di truyền phân tử 06

Chơng 7 ứng dụng của di truyền học7.1 ứng dụng trong Chọn lọc và cải tạo giống 7.1.1 ứng dụng trong chọn giống Chọn giống là sự lựa chọn các cá thể đực và cái để giữ lại làm giống, đồngt

Chơng 7 ứng dụng của di truyền học

7.1 ứng dụng trong Chọn lọc và cải tạo giống

7.1.1 ứng dụng trong chọn giống

Chọn giống là sự lựa chọn các cá thể đực và cái để giữ lại làm giống, đồngthời loại ra những cá thể không làm giống Sự tuyển chọ và loại thải này thùythuộc vào mục đích và phơng pháp chọn giống; do vậy đây là hình t6hức chọnlọc nhân tạo Ngoài tác động của chọn lọc nhân tạo, đặc tính di truyền của giốngcòn chịu ảnh hởng của chọn lọc tự nhiên

Tần số gen của quần thể giống bị thay đổi qua 3 giai đoạn: giai đoạn đầu dotác động của chọn lọc nhân tạo (chọn phối và nuôi dỡng), giai đoạn hai do chọnlọc tự nhiên tác động (các yếu tố môi tr ờng tự nhiên) và giai đoạn ba do tác độngcủa chọn lọc tự nhiên tới sức sống của thế hệ con cái [Nguyễn Hải Quân và cộng

sự, 2005, tr 83]

Tuy chọn lọc tự nhiên có ảnh hởng trong quá trình chọn lọc, nhng không cóliên quan sâu sắc tới các gen chi phối tính trạng số lợng nên không cần thiết đềcập trong các nội dung chọn giống

 Hệ số di truyền trong chọn giống

Hệ số di truyền là thành phần xác định hầu hết những tham số quan trọngtrong chọn giống

h2 R 0.2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,2 0,4 0,60,1 0,32 0,41 0,38 0,36 0,47 0,41 0,37 0,51 0,43 0,38 0,53 0.44 0,390,2 0,45 0,58 0,54 0,50 0,66 0,58 0,52 0,71 0,61 0,54 0,75 0,63 0,540,3 0,55 0,66 0,61 0,71 0,64 0.74 0,66 0,76 0,67

0,4 0,63 0,76 0,70 0,81 0,73 0,83 0,76 0,88 0,76

Trích theo Nguyễn Hải Quân, 2005, tr 92a) Trờng hợp giá trị kiểu hình của tính trạng đ ợc xác định trên bản thân convật, ví dụ tính trạng tăng khối lợng trung bình của gia súc nuôi thịt và tính trạng

độ dày mỡ lng của lợn đực giống

Ví dụ: chọn lọc một bò cái có h2 = 0,3 và hệ số lặp lại R = 0,4

- Nếu chỉ căn cứ vào sản lợng sữa của một kỳ tiết sữa , độ chính xác của chọnlọc là rAP = 2

h = 0 , 3 = 0,55

- Nếu căn cứ sản lợng sữa trung bình của 3 kỳ tiết sữa thì độ chính xác củachọn lọc là rAP =

R ).

1 m ( + 1

h

m 2 =

4 , 0 ).

1 3 ( + 1

3 , 0 3

= 0,71b) Trờng hợp giá trị kiểu hình đợc xác định trên tổ tiên

Phơng thức sử dụng giá trị kiểu hình trên tổ tiên Độ chính xác chọn lọc

1 giá trị kiểu hình trên bố hoặc mẹ rAP = 2

h 2

1 Vài giá trị kiểu hình trên bố hoặc mẹ

1 giá trị KH trên bố và 1 giá trị KH trên mẹ rAP = 2

h 2 1

Trên mỗi tổ tiên (bố, mẹ, ông nội, bà nội, ông ngoại,

bà ngoại) sử dụng 1 giá trị KH

Trên s anh chị em mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH

Trên s anh chị em nửa ruột thịt mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH

