các đoạn ADN bị cắt đầu tiên đợc phân ly trên gel agrarose Sau đó các sợi képADN (trên gel) bị biến tính (do xử lý với kiềm) và đợc chuyển sang một màng (thờng

là màng nylon hoặc nitrocellulose) Các đoạn cắt đợc lai với mồi đặc hiệu đã đánhdấu Vị trí các đoạn lai đợc xác định nhờ phim có độ nhạy đặc hiệu với phóng xạ Ph-

ơng pháp này cho phép xác định đoạn ADN duy nhất (xuất hiện 1 lần trong hệ gen ~1/106) khi chỉ dùng 5 g ADN genome Thông thμm (dạng mở xoắn) ờng đoạn ADN mồi có kích thớckhông quá 5 kb đợc dùng làm khuôn để tổng hợp ADN mới (ADN đích) từ các đoạnnucleotid đã đánh dấu Trong phản ứng này có thể dùng ADN polymerase và cácADN mồi ngẫu nhiên 6 nucleotid (hexamer) Các đoạn ADN đích (do tổng hợp mới) thờng có độ dài từ 300-1000 nt (nucleotid).

Thờng dùng bản đồ các vị trí giới hạn của đoạn NST chứa gen để nghiên cứubiến đổi diễn ra ở một gen bất kỳ Trớc hết vùng ADN chứa gen của ca s thể bình th-ờng và cá thể đột biến đợc cắt bởi các men có vị trí nhận biết nằm trong vùng đó Sosánh bản đồ vị trí (do lai Southern blots) giữa hai cá thể có thể phát hiện những biến

đổi (nh thêm đoạn, mất đoạn hay thay đổi trật tự các đoạn ADN nằm trong vùng đó

Sự thay đổi nucleotid khó bị phát hiện ngoại trừ sự thây đổi đó làm thay đổi vị trí nhânbiết của men giới hạn

ứng dụng lai Southern blots để phát hiện số lợng bản sao một gen tronggenome, sự thay đổi trật tự sắp xếp các đoạn ADN lạ, sự thay đổi vị trí cáctransposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các intrôn và exon của 1 gen Khi sử dụng các chỉ thị phân tử (ADN-marker) làm mồi chúng ta có thể phân biệt

…) gọi chung là hệ gen bào t

các loài, các cá thể dới loài

Phơng pháp Northern blots

Cơ chế tơng tự nhng ở đây m-ARN đợc lai với mồi ADN (ARN)

Sử dụng phơng pháp này để xác định mức độ hoạt động của gen Với nhữnggen mà m-ARN đợc tổng hợp ít thì trớc khi tiến hành lai Northern (ghép cặp bổ sungvới ADN/ARN mồi) có thể làm giàu m-ARN bằng cách phân lập chúng khỏi cácARN khác nhờ cho qua cột gắn poly-T Nh“giọt sống - coacerva” ch ” ch vây các m-ARN mang đuôi A sẽ bị giữlại Chú ý m-ARN dễ bị biến tính nên thao tác cần chính xác và cẩn thận nghiêmngặt.

Phơng pháp lai in-situ

Phát triển từ phơng pháp lai Southern, kỹ thuật này sử dụng mồi là những

đoạn nucleotid hoặc kháng thể đánh dấu để lai ghép với ADN, ARN hoặc protein ngay trong tế bào mà không cần tách chiết chúng Các mồi oligonucleotid (đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang).

Ngày nay kỹ thuật nano-fish (fluorence-in-situ-hybridisation) sử dụng cácchất mầu khác nhau cho phép phát hiện các đột biến ở từng nucleotid, kiểu độtbiến (đứt gẫy liên kết đờng-base hay nu.-nu v.v.)

5.2.3 Sự chuyển vị (transposition)

+ Sự chuyển vị transposon

Trong cơ chế này sự di chuyển của một transposon đ ợc thực hiện qua sựtách rời của nó khỏi vị trí cũ và sau đó gắn vào vị trí mới Cơ chế di chuyển nàykhông làm thay đổi số lợng transposon Vị trí cũ bị gẫy rời đợc nối lại nhờ cơ chếsửa chữa ADN trong tế bào Kiểu di dời này chỉ đòi hỏi men transposase Tại vịtrí mới, một đoạn nucleotid ngắn đợc sao thành hai bản, mỗi bản nằm ở một đầucủa transposon (kiểu lặp lại trực tiếp = direct repeat) Sơ đồ mô tả quá trình nàytrong hình vẽ dới đây:

Sự tái bản thể thực khuẩn Mu vào genome vi khuẩn (E coli) là ví dụ điển

hình về transposon Tơng tự thể thực khuẩn , thể thực khuẩn Mu (phage Mu)λ, thể thực khuẩn Mu (phage Mu)cũng có hai trạng thái tan và không tan Đặc điểm của phage Mu trong trạng thái tan là khi gắn vào vị trí mới chúng tái bản ADN theo cách sao y bản chính Bản thân phage Mu có hệ gen (38.000 bp) chứa các gen liên quan tới quá trình di dời

và các gen mã hóa protein cấu trúc có chức năng đóng gói ADN tạo thể phage mới Phage Mu đợc giới hạn bởi hai đoạn ADN (nucleotid) lặp lại ngợc chiều và nhờ thế chúng tạo ra theo cách lặp lại trực tiếp (direct repeat) các đoạn mạch đơn ADN còn trống.