Nghiên Cứu Một Số Đặc Điểm Di Truyền Phân Tử Của Các Chủng Neisseria Meningitidis Khu Vực Miền Bắc Giai Đoạn 2017 – 2020.Pdf

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Hoàng Thị Ngọc Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Neisseria meningitidis KHU VỰC MIỀN BẮC GI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Thị Ngọc Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA

CÁC CHỦNG Neisseria meningitidis KHU VỰC MIỀN BẮC

GIAI ĐOẠN 2017 – 2020

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Thị Ngọc Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA

CÁC CHỦNG Neisseria meningitidis KHU VỰC MIỀN BẮC

GIAI ĐOẠN 2017 – 2020

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Thượng tá, TS Võ Viết Cường PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – 2022

LỜI CẢM ƠN

Luận văn thạc sĩ này được thực hiện tại Phòng Độc học và Các bệnh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga - Bộ Quốc Phòng Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ để hoàn thành nghiên cứu này

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Thượng tá, TS

Võ Viết Cường – người thầy đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy đã luôn tạo mọi điều kiện, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Thị Lan Anh - người chị đáng kính đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn trực tiếp, truyền đạt nhiều kiến thức quý báu cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô thuộc Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử nói riêng và Khoa Sinh học nói chung vì đã dạy cho tôi những kiến thức nền tảng quan trọng trong quá trình học tập tại Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh, chị, em ở Phòng thí nghiệm Độc học và Các bệnh nhiệt đới vì đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc vừa qua

Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài Nghiên cứu Ứng dụng và Phát triển Công nghệ cấp Quốc gia: “Nghiên cứu khai thác và phát triển

nguồn gen vi khuẩn Neisseria meningitidis gây bệnh nhiễm não mô cầu” mã số

NVQG-2019/ĐT.02 do Thượng tá, TS Võ Viết Cường làm Chủ nhiệm

Học viên cao học

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan não mô cầu 3

1.1.1 Lịch sử 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học Neisseria meningitidis 3

1.2 Dịch tễ học 7

1.2.1 Dịch tễ học nhiễm não mô cầu 7

1.2.2 Dịch tễ học phân tử Neisseria meningitidis 13

1.3 Chẩn đoán 16

1.3.1 Chẩn đoán ca bệnh lâm sàng 16

1.3.2 Chẩn đoán xác định ca bệnh 17

1.3.3 Đáp ứng miễn dịch 21

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2.1 Thiết bị 22

2.2.2 Hoá chất, sinh phẩm 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Tách chiết DNA 23

2.3.2 Xác định nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật multiplex-PCR 24

2.3.3 Phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen MLST 25

2.3.4 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen kháng nguyên mã hoá protein màng ngoài PorA và PorB 27

2.3.5 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 28

2.3.6 Tinh sạch sản phẩm PCR 28

2.3.7 Giải trình tự gen các sản phẩm PCR 29

2.3.8 Phân tích dữ liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả xác định cơ cấu nhóm huyết thanh N meningitidis bằng kỹ thuật multiplex-PCR 31

3.2 Xác định trình tự vùng VR1, VR2 và cơ cấu phân týp huyết thanh N meningitidis dựa trên gen porA 34

3.2.1 Khuếch đại, xác định trình tự vùng VR1, VR2 gen porA 34

3.2.2 Xác định cơ cấu phân týp huyết thanh N meningitidis 37

3.3 Xác định trình tự vùng VR1 – VR4 và cơ cấu týp huyết thanh N meningitidis dựa trên gen porB 41

3.3.1 Kết quả khuếch đại, xác định trình tự vùng VR1 – VR4 của gen porB 41

3.3.2 Xác định cơ cấu týp huyết thanh N meningitidis 45

3.4 Phân tích tính đa hình di truyền thông qua xác định kiểu trình tự (MLST) của các chủng N meningitidis 47

3.4.1 Kết quả khuếch đại 7 đoạn gen quản gia (house keeping) 47

3.4.2 Xác định kiểu trình tự (MLST) của các chủng N meningitidis 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh

N meningitidis Neisseria meningitidis

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 (A) N meningitidis dưới kính hiển vi điện tử, (B) Khuẩn lạc trên môi

trường thạch máu, (C) Khuẩn lạc trên môi trường thạch Chocolate 4

Hình 1.2 Cấu trúc màng ngoài tế bào của não mô cầu 5

Hình 1.3 Phân bố các nhóm huyết thanh gây bệnh não mô cầu trên toàn thế giới 10

Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm NMC các khu vực khác nhau trên thế giới 11

Hình 1.5 Sơ đồ phân bố các đoạn gen khếch đại trên Chromosomal của chủng Neisseria meningitidis Z2491, subgroup IV-1 16

Hình 1.6 N meningitidis nhuộm Gram (-) từ dịch não tủy 18

Hình 1.7 N meningitidis mọc trên thanh định danh API NH 18

Hình 1.8 Bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N meningitidis 19

Hình 1.9 Bản đồ gene capsule (CPS) của N meningitidis……… 20

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện nhóm huyết thanh B 31

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện nhóm huyết thanh C 32

Hình 3.3 Cơ cấu nhóm huyết thanh Neisseria meningitidis 32

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen porA 35

Hình 3.5 Tín hiệu trình tự ghép giữa mồi F và R trên vùng gen porA 35

Hình 3.6 Phân týp huyết thanh VR1 trên gen porA 38

Hình 3.7 Phân týp huyết thanh VR2 trên gen porA 38

Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen porB 42

Hình 3.9 Cơ cấu týp huyết thanh trên các vùng VR1 – VR4 gen porB 46

Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 7 gen quản gia N meningitidis 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách chủng Neisseria meningtidis (2017-2020) 22

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi xác định nhóm huyết thanh 24