Trên p con cái mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH

Độ chính xác của chọn lọc dựa trên nguồn số liệu giá trị KH khác nhau

íiố lợng Anh chị em ruột Số lợng anh chị emNửa ruột thịt Số lợng đời con

0,1 0,22 0,27 0,29 0,32 0,22 0,29 0,38 0,17 0,23 0,29 0,36 0,34 0,45 0,58 0,71 0,82 0,87 0,2 0,32 0,37 0,39 0,45 0,30 0,39 0,48 0,23 0,29 0.36 0,41 0,46 0,59 0,72 0,82 0,90 0,93

0,3 0,39 0,43 0,45 0,55 0,36 0,45 0,54 0,27 0,33 0,39 0,44 0,56 0,70 0,79 0,87 0,93 0,95 0,4 0,45 0,49 0,50 0,63 0,41 0.50 0,58 0,30 0,36 0,41 0,45 0,60 0,73 0,83 0,90 0,95 0,96 0,5 0,50 0,53 0,54 0,71 0,45 0,53 0,60 0,32 0,38 0,43 0,46 0,65 0,77 0,86 0,92 0.96 0,97 0,6 0,55 0,57 0,57 0,77 0,48 0,56 0,62 0,34 0,40 0,44 0,47 0,68 0,80 0,88 0,94 0,97 0,98 0,7 0,59 0,61 0,61 0,84 0,51 0,58 0,63 0,36 0,41 0,45 0,47 0,72 0,82 0,90 0,95 0,97 0,98 0,8 0,63 0,64 0,64 0,89 0,53 0,60 0,65 0,37 0,42 0,46 0,48 0,75 0,84 0,91 0,95 0,98 0,98 0,9 0,67 0,67 0,67 0,95 0,56 0.62 0,66 0,38 0,43 0,46 0.48 0,77 0,8G 0,92 0,96 0,98 0,99 1,0 0,71 0,71 0,71 1,00 0,58 0,63 0,67 0,39 0,44 0,47 0,48 0,79 0,88 0,93 0,96 0,98 0,99

Trích từ Nguyễn Hải Quân, 2005, tr 95Ngoài ra, hệ số di truyền còn tham gia xác định chỉ số chọn lọc

Hệ số di truyền còn là tham số xác định giá trị giống  (giá trị các gen mà con giống truyền cho thế hệ sau)

Dùng số liệu 1 giá trị KH 1 lần từ bản thân

Dùng số liệu 1 giá trị KH nhắc lại m lần từ bản thânDùng i số liệu giá trị KH 1 lần từ mỗi bản thân

và những cá thể họ hàng

 ứng dụng tơng tác gen trong lai giống

Lai giống là dùng hai dòng cho giao phối với nhau, hoặc cho hai cá thể thuộchai dòng cận huyết giao phối với nhau Trờng hợp cho hai cá thể thuộc hai loàigiao phối với nhau thì gọi là lai xa

Mục tiêu của lai giống là lợi dụng tơng tác trội hay siêu trội trong biểu hiệncủa gen ở con lai (F1) nhằm nâng cao khả năng sản xuất của chúng (thịt, trứng,sữa…), tạo điều kiện hình thành giống mới, đồng thời lợi dụng ), tạo điều kiện hình thành giống mới, đồng thời lợi dụng u thế lai của sinhvật (heterosis)

Phần này không đề cập nguyên nhân dẫn đến u thế lai trong lai giống mà chỉphân tích kết quả do u thế lai mang lại

Giá trị của u thế lai ở F1 là độ lệch giá trị kiểu hình trung bình của F1 so vớigiá trị kiểu hình trung bình của cha mẹ hay của hai quần thể cha mẹ

Trớc hết quan sát hiệu quả u thế lai trên 1 locus với 2 allen A1 và A2 ở 2 quầnthể P1 và P2:

- Sự khác nhau về tần số của 2 allen ở hai quần thể là y (y = p - p = q - q) ’ = q’ - q) ’ = q’ - q).

