DI TRUYỀN PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH,CHẨN ĐOÁN, PHÂN LOẠI, PHẢ HỆ, DỊCH TỄ HỌC VÀ DI TRUYỀN QUẦN THỂ KÝ SINH TRÙNG docx

DI TRUYỀN PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH, CHẨN ĐOÁN, PHÂN LOẠI, PHẢ HỆ, DỊCH TỄ HỌC VÀ DI TRUYỀN QUẦN THỂ KÝ SINH TRÙNG MỞ ĐẦU Tất cả mọi đặc tính sinh học của một cá thể đều được q

DI TRUYỀN PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH,

CHẨN ĐOÁN, PHÂN LOẠI, PHẢ HỆ, DỊCH TỄ HỌC

VÀ DI TRUYỀN QUẦN THỂ KÝ SINH TRÙNG

MỞ ĐẦU

Tất cả mọi đặc tính sinh học của một cá thể đều được quyết định bởi hệ gen của chúng Hệ gen ở động vật là một tập hợp của các chuỗi nucleotide phân bố trong các phân đoạn dài ngắn khác nhau gọi là nhiễm sắc thể (đối với hệ gen cá thể bậc cao), hoặc là một vòng acid deoxyribonucleic (ADN) khép kín (đối với hệ gen cá thể bậc thấp) Tính chính xác khi so sánh cấu trúc trật tự nucleotide của gen

và hệ gen các cá thể khác nhau cho phép có được sự phân biệt chính xác các đặc tính di truyền học của cá thể và quần thể, bất luận, sản phẩm gen của chúng có thể

bị ảnh hưởng tương tác của môi trường và đồng loại Ngày nay khảo sát và phân tích cấu trúc gen và hệ gen của cá thể để so sánh, hay còn gọi là khai thác chỉ thị di truyền phân tử ADN (DNA genetic markers) được coi là phương pháp tối ưu trong nghiên cứu sinh vật nói chung và ký sinh trùng (KST) nói riêng, đặt ra một hướng mới: hướng giám định, chẩn đoán, phân loại, nghiên cứu phả hệ tiến hoá, dịch tễ học và di truyền quần thể bằng phương pháp sinh học phân tử(1),(2),(3),(4)

Phương pháp khai thác chỉ thị phân tử ADN cho kết quả có độ nhạy và tính chính xác cao, đặc biệt trong chẩn đoán phát hiện biến chủng, thậm chí trong các

cá thể đồng chủng, ngay cả khi vùng ADN nghiên cứu không cho sản phẩm gen (non-coding region), hoặc ADN ở vùng giao gen, hay cả khi một số gen ở trạng thái câm lặng (silent genes) Phương pháp ADN còn bao quát cả phương pháp protein, đơn giản, vì khi cấu trúc gen trong chuỗi nucleotide đã được xác định, thì cấu trúc protein cũng dễ dàng phân tích để đánh giá và so sánh chức năng Sự phát triển của kỹ thuật máy tính điện tử (computer) đã tạo dựng công cụ tin-sinh học (bioinformatics) đa dạng và đa năng, cho phép ứng dụng phương pháp phân tích ADN một cách hiệu quả và rộng rãi Tuy phương pháp chỉ thị phân tử đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, tốn kém và cần các nhân viên kỹ thuật có trình độ cao, nhưng kết quả phân tích hết sức đặc hiệu và chính xác(5,12)

CHỈ THI DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA HỆ GEN

Hệ gen ty thể và chỉ thị chọn lọc

Ty thể (mitochondrion) là một bộ phận của tế bào, chứa một hệ gen riêng gồm các gen tham gia quá trình ôxy hoá-khử, giải phóng năng lượng cho tế bào hoạt động Hệ gen ty thể khoảng 13-25 nghìn nucleotide, chứa 12 gen (đối với sán, trematode và cestode; và giun, nematode) hoặc 13 gen (đối với động vật bậc cao)

mã hoá cho sản phẩm protein(4),(6),(7),(10),(11) Ngoài ra còn có 2 gen ARN ribosome,