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 25

Bảng 2.4 Trình tự các cặp mồi khuếch đại các đoạn gen MLST 26

Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi khuếch đại các đoạn gen kháng nguyên mã hoá protein màng ngoài PorA và PorB 27

Bảng 2.6 Trình tự mồi giải trình tự DNA 29

Bảng 3.1 Kết quả xác định các phân týp huyết thanh N meningitidis trên porA 35

Bảng 3.2 Cơ cấu phân týp huyết thanh N meningitidis 39

Bảng 3.3 Kết quả xác định týp VR1 – VR4 gen porB 43

Bảng 3.4 Kích thước băng và nhiệt độ gắn mồi của 7 gen MLST 47

Bảng 3.5 Kiểu trình tự ST các chủng N meningitidis 50

MỞ ĐẦU

Bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi não mô cầu Neisseria meningitidis là một bệnh

truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, gây dịch Bệnh có các thể lâm sàng: viêm màng não mủ, nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, viêm màng ngoài tim, … trong đó viêm màng não mủ và nhiễm khuẩn huyết là thường gặp hơn Não mô cầu (NMC)

cư trú tại vùng hầu họng của người và lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nhỏ dịch tiết mũi họng bị nhiễm Bệnh thường để lại nhiều di chứng nặng nề như chậm phát triển tinh thần, điếc, liệt với tỷ lệ từ 10-20%, tỷ lệ tử vong có thể từ 8-15% Tỷ lệ người mang mầm bệnh không triệu chứng chiếm khoảng 5-10% trong cộng đồng và 20-25% ở lứa tuổi trưởng thành [28,29] Ở Việt Nam, NMC có khả năng gây ra các vụ dịch nhỏ và các ca bệnh rải rác khắp các tỉnh trên cả nước, nguy

cơ dịch lây lan ra cộng đồng là rất lớn

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên ngoài màng của N meningitidis, đã xác định

được 13 nhóm huyết thanh (serogroup) khác nhau (bao gồm A, B, C, D, 29-E, H, I,

K, L, W135, X, Y và Z), trong đó 90% các ca bệnh trên thế giới tập trung vào các nhóm huyết thanh A, B, C, Y và W135 - đây là 5 nhóm chủ yếu gây viêm màng não

và nhiễm trùng huyết [29] Hiện nay đã có vắc xin tái tổ hợp phòng ngừa NMC nhóm huyết thanh A, C, W135 và Y Vắc xin nhóm B cũng đã được nghiên cứu sản xuất, tuy nhiên vắc xin kháng lại NMC nhóm B có tính sinh miễn dịch kém Một

trong những giả thuyết cho điều này có thể là do cấu trúc của N meningitidis nhóm

B tương đồng với axit polysialic trên tế bào thần kinh của con người Chính vì vậy, hiểu rõ về cấu trúc gen và các protein màng ngoài PorA, PorB… giúp cho việc nghiên cứu và chế tạo vắc xin hiệu quả hơn Ngoài ra, phương pháp định type bằng trình tự đa locus (Multilocus sequence typing – MLST) được xem là tiêu chuẩn vàng để giám sát dịch tễ phân tử não mô cầu trong phạm vi quốc gia và quốc tế

Hiện nay các bệnh viện tuyến Trung ương – Bộ Y tế đã triển khai kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán NMC, tuy nhiên việc sử dụng các sinh phẩm xét nghiệm của nước ngoài với giá thành cao và hạn sử dụng ngắn đang là hạn chế của

kỹ thuật này đối với các bệnh viện tuyến dưới Bên cạnh đó, các nghiên cứu xác định đặc điểm dịch tễ phân tử (genotype (týp huyết thanh); genosubtype (phân týp huyết thanh); dòng; so sánh trình tự gen, trình tự axit amin suy diễn…) của các

chủng N meningitidis ở Việt Nam với cơ sở dữ liệu trên thế giới chưa được tiến

hành nhiều Việc cung cấp dữ liệu các đặc điểm dịch tễ phân tử có ý nghĩa quan trọng trong việc giám sát NMC, đặc biệt là các dòng xâm lấn; tiên lượng nguy cơ xảy ra dịch và làm cơ sở cho việc nghiên cứu vắc xin dự phòng, góp phần nâng cao chất lượng công tác phòng dịch bệnh não mô cầu, giảm thiểu tử vong và những di chứng nặng nề do bệnh gây ra, đảm bảo sức khoẻ cho cộng đồng Xuất phát từ cơ

sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên

cứu một số đặc điểm di truyền phân tử của các chủng Neisseria meningitidis khu vực miền Bắc giai đoạn 2017 – 2020 ” với mục tiêu:

- Xác định týp và phân týp huyết thanh các chủng Neisseria meningitidis được

phân lập bằng phương pháp giải trình tự gen Nhằm: (1) đánh giá độ đa hình của các

vùng biến đổi VRs của gen porA và porB; (2) so sánh đa hình gen porA của các

chủng Việt Nam với các chủng trên thế giới

- Xác định dòng Neisseria meningitidis sử dụng phương pháp định type bằng

trình tự đa locus (MLST), trên cơ sở đó so sánh dòng NMC phân lập được ở Việt Nam với các chủng trên thế giới

Việc thực hiện đề tài là cơ sở giúp cung cấp một công cụ giám sát dịch tễ học NMC, tiên lượng dự báo nguy cơ bùng phát dịch, phân vùng dịch tễ học theo khu vực và mục tiêu xa hơn trong tương lai là đề xuất một chiến lược dự phòng bằng vắc xin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan não mô cầu