Do đó p’ = p - y và q’ = q + y

Giá trị kiểu gen A1A1 là +a, kiểu gen A1A2 là d và kiểu gen A2A2 là -a (giảthiết các giá trị này tơng ứng bằng nhau ở hai quần thể và không xét trờng hợp

ức chế của gen)

Trung bình giá trị kiểu gen cha mẹ ở quần thể P1 là MP1 = a(p - q) + 2dpq

và ở quần thể P2 là MP2 = a(p - y - q - y) + 2d(p - y)(q + y)

= a(p - q - 2y) + 2d[(pq + y(p - q) + y2]Trung bình giá trị kiểu gen bố mẹ ở cả hai quần thể là

P

M =

2

1(MP1 + MP2)

= a(p q y) + d[(2pq + y(p q) y– q – y) + d[(2pq + y(p – q) – y – q – y) + d[(2pq + y(p – q) – y – q – y) + d[(2pq + y(p – q) – y – q – y) + d[(2pq + y(p – q) – y 2]Các cá thể quần thể P1 giao phối ngẫu nhiên với quần thể P2 tạo ra F1

p(q + y) q(q + y)A2A2Kiểu gen, tần số kiểu gen và giá trị kiểu gen ở F1

Tần số kiểu gen p(p – y) 2pq + y(p – q) q(q + y)

MP1

(Trung bình kiểu gen F1) a(p – q – y) + d[2pq + y(p-hq)

HF1 = MP1 - M P

(u thế lai ở F1) dy2 = d(p – p’ = q’ - q).)

Nh vậy u thế lai ở F1 phụ thuộc d, p và p’:

- Hiện tợng trội của gen: d = 0 => không có u thế lai; d > a => u thế lai cực đại.Nói khác đi u thế lai cao nhất khi có tơng tác siêu trội

- P = P’: không có u thế lai; P càng lớn hơn p’ u thế lai càng cao

Ưu thế lai ở F2: trung bình kiểu gen ở F2 theo M = a(p – q) + 2 dpq ở F1, tần

1y) + 2d(p -

2

1y)(q +2

1y) = a(p –q –y) + d[2pq +y(p –q) -

Trong thực tiễn, ngời ta thờng lợi dụng u thế lai ở F1 đối với các tính trạng có

hệ số di truyền thấp vì khi đó hệ số di truyền càng thấp thì mức độ biểu hiện uthế lai càng cao [Nguyễn Hải Quân, 2005, tr 135-136]

7.1.2 Chọn giống động vật, thực vật và vi sinh vật

 Chọn giống động vật

 Chọn giống thực vật

 Chọn giống vi sinh vật

7.2 Vài nét về di truyền học ngời

7.2.1 Các đặc điểm và phơng pháp nghiên cứu

7.2.2 Phân tích bộ gen ngời

7.2.3 Di truyền y học

7.2.4 Vấn đề x hội của di truyền họcã

7.3 Kỹ thuật di truyền

7.3.1 Kỹ thuật gen -h genomic

 Tách chiết, thu nhận ADN

Nguyên tắc là thu nhận ADN nguyên vẹn không bị phá hủy bởi cơ học, hóahọc Quy trình gồm các bớc cơ bản sau:

(1) Nghiền nhanh mẫu thành dạng bột mịn trong nitrogen lỏng

(2) Đa vào dd đệm chứa Tris SDS (15 ml), ủ mẫu trong bể ổn nhiệt 650C trong

90 phút, lắc nhẹ

(3) Đa vào 10 ml hỗn dịch chloroform/rs camyl (tỷ lệ 24/1), lắc nhẹ 20 phút

(4) Ly tâm 10.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút; lặp lại ly tâm; thu dịchphía trên

(5) Tủa bằng 15 ml isopropanol (hoặc etanol) 70%; ly tâm 14.000 vòng/phút; lặplại ly tâm; thu ADN đặc

(6) Làm khô trong TE ở 40C qua đêm thu đợc dung dịch chứa ADN tách chiết(mẫu khảo sát)

 Các men giới hạn – enzyme restriction (endonuclease)

 Các nhóm men giới hạn

Men giới hạn gồm 3 nhóm I, II và III; các men giới hạn đ ợc dùng phổ biếnthuộc nhóm II Chúng có cơ chế tác động đơn giản, cắt liên kết phosphatdiestertại vị trí nằm trong chuỗi polynucleotid (gọi là endonuclease)và không phân hủyphân tử ADN; trong khi men giới hạn nhóm I và III cắt và phân hủy phân tử ADNtại vị trí đầu