22 gen của ARN vận chuyển, một vùng không mã hoá (non-coding region) và một

số tiểu phần khác (Hình 1) Trong một tế bào sinh vật có khoảng 200-300 ty thể hoạt động Hiện nay đã có hàng trăm loài có hệ gen ty thể đã được giải mã và phân tích đầy đủ, hàng nghìn loài đã có hệ gen ty thể được giải mã một phần, cung cấp nguyên liệu chuỗi nucleotide và axit amin cho so sánh giám định các loài cần nghiên cứu Do có kích thước nhỏ, lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong

hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể Các gen trong ty thể lại có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân tế bào 10-15 lần, nên rất thuận lợi cho nghiên cứu về tiến hoá Các gen của ty thể trong cùng chủng, cùng loài, thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao,

do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại

Nghiên cứu hệ gen ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều trị

và phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan đến sự biến đổi ở ty thể Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể, còn có giá trị định hướng trong phòng chống, đặc biệt tìm kiếm hoá chất, hoá dược, hoặc thực nghiệm các loại vacxin thế hệ mới Đã có nhiều hệ gen ty thể của các loại KST

như giun đũa (Ascaris suum), giun chỉ (Onchocerca volvulus), sán máng

(Schistosoma mansoni, S japonicum, S mekongi, S haematobium), sán dây

(Taenia solium, T asiatica, T crasiceps ), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F

gigantica), sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), sán lá ruột

(Fasciolopsis buski) đã được giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ liệu cần

thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký sinh trùng(9),(10),(11)

Vậy những chỉ thị nào của hệ gen ty thể là đối tượng được chọn nghiên

cứu? Thông thường, gen cox1, nad1, cob là những gen có giá trị được chọn trong giám định và định loại các loài có họ hàng gần gũi; các gen nad3, 16S (rrnL), 12S (rrnS), vùng không mã hoá (NR, non-coding region) được chọn trong phân loại và

so sánh biến đổi gen của các loài họ hàng xa (Hình 1) Các gen ty thể là các cấu trúc di truyền đại diện dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài có khả năng lai hay trong vùng tạp lai ngoại loài (inter-specific hybridization), nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2), vì gen nhân đại diện di truyền dòng bố Từ

đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay theo mĐ

Hình 1 Hệ gen ty thể (A) có các chỉ thị phân tử thường sử dụng (vạch bên

dưới các gen) và sơ đồ cấu trúc tổ hợp ADN ribosome (B) của hệ gen nhân cung cấp chỉ thị 18S và ITS-2 với các mồi thực hiện PCR

Hệ gen nhân tế bào và hướng nghiên cứu một phần hay toàn bộ hệ gen

Trong một tế bào của cơ thể, song song tồn tại 2 hệ gen bao gồm hệ gen nhân tế bào (nuclear genome) và hệ gen ty thể (mitochondrial genome, đối với động vật) hoặc lạp thể (chloroplast, đối với thực vật) Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng, hoạt động có tính chất vừa độc lập, vừa tương tác, và dĩ nhiên hệ gen ty-lạp thể chịu ảnh hưởng điều hoà của hệ gen nhân tế bào

Hệ gen nhân tế bào bao gồm hàng chục triệu đến hàng trăm triệu nucleotide Hệ gen nhân tế bào được phân bố trong các đơn vị sinh học gọi là nhiễm sắc thể (NST) Số lượng NST trong mỗi một loài có khác nhau Các gen được phân bố tập trung trong các vùng riêng biệt gọi là các vùng mã hoá (coding region), phần lớn vùng còn lại không chứa cấu trúc gen, gọi là vùng không mã hoá (non-coding region) Rất khó thực hiện phản ứng PCR ở các vùng này do chúng chứa nhiều cấu trúc lặp hoặc ở những vùng có tỷ lệ nucleotit A +T hay G+C thường lấn át nhau, có nơi tỷ lệ A +T hay G+C đạt 90% hay ngược lại Hơn nữa,

do không chính xác về trật tự nucleotide nên rất khó tổng hợp các primer đặc hiệu cho phản ứng PCR Sản phẩm PCR của các vùng ADN này thường chất lượng không cao

Hệ gen nhân tế bào có hệ số đột biến không cao hơn hệ gen ty thể Tuy nhiên, bất kỳ sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gen có tính chất đặc trưng của loài Về phân loại mà nói, nếu chỉ chọn 1 hay vài gen để phân tích, sẽ không cho kết quả của tiến trình tiến hoá, vì trong 1 loài các gen cơ bản có chiều hướng bảo tồn rất cao Do vậy phân tích gen bảo tồn trong hệ gen của nhân chỉ có giá trị trong giám định, mà ít có giá trị trong phân loại

Mặt khác, các vùng có cấu trúc lặp, hay những vùng có hệ số biến thái cao trong hệ gen nhân là đối tượng phân tích để phân loại Các phương pháp SHPT đã trình bày (RFLP, RFLP-PCR, RAPD ) là phương tiện dễ dàng phát hiện những vùng đặc biệt như thế này Khi biết được cấu trúc của 1 phân đoạn ADN biến thái