1.1.1 Lịch sử

Viêm màng não do Neisseria meningitidis đã được ghi nhận lần đầu tiên từ

thế kỳ thứ II trước công nguyên Nhưng đến tận năm 1805, bệnh mới được Gaspard Vieusseux mô tả từ vụ dịch viêm màng não ở Geneve Đến năm 1884, Ettore Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở dịch não tuỷ Sau đó, năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn gây

bệnh từ dịch não tủy của bệnh nhân và mô tả với tên: Diplococcus intracellularis meningitidis Năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành Neisseria meningitidis để

ghi công Albert Neisser [40,36]

1.1.2 Đặc điểm sinh học Neisseria meningitidis

1.1.2.1 Hình thái

N meningitidis là cầu khuẩn Gram âm, hiếu khí, kích thước thay đổi, có thể

thấy ở dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau, kích thước khoảng 0,8 - 1µm, đứng riêng rẽ từng đôi một hoặc nhiều đôi tụ thành đám và có thể nằm trong hoặc ngoài bạch cầu đa nhân, hoạt tính oxidase dương tính, oxi hóa glucose và maltose, không sử dụng sucrose và lactose Trên tiêu bản nhuộm vi khuẩn thu từ môi trường nuôi cấy, NMC thường có kích thước đa dạng, to nhỏ khác nhau và cách sắp xếp không điển hình Vi khuẩn ở trong bệnh phẩm dịch não tủy thường có vỏ, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (-) [46,55]

1.1.2.2 Tính chất nuôi cấy

N meningitidis là loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chỉ phát triển tốt ở môi trường

giàu chất dinh dưỡng như thạch máu, thạch chocolate và khí trường có bổ sung 5 - 10% CO2, với nhiệt độ 37°C Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tròn, nhẵn, lồi, óng ánh và có màu hơi xám Sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính khoảng

1 mm, không tan máu, khuẩn lạc có màu xám đục nếu để trong thời gian dài Trên

môi trường thạch chocolate, khuẩn lạc có dạng S, xám đục và óng ánh [47,56]

Hình 1.1 (A) N meningitidis dưới kính hiển vi điện tử, (B) Khuẩn lạc trên môi

trường thạch máu, (C) Khuẩn lạc trên môi trường thạch Chocolate [38]

1.1.2.3 Sức đề kháng

Tế bào vi khuẩn N meningitidis có sức đề kháng yếu: chỉ sống được trong bệnh

phẩm dịch não tuỷ 3 - 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể Bị tiêu diệt ngay dưới tia cực tím, dung dịch chloramin 0,5 - 1% hoặc cồn 70°, ở nhiệt độ 55°C trong 30 phút hoặc 60°Ctrong 10 phút, vi khuẩn không chịu được điều kiện khô và ánh sáng Các thuốc sát trùng thông thường dễ tiêu diệt NMC, ngoài ra vi khuẩn dễ bị chết do men tự ly giải [59]

1.1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên Neisseria meningitidis

Ở N meningitidis cấu trúc bao gồm màng ngoài (OM), lớp Peptidoglycan và màng trong và tế bào chất Trong đó, cấu trúc kháng nguyên của N meningitidis

bao gồm: Lớp polysaccharide, Lipo-oligosaccharide (LOS), protein màng ngoài: PorA, PorB và một số protein khác (Hình 1.2) [48]

Lớp polysaccharide (PS) nang: chứa các kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo

kháng thể bảo vệ (ngoại trừ nhóm B) N meningitidis được phân chia thành các týp

huyết thanh trên cơ sở cấu trúc hóa học và dạng liên kết của các đơn vị saccharide cấu thành nên vỏ polysaccharide trên bề mặt vi khuẩn Căn cứ vào tính không đồng nhất về cấu trúc và tính kháng nguyên của lớp PS người ta đã chia được 13 nhóm huyết thanh bao gồm: (A, B, C, D, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y và Z), trong đó 5 nhóm huyết thanh chủ yếu gây viêm màng não và nhiễm trùng huyết là A, B, C, Y

và W-135 Chỉ một sự khác nhau nhỏ trong cấu trúc nhưng sẽ dẫn đến các đặc tính miễn dịch có sự khác biệt một cách rõ ràng Nhóm huyết thanh A chứa N-acetyl-mannosamine-1-phosphate, trong khi đó nhóm huyết thanh B, C, Y, W-135 được cấu tạo từ các dẫn xuất của axit sialic - chất đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại

và độc tính Lớp PS vỏ của NMC nhóm huyết thanh B và C bao gồm homopolymer của axit N-acetylneuraminic (Neu5C) liên kết với axit α-2,8 và α-2,9 Cấu trúc α-2,9 là kháng nguyên mạnh đối với cơ thể và sinh ra kháng thể bảo vệ còn α-2,8 có tính kháng nguyên rất yếu [8,33]

Hình 1.2 Cấu trúc màng ngoài tế bào của N meningitidis [51]

Lớp lipo-oligosaccharide (LOS) – Endotoxin: cấu tạo của LOS gồm 1 glycolipid màng ngoài nhưng thiếu các chuỗi O đặc trưng và hình thái “xù xì” (ráp), bao gồm 3 thành phần chính: opligosaccharide nhân; lipid A kỵ nước (thành phần gây độc) và một chuỗi oligosaccharide nhánh có thể thay đổi (thành phần tạo miễn dịch) Gen glycosyltranspherase (lgt) trên nhiễm sắc thể người đảm nhiệm việc sinh tổng hợp của các chuỗi oligosaccharide khác nhau, 4 glycosyltranspherase (lgtA, lgtC, lgtD và lgtG) sử dụng để phân loại các chủng thành 12 nhóm miễn dịch khác

nhau theo thứ tự L1 - L12 [25, 37] Nhóm miễn dịch L1 - L8 liên quan đến sự chi phối đầu tiên tới NMC nhóm huyết thanh B và C, trong khi đó nhóm miễn dịch L9 - L12 liên quan đến các chủng NMC nhóm huyết thanh A Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như PS của vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A [48]