Điểm cắt Xa vị trí nhận biết(> 1000 bp) Trong điểm nhận biết Ngoài điểm nhận biếtKhả năng metyl hóa

Điều kiện để cắt ATP, Mg++, S-adomet Mg++ hoặc Mn++ Mg++, S-adomet

Số chuỗi của men Khác nhau Giống nhau Khác nhau

Khả năng metyl hóa gốc adenin của nhóm men giới hạn I và III

Gọi tên men giới hạn theo quy định quốc tế:

ợc nhiều hơn và chiều dài ngắn hơn các đoạn ADN so với cắt bởi men nhận biết

đoạn ADN 5 hây 6 …), tạo điều kiện hình thành giống mới, đồng thời lợi dụng bp

- Có hai loại hình dạng “đ ầu bằng “ blunt end “ và “đ ầu so le hay đầu dính “sole cobesive end“ của đoạn cắt đợc tạo ra tùy theo men giới hạn cụ thể Loại

đầub dính có 2 kiểu: kiểu đầu 3 nhô ra và kiểu đaauf 5’ = q’ - q) ’ = q’ - q). nhô ra.

Men giới hạn cắt đầu bằng

Men giới hạn cắt đầu dính 5’

Sử dụng men giới hạn trớc hết để lập bản đồ cắt giới hạn Căn cứ vào trình tựnucleotid của đoạn nhận biết theo từng men và vào sự phân tích trình tự các

đoạn theo ADN chuẩn sẽ suy ra trình tự nucleotid của phân tử ADN khảo sát.Ngoài ra còn sử dụng men giới hạn RE (restriction enzyme) phối hợp với mennối đoạn ADN để gắn các đoạn ADN vào vector (vật tải gen) tạo ADN tái tổ hợp[Chu Hoàng Mậu, 2005, tr 61-66]

 Các vector chuyển gen

Vector chuyển gen là ADN dạng vòng, có khả năng gắn đợc một đoạn ADN

có thể xâm nhập tế bào vật chủ (phần lớn là vi khuẩn) để tạo các bản sao (hệgen tạp - có gắn gen lạ) khác giống hệt vector ban đầu (hệ gen tế bào chủ)

 ứng dụng của vector

- Tạo dòng: Vector gắn với đoạn ADN nhất định (gọi là một dòng) nhằm đểnhân bản đoạn ADN (gắn với vector) xác định

- Sản xuất ARN với số lợng lớn từ ADN đã tạo dòng

- Sản xuất protein với số lợng lớn từ ADN đã tạo dòng

 Đặc tính cần có của một vector

- Độc lập tự sao chép trong tế bào vật chủ

- Có kích thớc càng nhỏ càng tốt

- Phải đợc phát hiện rõ ràng trong tế bào vật chủ (có thật)

- Phải tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ

- Chỉ có mộtk vị trí nhận biết cho men đặc hiệu

 Các loại vector

- Vector tách dòng đợc đa vào tế bào E coli gồm plasmid, Bacteriophage I,

cosmid, Bacteriophage M13, và một số loại vector đặc biệt nh Ti plasmid, YACs,BACs, Retrovirus, Baculovirus, Yeast 2 micron plasmid

- Vector chuyển gen (vector tái tổ hợp) th ờng dùng để chuyển gen vào tế bào

chủ của động vât và thực vật (Eucaryota bậc cao) Các vector tái tổ hợp có thể

đợc đa trực tiếp hoặc gián tiếp qua các sinh vật lây nhiễm của động vật hay thựcvật nh các virus, vi khuẩn, nấm đơn bào

Một số vector có thể dùng cho tế bào động vật, thực vật

Thực vật

Virus (phage)

Gen nhảy Các phần tử p trong ruồi giấm(Drossophila melanogaster)

Plasmid: ADN mạch vòng trong vi

khuẩn Phân biệt hai loại là plasmid

tiếp hợp (tự chuyển sang vi khuẩn khác

trong tiếp hợp nhờ các đoạn đặc thù

“tra – transfer” và mob “mobilising – di

chuyển”), và plasmid không tiếp hợp

(không tự chuyển sang đợc) Các

plasmid tiếp hợp có số bản sao thấp,

kiểm soát chặt chẽ sao chép ADN tái tổ

hợp, sao chép phụ thuộc ADN nhiễm

sắc thể Plasmid không tiếp hợp thờng

sao chép ADN tái tổ hợp thoải mái,

không phụ thuộc sự sao chép ADN

nhiễm sắc thể và tồn tại với số bản sao

cao [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.134]