ở cá thể này, bằng các phương pháp trên, kết hợp với các phương pháp lai phóng

xạ, rất dễ dàng phát hiện vùng tương tự ở các cá thể khác

Sự biến đổi di truyền trong hệ gen nhân tế bào thường xảy ra ở dạng chuyển vị (transposition) đối với cơ thể đơn bào hoặc sinh vật “tự sản” (self-reproducing) Đối với cơ thể đa bào hoặc sinh vật sinh sản hữu tính, sự biến đổi hệ gen thường xảy ra ở dạng tái tổ hợp (recombination) Còn các dạng biến đổi nucleotide (đột biến điểm, nhân lên hay biến mất của 1 dãy nucleotide ) xảy ra ở

cả hai loại cơ thể sinh vật nói trên

Chỉ thị phân tử ở hệ gen nhân tế bào

Trong hệ gen nhân tế bào, có một tổ hợp gen quan trọng gọi là tổ hợp ADN

ribosome (ADNr), bao gồm các khung gen do 18S-ITS1-5,8S-ITS2-28S hợp

thành Mỗi một hệ gen có nhiều khung gen nối tiếp nhau Bất kỳ gen ribosome nào (18S, 5,8S, 28S) hay vùng giao gen (ITS-1, ITS-2) đều được sử dụng trong phân tích phân loại

Hình 1 mô tả toàn bộ cấu trúc tổ hợp ADN ribosome (nuclear ribosomal operon) Các tổ hợp ADN ribosome sắp xếp nối tiếp nhau và cách nhau bằng một

vùng giao tổ hợp IGS (inter-genic spacer) Có khoảng 100 tổ hợp ADNr ở loài sán

máng (S mansoni)(11) và sán phổi (P ohirai) Trong hệ gen nhân của sán lá gan nhỏ (Opisthorchis viverrini)(15), ADNr chiếm đến 6,1% thành phần ADN của hệ

gen Vùng đầu 5’ của gen 18S có định vị một chuỗi ADN ngoại tổ hợp gọi là vùng

ngoại gen ETS (external transcribed spacer)

Giữa gen 18S và 5, 8S là vùng giao gen ITS-1 (internal transcribed spacer 1) có độ dài khoảng 300-600 bp; và giữa gen 5, 8S và 28S là vùng giao gen ITS -2

(internal transcribed spacer 2) có độ dài tương đương khoảng 300-500 bp Độ dài

ITS-1 và ITS-2 ở một số loài đã được xác định, như ở sán lá gan F hepatica có ITS-1 là 433 bp, ITS-2 là 362 bp; ở loài sán máng S mansoni, ITS-1 là 456 bp và

ITS-2 là 309 bp ITS-1 và ITS-2 có thể chứa các cấu trúc lặp ngắn (mini-satellite)

có giá trị rất lớn trong định loại (genotyping) Độ dài của gen 18S vào khoảng 1,9-2,0 kb, của gen 5,8S khoảng 150 bp và của gen 28S là khoảng 3,5-4,1 kb Khoảng cách giữa các tổ hợp ribosome (ADNr) rất dao động ở các loài, từ 2 kb đến 5-9 kb,

có khi vượt quá 10 kb

ITS-1 và ITS-2 có mức độ biến đổi ngoại loài rất cao, khó có thể sử dụng

để so sánh phân tích các loài khác giống, nhưng chúng lại là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu phả hệ nguồn gốc các chủng trong cùng loài hoặc cùng giống, đặc biệt về hiện tượng lai nội và ngoại loài ITS-2 đại diện phả hệ dòng bố (paternality), nếu được phân tích cùng với một số chỉ thị hệ gen ty thể đại diện dòng mẹ (maternality) thì việc lai ngoại loài có điều kiện xác định chính xác nguồn gốc dòng lai

Dựa trên nhóm gen trong tổ hợp ADN ribosome này, một số loài KST được

phân loại và phân tích phả hệ có tính chính xác cao như: Toxoplasma gondii,

ostertagi, Trichinella spinalis, Schistosoma mansoni và một số trong các loài Trypanosoma, Euglena Đặc biệt gần đây, căn cứ dữ liệu thu được về chỉ thị ty thể

và ITS-2, hiện tượng lai tự nhiên ngoại loài trong tiến hoá của Schistosoma spp(11),

Fasciola spp (giữa F hepatica và F gigantica) đã được phát hiện Tại Việt Nam,

Lê Thanh Hoà và cs (2007) đã xác định chính thức lai dòng bố F hepatica và dòng mẹ F gigantica trong quần thể Fasciola spp gây bệnh trên người và động

vật(10)