Lớp Protein của màng ngoài (OMP) của N meningitidis: Đặc hiệu cho týp

huyết thanh và phân týp huyết thanh Màng ngoài NMC bao gồm: protein lớp 1 (PorA), lớ p 2 hoă ̣c lớp 3 (PorB) với chức năng cho phép các chất dinh dưỡng đi vào

và một số protein khác như: protein gắn yếu tố H (factor H binding protein - fHbp), protein A vận chuyển sắt (Ferric enterobactin transport protein A - FetA), protein kết dính A (Neisserial adhesin A - NadA) Gần như toàn bộ các chủng NMC (>

80%) đểu biểu hiện protein bề mặt thuộc nhóm OMP1, mã hoá bởi gen porA và một trong hai protein bề mặt nhóm 2 hoặc 3 lần lượt được mã hoá bởi gen porB2 hoặc porB3 Týp huyết thanh được xác định bởi sự thay đổi của protein PorB; phân týp

huyết thanh xác định bởi sự thay đổi của protein PorA [42] Hầu hết độ lớn các

kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt tế bào NMC và độ lớn kháng nguyên giữa các

chủng là khác nhau, nên N meningitidis được phân chia trên 20 týp và phân týp

khác nhau, chủ yếu ở nhóm B, C Nhiều chủng phân lập không thể phân loại được týp hay phân týp nào bằng kháng thể đơn dòng hiện tại

Protein PorA có kích thước khoảng 1179 bp mã hoá cho protein màng ngoài

lớp 1 với trọng lượng phân tử khoảng 44 kDa Gen porA biểu hiện ở hầu hết các chủng N meningitidis Về cấu trúc PorA, có 8 vùng tiếp xúc trên bề mặt (exposed

surface loop), đánh số thứ tự vùng I đến VIII, hai trong số vùng này (vùng I và vùng IV) có trình tự axit amin biến đổi mạnh (ký hiệu VR1, VR2) Vùng V có trình tự axit amin ít biến đổi hơn (ký hiệu là VR3) Các phản ứng huyết thanh đặc hiệu với PorA chủ yếu xảy ra với epitop ở vùng VR1 và VR2 [21] Dựa vào phản ứng huyết thanh học của kháng thể đơn dòng với vùng VR1, VR2 để xác định phân týp huyết

thanh PorA là protein màng ngoài có tính sinh miễn dịch cao, là kháng nguyên dự

tuyển để tạo vaccine dự phòng não mô cầu nhóm B [42]

Protein porin (PorB) là những protein chính được tìm thấy trong màng ngoài của N meningitidis, chúng hoạt động như các porin cho phép các phân tử nhỏ đi

qua màng ngoài PorB có kích thước thay đổi theo lớp 2 hoă ̣c lớp 3, có mă ̣t ở tất cả

các chủng N meningitidis Protein PorB lớp 2 có tro ̣ng lượng phân tử khoảng 39 -

41 kDa, lớ p 3 khoảng 35 - 38 kDa Đô ̣ tương đồng trình tự axit amin suy diễn PorB2 và PorB3 khoảng 70% Hai lớp protein này loại trừ lẫn nhau và chúng được

biểu hiện bằng các alen thay thế (porB2 và porB3) tại locus porB PorB có cấu trúc

tương tự PorA, gồm 8 vùng tiếp xúc bề mă ̣t, bốn trong số các vùng này có trình tự axit amin biến đổi (vù ng I - VR1, V - VR2, VI - VR3 và VII - VR4) Týp huyết

thanh N meningitidis được xác đi ̣nh dựa trên phản ứng giữa kháng thể đơn dòng

vớ i các vùng biến đổi của PorB Viê ̣c xác đi ̣nh týp và phân týp huyết thanh có ý nghĩa quan tro ̣ng trong giám sát huyết thanh ho ̣c não mô cầu cũng như xác định thành phần vắc xin dự phòng não mô cầu [5,1]

1.2 Dịch tễ học

1.2.1 Dịch tễ học nhiễm não mô cầu

N meningitidis cư trú ở đường hô hấp của con người, lây truyền qua các giọt

bắn truyền trong không khí của người nhiễm bệnh hoặc thông thường hơn là của người mang mầm bệnh không có triệu chứng [52], tỷ lệ gây bệnh chiếm 1/100.000

và tỷ lệ người mang mầm bệnh là 1/10 NMC tồn tại trong đường hầu họng nhờ pili gắn vào các thụ thể của người [28,29] Tỷ lệ mắc NMC thay đổi rất nhiều liên quan đến các khu vực địa lý Trên thế giới mỗi năm xảy ra 500.000 – 1.200.000 ca bệnh

do N meningitidis xâm nhập, trong đó 50.000 - 135.000 ca tử vong [13, 28] Khi đã

đi vào máu, NMC phá vỡ phản ứng đáp ứng miễn dịch bằng một số yếu tố độc lực:

vỏ vi khuẩn, IgA protease, bề mặt chứa Lipopolysaccharide (LPS), hoạt động như một nội độc tố Nội độc tố gây ra một dòng các citokine gây viên và tổn thương nội

mô [48] Bệnh xảy ra chỉ khi NMC vượt qua biểu mô đường hô hấp để vào máu Chúng là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết (nhiễm trùng máu) và nếu vi khuẩn vượt qua hàng rào máu vào não gây viêm màng não, viêm não Tỷ lệ tử vong do nhiễm NMC có thể lên tới 10%, trong khi di chứng vĩnh viễn xảy ra ở 20% số

người sống sót Di chứng vĩnh viễn bao gồm tổn thương thần kinh, rối loạn tâm lý, giảm thính lực, giảm thị lực, cắt cụt chi [43] Khi điều trị bệnh, tỷ lệ tử vong do viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết là: 11%, trong đó viêm màng não đơn thuần là 5% Hầu hết các trường hợp chết do viêm màng não có nguyên nhân từ nhiễm khuẩn huyết Bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết nhưng không có hội chứng màng não