Các plasmid phổ biến là pBR322,

pAT153 (với p thay cho plasmid và BR

hay AT thay cho tên ngời phân lập hay

thiết kế chúng, các con số dùng để phân loại chủng plasmid)

Phage: Là những thể ăn khuẩn

(chỉ nhân lên bên trong vi khuẩn) do

Max Delbruck nghiên cứu từ những

năm 1940 Phage hoạt động nh

những đoạn ADN ngoài NST vi

khuẩn Có hai loại phage ( và M13)

đợc hoàn thiện tích cực cho mục đích

tách dòng Các vector phage hoạt

động đặc hiệu hơn các plasmid

Chúng có thể chia làm 3 nhóm:

nhóm không đuôi, nhóm có đuôi và

nhóm có lông Khi vào tế bào vi

khuẩn, phage có thể sinh sôi và giết

chết tế bào chủ (trạng thái phage

sinh tan) hoặc nhập vào NST mà

không giết chết tế bào (trạng thái tiềm tan)

Hệ gen của phage λ (48,5 kb) mã cho 46 gen Toàn bộ hệ gen đã đợc giảitrình tự Hai đầu có 2 đoạn ngắn (12 bp) mạch đơn là những đầu dính tạo mạchvòng cho hệ gen sau khi nhiễm vào tế bào vi khuẩn Khi hệ gen vòng phagenhập vào NST tế bào chủ thì hệ gen phage tiềm tan và gọi là prophage (tiền thựcthể)

Hình ảnh phage λ

Hệ gen phage Khi chu trình sinh tan bắt đầu, phage làm chủ tế bào và tạo ra nhiều bản sao

hệ gen phage và các protein cấu trúc Chúng chui ra khỏi tế bào khi tế bào chủ

vỡ tan (sự sống tế bào tan biến) Để xác định số l ợng phage trong dịch tan, phaloãng dịch tan nhiều lần và trộn lẫn với vi khuẩn còn lại rồi cấy lên mặt thạch.Sau khi ủ, vi khuẩn mọc thành thảm Phage có trong thảm làm cho vi khuẩn sinhtan tạo ra các vết tan (plaque) trên thảm Đếm số l ợng vết tan và xác định số l-ợng phage trong dịch tan

Hệ gen phage vào tế bào chủ chuyển sang dạng mạch kép (dạng sao chép

RF “ replication form) Khi sao chép đợc khoảng 1000 bản sao thì rơi vào trạngthái sao chép bất đối xứng (asymetric replication); các bản sao mạch đơn của hệgen phage đợc sinh ra và thoát khỏi tế bào nh các hạt M13 Vi khuẩn lúc đókhông chết (không sinh tan) nhng sinh sản và phân chia chậm hơn so với tế bàokhông bị xâm nhiễm

 Tạo vector tái tổ hợp

 Tạo plasmid tái tổ hơp

Tùy theo ADN tái tổ hợp (ADN, ARN) mà chọn loại vector (plasmid, virus haygen nhảy) phù hợp với mục tiêu (nghiên cứu sự biểu hiện gen, sản xuất proteinhữu ích hay biến đổi cấu trúc di truyền) [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.138]

Quy trình tạo plasmid tái tổ hợpPhỏng theo Nông Văn Hải, 2002)

 Tạo phage tái tổ hợp

Hệ gen phage M13 (6407 bp) không mang các gen không quan trọng (khácphage λ) Vùng gen (nằm giữa hệ gen) dùng để thiết kế một loạt các vector M13mpbằng cách xen một đoạn polinker/lac Z α-peptid vào đó Qua đó có thể sử dụng

hệ thống sàng lọc X-gal để phát hiện các thể tái tổ hợp ví dụ pUC Khi M13 mọctrên thảm vi khuẩn, các vết tan xuất hiện, các tế bào không bị sinh tan nên cóthể lấy ra tiếp tục phân tích