CÁC HƯỚNG THIẾT YẾU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU KÝ SINH TRÙNG

Hướng sử dụng trực tiếp một phân đoạn ADN trong hệ gen

Đó là việc phân tích và sử dụng trật tự nucleotide của một hay một vài phân đoạn ADN trong hệ gen, bất luận chuỗi nucleotide đó có thể là một phần nằm trong một cấu trúc gen (coding region) hay nằm ngoài cấu trúc gen (non-coding region) của hệ gen nhân hay ty thể Như vậy trong hướng này, chỉ cần xem xét trật

tự nucleotide của vùng ADN làm đối tượng, mà không cần thiết tìm hiểu chức năng cấu trúc của nó Do vậy, cơ sở của hướng sử dụng trực tiếp phân đoạn ADN trong hệ gen là cần phải có toàn bộ trật tự nucleotide của nhiều cá thể trong 1

chủng, nhiều chủng trong 1 loài và nhiều loài khác nhau trong quần thể có quan hệ đồng tiến hoá

Bằng các chương trình máy tính chuyên biệt (ngày nay trong khoa học tin học, đã xuất hiện thêm 1 ngành mới xử lý thông tin sinh học, đó là ngành tin -sinh học, gọi là Bioinformatics), các dữ liệu về thành phần nucleotide được so sánh và thu nhận kết quả về mức độ đồng nhất (homology) và mức độ tương ứng (similarity), đối chiếu với các dữ liệu lưu trữ trong Ngân hàng gen (GENBANK), hoặc các Trung tâm lưu trữ số liệu khác Trên cơ sở này, đặc tính gần (proximity)

và đặc tính xa (distance), cũng như hệ số song chiếu (pairwise identity) được tính toán và phân tích để có hệ số tiến hoá gần và xa của loài nhằm sử dụng để thiết lập phả hệ tiến hoá của quần thể

Vì phân đoạn ADN lấy làm nghiên cứu có tính xác suất, tuỳ hứng, nên có thể sau khi phân tích số liệu về một số đặc tính, kết quả có thể bị rối (noisy) không phù hợp sử dụng Do vậy, để được chính xác và hiệu quả, cần có sự chọn lọc trước từng vùng cơ bản trong hệ gen để khảo sát và phân tích Những vùng đó, thông thường là những vùng ADN có vai trò nhất định trong quan hệ sinh học nội và ngoại loài

Hướng sử dụng một phần hay toàn phần cấu trúc của một gen

Hệ gen của một sinh vật, dù là bậc thấp hay bậc cao, vẫn là tập hợp chứa hàng nghìn đến hàng trăm nghìn cấu trúc gen khác nhau Trong vô vàn các cấu

trúc gen đó, chỉ có khoảng 30-40% gen ở trạng thái hoạt động, số còn lại ở trong trạng thái bị kìm hãm hoặc hoàn toàn câm lặng

Về nguyên tắc, các cá thể cùng 1 chủng thuộc 1 loài, bao giờ cũng có một

số lượng ít hay nhiều, thậm chí có khi gần 100% số gen có cấu trúc giống nhau Sự sai khác, nếu có, đó là sự biến đổi ở mức độ phân tử, và phải qua phân tích ở mức

độ phân tử mới xác định được Sự sai khác phân tử chính là các đột biến xuất hiện trong chuỗi gen của hệ gen, bao gồm đột biến điểm (point-mutation), sự xoá đi hay thêm vào của ADN có thể đó là các bộ mã nucleotide (insertion and deletion), sự biến mất hay nhân lên của các chuỗi nucleotide lặp (satellite), sự đảo gen (invertion), sự chuyển gen (translocation) v.v Sự sai khác này ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau, biểu thị tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử và đó chính là đích khai thác của việc nghiên cứu, giám định và phân loại KST bằng phương pháp SHPT(8)

Hiện nay, một gen hay một phần gen nào đó sau khi được chọn làm đối tượng nghiên cứu, sẽ được nhân lên bằng kỹ thuật PCR, rồi từ đó phân tích trật tự nucleotide

và so sánh trật tự chuỗi gen Các sản phẩm PCR chứa các phân đoạn ADN của gen được tinh sạch để trực tiếp phân tích hoặc được dòng hoá (cloning) vào các vectơ dẫn truyền (cloning vector) để tiếp tục nghiên cứu Nếu đó là gen quan trọng của cá thể,

để nghiên cứu chức năng hoặc thu sản phẩm, gen đó có thể được dòng hoá vào các vectơ biểu hiện protein (expression vector)