có tỷ lệ tử vong là 20%, nhưng nếu kèm theo sốc thì tỷ lệ tử vong chiếm đến 50% Trong nhiễm khuẩn NMC, 15% thể viêm màng não tiến triển nhanh từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong Khởi phát của viêm màng não kết hợp với đau họng, đau đầu, ngủ lơ mơ, sốt, kích thích, cứng gáy Độc tố của vi khuẩn trong dịch não tủy gây hôn mê [23,18] Thể nhiễm khuẩn huyết biểu hiện lâm sàng như: ban xuất huyết hình sao ngoài da và không mờ đi khi làm dấu hiệu dây thắt hoặc có thể

có mụn nước Theo thống kê, có 35% bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết có biểu hiện nặng như đông cục máu ở tĩnh mạch ngoại vi, hệ tuần hoàn tràn ngập nội độc tố, sốc, bí niệu Trong hầu hết các trường hợp có thể xảy ra xuất huyết não, cần phải điều trị tích cực ngay bằng kháng sinh penicillin, ampicillin hoặc chloramphenicol Nếu không được điều trị thì tỷ lệ tử vong là 100% Sau giai đoạn cấp của viên màng não, bệnh nhận được điều trị bằng rifampin để làm sạch vi khuẩn ở hầu họng và người tiếp xúc gần với bệnh nhân cũng được điều trị dự phòng bằng rifampin [28]

1.2.1.1 Dịch tễ học của bệnh viêm màng não

Sự lưu hành của bệnh viêm màng não có sự khác biệt trên toàn cầu theo khí hậu, độ tuổi mắc bệnh, các quốc gia gần nhau thì không có sự khác biệt dịch tễ học của bệnh Dịch tễ học của các bệnh nhiễm NMC đã thay đổi đáng kể trong những năm qua ở nhiều khu vực trên thế giới Cho đến hiện nay, trên thế giới đã ghi nhận

7 vụ dịch lớn mang tính chất toàn cầu và ảnh hưởng tới một số nước trong một khoảng thời gian nhất định Viêm màng não thường xuyên bùng phát ở khu vực cận Sahara – hay còn được biết đến với tên gọi “vành đai viêm màng não” với tỷ lệ

1000 ca bệnh/ 100.000 dân Nhóm huyết thanh A là tác nhân chính gây viêm màng não ở châu Âu trước và trong chiến tranh thế giới lần thứ I và thứ II Nhóm huyết thanh B phổ biến từ năm 1970 ở châu Âu và từ năm 1980 ở Nam Mỹ Dịch bệnh

bùng phát bởi các nhóm huyết thanh W-135 và Y đã xuất hiện với tần suất nhiều hơn trong thế kỷ XXI so với trước đây Trong những năm 1970, dịch bùng phát ở

Na Uy với cường độ lây nhiễm là 10 ca bệnh/100.000 dân, sau đó lan truyền dọc châu Âu bao gồm các nước Anh vươn ra xa hơn ở các nước: Cu Ba, Chile và Brazil Năm 1987, dịch bệnh viêm màng não khiến nhiều người tử vong trong các lễ hành hương Hajj đển Thánh địa Mecca và lan rộng trên toàn cầu khi những người tham gia hành hương trở về quê hương [29, 26] Ngày nay ở Châu Âu và Bắc Mỹ tỷ lệ mắc bệnh giao động từ 0,3 đến 3 trên 100.000 dân Tại Úc, tỷ lệ này cao hơn với >3

ca bệnh/100.000 dân [15] Ở khu vực Mỹ La tinh, tỷ lệ mắc bệnh giao động từ 0,1

ca bệnh/100.000 dân ở Mexico đến 2 ca bệnh/100.000 dân ở Brazil với sự chiếm ưu thế của NMC nhóm huyết thanh B và C [3] Kể từ năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh ở châu

Âu giảm từ 0,95 xuống còn 0,68/100.000; tỷ lệ cao hơn đã được ghi nhận ở Lituania

và Vương Quốc Anh (lần lượt là 1,77 và 1,36) Trong khi đó, xu hướng dịch tễ học viêm màng não hầu như không thay đổi ở châu Phi với nhóm huyết thanh A phổ biến nhất với tỷ lệ mắc hằng năm 10 -20 ca bệnh/100.000 dân; gần đây, nhóm huyết thanh X và W-135 đã có nhiều sự tác động đến tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của người dân ở khu vực này [2] Ở châu Á, dịch tễ học NMC chưa có nhiều nghiên cứu được thực hiện để xác định rõ ràng Tuy vậy, với nghiên cứu đã được báo cáo của Bermal

N và các cộng sự năm 2011, nhóm huyết thanh A vẫn được coi là phổ biến ở khu vực này mặc dù cả 5 nhóm huyết thanh (bao gồm A, B, C, Y và W-135) đều đã được tìm thấy ngay cả khi có sự khác biệt giữa các vùng [6] Trong năm 2011, 29 quốc gia châu Âu (27 quốc gia EU cùng Na Uy và Iceland) đã ghi nhận 3.808 ca bệnh với nhóm huyết thanh B cao nhất chiếm 73,6%, nhóm huyết thanh C chiếm 14,4% và Y là 8,2% [19]

Khí hậu thay đổi cũng là một trong những nguyên nhân tác động đến việc bùng phát dịch bệnh viêm màng não Ở châu Phi, nhóm huyết thanh A gây bệnh phổ biến nhất với tỷ lệ mắc hằng năm 10-20 ca bệnh/100.000 dân, tuy nhiên đến mùa khô xảy ra bùng phát dịch thì số ca mắc mới lên đến hơn 1000 ca bệnh/100.000 dân, với khí hậu có biểu hiện đặc trưng: ẩm, bụi, mưa rào và gió thay đổi, điều này

dẫn đến thay đổi hoạt động của con người, sau các đợt gió khô và bụi ở vùng cận Sahara là đến mùa mưa Các quốc gia châu Âu và Bắc Mỹ có tỷ lệ mắc bệnh cao trong các tháng mùa đông và thấp vào mùa thu [29]