Mô hình tạo phage M13 tái tổ hợpPhỏng theo Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.143

 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ

 Ghép đoạn ADN vào vector

Các vector nhận ADN có kích thớc khác nhau

Plasmid thờng có kích thớc nhỏ không mang đợc ADN có kích thớc lớn (<7kb) Tuy nhiên vector nhân tạo YAC (yeast artifical chromosom) có thể mang

ADN tái tổ hợp đợc đa vào tế bào nhận (thờng là vi khuẩn) Chúng đợc nuôicấy tăng số lợng Để phân lập vi khuẩn chứa vector cần dựa vào dấu hiệu nhậnbiết chúng (vector mang gen chống chịu kháng sinh mọc đ ợc trong môi trờng cókháng sinh), hoặc dựa vào vị trí nằm trong vùng chứa mã di truyền của gen đánhdấu khi ghép ADN lạ làm cho hoạt động của gen này bị thay đổi (nhận biết qua

sự thiếu vắng sản phẩm từ gen đó) Nh vậy dể dàng nhận biết và phân lập tế bàomang vector chứa ADN lạ khỏi những tế bào khác

Khi ADN lạ là vùng mang mã di truyền của một gen (ADNc) đợc đa vào vector có sẵn promotor thì sản phẩm của gen đợc tổng hợp ngay trong tế bào nhận Loại vector này gọi là vector biểu hiện (expession vector); thông thờng vector loại này chứa nhiều promotor tổng hợp m-ARN (promotor nguồn gôc vi khuẩn, virus).

Loại vector biểu hiện – q – y) + d[(2pq + y(p – q) – y expression vector

Ví dụ vector có đoạn nucleotid mã cho protein đánh dấu fusion protein (nh“fusion protein” (nh ” (nh

phát huỳnh quang: GFP = Green Fluoresence Protein) Biểu hiện của gen lạ làkhi đợc ghjép vào vector thì sản phẩm của ADNc (protein) dung hợp với protein

đánh dấu GFP Nhờ sự phát huỳnh quang của GFP mà nhận biết hàm l ợngprotein, sự phân bố và chức năng của mã bởi gen lạ trong tế bào sống

Loại vector chứa gen đánh dấu

Biến nạp (transform) là đa phức ADN-plasmid vào tế bào chủ Trớc tiên các

tế bào chủ (E coli) phải trở nên khả biến (copetent) Muốn vậy cần ngâm tế bàochủ trong dd CaCl2 (lạnh đóng đá) Sau đó trộn nó với các ADN-plasmid rồi ủtrong nớc đá 20-30 phút Cuối cùng tạo sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 420C); làm nhvậy ADN sẽ bị dẫn vào trong tế bào nCác tế bào đã biến nạp đ ợc ủ trong nớcthịt dinh dỡng ở 370C trong 60-90 phút để các plasmid ổn định và biểu hiện tínhtrạng ra kiểu hình (bắt đầu hoạt động) Sau cùng các tế bào đ ợc đa vào môi tr-ờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid Tuy rất hạn chế nh ng với 1 μgADN có thể tạo ra 106-107 tế bào biến nạp

Lây nhiễm tơng tự nh biến nạp, nhng không phải đa ADN-plasmid mà đaADN-phage vào tế bào chủ

7.3.2 Chọn lọc tạo dòng và sự biểu hiện của gen

7.3.3 Phản ứng chuỗi tổng hợp ADN “fusion protein” (nhPCR” (nh (polymerase chain reaction)

 Nội dung chuỗi phản ứng PCR

Phơng pháp nhân đoạn ADN hàng tỷ lần mà không cần tế bào vi khuẩn (khitrình tự hai đầu đoạn ADN đó đã biết)

Phơng pháp PCR chỉ sử dụng ADN-polymerase và các mồi (primer) là các

đoạn oligonucleotid nhân tạo

Các bớc cơ bản của kỹ thuật PCR:

- Bớc 1: xử lý nhiệt sợi khuôn thành các sợi đơn

- Bớc 2: ghép mồi vào từng sợi đơn khi giảm nhiệt độ (nồng độ mồi lớn ngăncản phục hồi sợi kép ADN)