Hình 1.3 Phân bố các nhóm huyết thanh gây bệnh não mô cầu trên toàn thế giới [27]

Sự thay đổi trong các nhóm tuổi bị ảnh hưởng bởi bệnh xâm lấn đã xảy ra với sự gia tăng tỷ lệ mắc nhóm huyết thanh Y ở người cao tuổi và giảm đối với nhóm huyết thanh C ở thanh thiếu niên [2] Bệnh viêm màng não chủ yếu tác động đến trẻ dưới 5 tuổi, đặc biệt tỷ lệ nhiễm NMC cao nhất được ghi nhận ở trẻ em dưới

1 tuổi bởi khả năng miễn dịch tự nhiên chống lại N meningitidis thấp [16,44] Đối

tượng có tỷ lệ nhiễm bệnh cao thứ hai là thanh thiếu niên và thanh niên (độ tuổi từ

15 - 25) [32] Tỷ lệ bệnh ở trẻ em dưới 5 tuổi liên quan đến nhóm huyết thanh B là cao nhất, tiếp theo là nhóm huyết thanh C Năm 2012, tỷ lệ trẻ em 1 - 4 tuổi nhiễm NMC nhóm B cao hơn gấp 3 lần so với nhóm C (lần lượt là 12,3 và 4,1 trên 100.000) NMC nhóm C được ghi nhận cao nhất ở người trưởng thành 25 - 44 tuổi, nhóm Y chủ yếu bắt gặp ở đối tượng > 65 tuổi [63] Ở Ý, nghiên cứu thực hiện trong giai đoạn 2006 - 2012 đã cho thấy rằng, bệnh viêm màng não do nhóm huyết thanh B gây ra có tỷ lệ mắc cao hơn trong 5 năm đầu đời và 70% trong số đó là

trường hợp dưới 1 tuổi, đỉnh điểm trẻ tháng thứ 4 đến tháng thứ 8 Cho đến khi tiêm chủng vắc xin được triển khai thì tỷ lệ mắc bệnh liên quan đến các nhóm huyết thanh này đã giảm dần Ngày nay, nhóm huyết thanh B gây bệnh viêm màng não chiếm hơn 80% các trường hợp ở bệnh nhân < 24 tuổi [64] Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ bệnh

do NMC gây ra là 0,12/100.000 vào năm 2013, chủ yếu xảy ra với trẻ em dưới 5 tuổi và đối tượng từ 18 - 35 tuổi Nhóm huyết thanh B ảnh hưởng chủ yếu đến trẻ dưới 1 tuổi (0,68/100.000), trong khi đó nhóm huyết thanh C cho thấy tỷ lệ mắc cao hơn ở nhóm 1 - 4 tuổi (0,41/100.000) [62] Tỷ lệ tử vong xảy ra đáng kể ở trẻ vị thành niên ở Mỹ và Anh là tương đương [24]

Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm NMC các khu vực khác nhau trên thế giới [14]

Tại Việt Nam vào năm 1939 – 1940, ở miền Bắc có một số vụ dịch lớn

nhiễm trùng huyết và viêm màng não do N meningitidis lan từ Trung Quốc với số

bệnh nhân lên tới 7.000 người Sau năm 1941, miền Bắc vẫn còn xuất hiện một số

vụ dịch nhỏ Năm 1977, Thành phố Hồ Chí Minh có 1.015 ca mắc do N meningitidis nhóm huyết thanh C gây ra [40,47] Theo tác giả Bùi Đại, các nhóm

huyết thanh lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là nhóm huyết thanh A, B, C Tuy nhiên, năm 2011 đã ghi nhận 1 trường hợp nhiễm NMC nhóm huyết thanh W-135

và một trường hợp đồng nhiễm cả nhóm B và W-135 tại Bắc Giang [53] Giai đoạn

từ 2001 – 2010, trung bình ghi nhận 650 trường hợp mắc bệnh mỗi năm, chủ yếu ở các tỉnh khu vực phía Bắc [47] Năm 2012 ghi nhận 125 trường hợp mắc Đầu năm

2013 vẫn xuất hiện các trường hợp mắc phải rải rác tại nhiều tỉnh, thành phố trong

cả nước, nguy cơ lây lan trong cộng đồng là rất lớn Theo thống kê của Cục Y tế Dự phòng - Bộ Y tế, trong 6 tháng đầu năm 2015 cả nước ghi nhận 24 ca bệnh viêm

màng não do N meningitidis, tăng 16 ca so với cùng kỳ năm ngoái Trong đó, riêng

tháng 4 cả nước đã ghi nhận 11 ca viêm màng não do NMC với 2 ca tử vong Theo kết quả chuyên đề đã được Viện Y học dự phòng Quân đội thực hiện và công bố năm 2015 cho thấy: tỷ lệ mắc viêm màng não do NMC là 3,7 – 11,5/100.000 người,

tỷ lệ tử vong là 18,52% và bệnh thường xuất hiện vào lúc giao mùa tháng 2 - 3, tại

các đơn vị huẩn luyện tân binh [55]

1.2.1.2 Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng

Người mang mầm bệnh không triệu chứng có tỷ lệ cao hơn với người mắc bệnh Ở Mỹ và châu Âu, người mang mầm bệnh không triệu chứng có tỷ lệ khoảng 10%, cao gấp 10.000 lần tỷ lệ mắc bệnh Tuy nhiên, nếu sống trong cùng gia đình hoặc một cộng đồng sinh hoạt khép kín thì tỷ lệ này còn cao hơn nữa, đặc biệt là các đơn vị quân đội, trường học, nhà tù có tỷ lệ người mang mầm bệnh có thể lên đến 50% [12] Mô hình người mang mầm bệnh liên quan đến cường độ bệnh, phân vùng địa lý, ảnh hưởng của khí hậu và lứa tuổi cảm nhiễm Mùa viêm màng não ở Châu Á và Châu Phi thường xuất hiện liên quan đến sự thay đổi khí hậu, điều này

đã được báo cáo ở Nigeria và Ấn Độ Tương tự như vậy, ở vùng khí hậu ôn đới, tỷ

lệ người lành mang mầm bệnh thường xuất hiện theo sự thay đổi mùa, điều này đã được nghiên cứu ở Hoa Kỳ, Bỉ và Hà Lan Tỷ lệ người mang mầm bệnh cao cũng phản ánh nguy cơ dịch lớn, có thể lên tới 70% trong một số bệnh gây dịch Theo thống kê ở Anh, có sự khác biệt giữa các nhóm tuổi mang mầm bệnh không triệu chứng: tỷ lệ thấp ở lứa tuổi nhỏ, cao đến 25% với độ tuổi từ 13-29 tuổi, nhưng tỷ lệ

tử vong quan sát thấy cao ở trẻ dưới 5 tuổi và thấp hơn ở độ tuổi trưởng thành [24]

Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng trong Quân đội Việt Nam từ năm 2008 – 2014 qua giám sát chủ động và giám sát người tiếp xúc trong các vụ dịch cho thấy: tỷ lệ người lành mang trùng chung là 29% Trong đó, ở trong

vụ dịch là 32,64% và ở ngoài vụ dịch là 26% với thời điểm giữa mùa huấn luyện tân binh là 16,4%, sau mùa huấn luyện là 32% Tỷ lệ người lành mang trùng thuộc các nhóm huyết thanh gây bệnh (A, B, C, Y và W-135) là 92% Trong đó, ở trong vụ dịch là 100%, ngoài vụ dịch là 84% với thời điểm giữa mùa huấn luyện là 53%, sau mùa huấn luyện chiếm 94,2% Cơ cấu nhóm huyết thanh trên người lành mang trùng gồm: nhóm B (83%), nhóm C (10%), nhóm W-135 (1%) và 6% không xác định [55] Có thể nhận thấy sự tương phản trong dịch tễ học của người mang mầm bệnh không triệu chứng với tỷ lệ mặc bệnh

Câu hỏi đặt ra ở đây: Người mang mầm bệnh thì không mắc bệnh hay nguyên nhân mắc bệnh liên quan đến sự khác nhau về mặt di truyền? Nguyên nhân mắc bệnh có phải là tập hợp từ nhiều người mang mầm bệnh? Có thể nguyên nhân mắc bệnh là sự tồn tại kéo dài của người mang mầm bệnh không triệu chứng? Khác biệt về sự nhạy cảm ở độ tuổi màng mầm bệnh là độ tuổi mắc? Đối với các đơn vị Quân đội huấn luyện tân binh thường xuất hiện ca bệnh thì cần đặt ra câu hỏi và giải quyết một số vấn đề: Nguồn truyền nhiễm chính là ở trong đơn vị huấn luyện tân binh hay từ các đối tượng thanh niên từ các tỉnh mới nhập ngũ vào đơn vị mới

nhiễm N meningitidis mang vào và trở thành nguồn lây nhiễm chính? Kết hợp với

điều kiện khí hậu, thời tiết mùa đông xuân, cường độ lao động huấn luyện, điều kiện sống tập trung… có làm tăng nguy cơ phơi nhiễm cho các đối tượng thanh niên nhập ngũ tại các khu vực dẫn đến xuất hiện ca bệnh?

1.2.2.Dịch tễ học phân tử Neisseria meningitidis

Sự phân bố các nhóm huyết thanh gây bệnh thay đổi theo thời gian và các

vùng địa lý Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy N meningitidis phân lập từ người

mang mầm bệnh không triệu chứng có sự đa dạng về mặt di truyền hơn so với các chủng gây bệnh (chủng xâm lấn) Phần lớn các trường hợp bệnh viêm màng não là

do một trong số ít các dòng khác nhau, gọi là các dòng siêu xâm lấn (hyperinvasive lineages) Khả năng lây truyền từ vật chủ này sang vật chủ khác là một đặc điểm

cần thiết trong vòng đời của N menningitidis, khi NMC đồng nhiễm với các vi

khuẩn khác có thể dẫn đến thay đổi di truyền, và từ đó tạo ra các dòng NMC mới [57] Một vài phương pháp định týp bằng sinh học phân tử đã được phát triển để

nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của N meningitidis Theo khuyến cáo của Hiệp

hội Bệnh nhiễm NMC Châu Âu, bên cạnh giám sát nhóm huyết thanh học cần giám sát các marker phân tử như: vùng biến đổi của gen Porin A (gồm VR1, VR2 của

gen porA); gen mã hóa protein vận chuyển sắt FetA; gen fHbp mã hóa yếu tố H gắn protein fHbp, gen penA mã hóa protein 2 liên kết penicillin và định loại bằng trình

tự đa locus (multilocus sequence typing - MLST)

1.2.2.1 Xác định týp và phân týp huyết thanh não mô cầu

Có hai phương pháp pháp xác định týp, phân týp huyết thanh NMC gồm phương pháp huyết thanh học và phương pháp sinh học phân tử Phương pháp huyết thanh học dựa vào phản ứng giữa kháng thể đơn dòng với epitop trên các vùng biến đổi của protein PorA và PorB Hiện nay, dựa vào panel kháng thể đơn dòng phản ứng với vùng VR1, VR2, VR3, VR4 PorB; VR1, VR2 PorA đã xác định khoảng 20 týp và 20 phân týp [1] Nhiều nghiên cứu cho thấy các phương pháp huyết thanh học chỉ xác định được một số lượng nhỏ các týp và phân týp huyết

thanh do sự hạn chế về panel kháng thể đơn dòng Có 15-18% chủng N meningitidis nhóm B phân lập ở Mỹ giai đoạn 1992-1998 chỉ xác định được một

phần hoặc không xác định được phân týp [39] Phương pháp sinh học phân tử dựa

vào việc xác định bằng cách khuếch đại hai đoạn của gen porA hoặc porB mã hoá

gen vùng VR1 và VR2, giải trình tự và so sánh trình tự axit amin sau đó Nghiên

cứu sự lưu hành phân týp huyết thanh của N meningitidis nhóm B thu thập ở phía

bắc Tây Ban Nha giai đoạn 2000 – 2003, trong 96 chủng thu thập được, bằng phương pháp huyết thanh học (ELISA) kết quả chỉ có 9 chủng xác định được phân týp huyết thanh (Vùng VR1, VR2), 78 chủng chỉ xác định được một phần (Vùng VR1 hoặc VR2) và 9 chủng không xác định được phân týp Trong khi sử dụng

phương pháp sinh học phân tử, cả 96 chủng này đều xác định được Các phân týp lưu hành chủ yếu P1.5-1, 10-8 (20 chủng); P1.19,15 (14 chủng); P1.22 (11 chủng)

và P1.5,2 (9 chủng) [57]

1.2.2.2 Định loại bằng trình tự đa locus (MLST)

Việc xác định chính xác các chủng là tác nhân truyền nhiễm gây bệnh là một vấn đề trọng tâm của giám sát dịch tễ học NMC và đưa đến các quyết định cũng như giải pháp cho sức khoẻ cộng đồng Tuy nhiên chưa có phương pháp hoàn toàn tối ưu cho mục tiêu này Tất cả các phương pháp hiện nay đang được sử dụng đều

có những hạn chế nhất định: không đủ cơ sở phân biệt, độ tái lặp trong và giữa các phòng thí nghiệm, không thể xác định mối quan hệ di truyền giữa các dòng phân lập… Đặc biệt, hạn chế lớn nhất của các phương pháp là khó khăn trong việc so sánh các kết quả của các phòng thì nghiệm khác nhau [35]

Phương pháp định type bằng trình tự đa locus (MLST) được xem là tiêu chuẩn vàng để giám sát dịch tễ phân tử NMC trong phạm vi các quốc gia và quốc

tế Phương pháp này được sử dụng để giải quyết 2 vấn đề Thứ nhất, các chủng phân lập được sau một đợt bùng phát dịch bệnh NMC tại địa phương là giống nhau hay khác nhau (dịch tễ học ngắn hạn hoặc ở quy mô địa phương)? Thứ hai, các chủng gây bệnh ở một khu vực địa lý nhất định có liên quan như thế nào với các chủng đã được phân lập trên thế giới (dịch tễ học dài hạn hoặc ở quy mô toàn cầu) Tuy có nhiều phương pháp khác nhau để điều tra dịch tễ học NMC ở địa phương và toàn cầu, nhưng trong cả hai trường hợp đã nêu thì kết quả thu được cần phải có tính phân biệt cao để có thể phát hiện được những thay đổi nhỏ nhất, từ đó giúp xác định được những loài có khả năng có chung nguồn gốc tổ tiên [35] MLST là phương pháp khai thác rõ ràng bản chất và tính linh động của các nucleotide, từ đó

mô tả đặc điểm của vi sinh vật, được chứng minh là hữu ích trong việc phân biệt N meningitidis cho cả các nghiên cứu dịch tễ học dài hạn [60] và phân cụm ổ dịch/ca

bệnh [20] MLST dựa trên phân tích đa hình 7 đoạn gen quản gia (house keeping

gene), mã hóa các enzym trao đổi chất gồm: abcZ (putative ABC transporter), adk

(adenylate kinase), aroE (shikimate dehydrogenase), fumC (fumarate hydratase), gdh (glucose-6-phosphate dehydrogenase), pdhC (pyruvate dehydrogenase subunit), pgm (phosphoglucomutase) [7] Để đánh giá MLST, các đoạn gen có kích thước

khoảng 450 bp được khuếch đại bằng phản ứng PCR và tiến hành giải trình tự, mỗi alen của một gen được xác định trên cơ sở có sự khác biệt ít nhất 01 nucleotide [35]

Phương pháp MLST có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp khác là có thể thực hiện trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm mà không cần công đoạn nuôi cấy vi khuẩn và so sánh kết quả với các phòng thí nghiệm khác nhau, từ đó cho phép chia

sẻ và trao đổi dữ liệu trên toàn cầu [35], thông qua Website:

http://pubmlst.org/neisseria Nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ phân tử này giúp chúng ta hiểu được sự lan truyền của các dòng N meningitidis cũng như so sánh các

dòng vi khuẩn lưu hành chủ yếu ở các nước trên thế giới

Hình 1.5 Sơ đồ phân bố các đoạn gen khếch đại trên Chromosomal của chủng

Neisseria meningitidis Z2491, subgroup IV-1 [35]

1.3 Chẩn đoán

1.3.1 Chẩn đoán ca bệnh lâm sàng

- Dựa vào yếu tố dịch tễ: Có tiếp xúc với bệnh nhân hoặc sống trong tập thể (nhà trẻ, trường học, ký túc xá, doanh trại…) có người đã được xác định bị mắc bệnh do não mô cầu [61]

- Dựa vào lâm sàng:

+ Thời kỳ ủ bệnh trung bình là 4 ngày (2-10 ngày)

+ Biểu hiện nhiễm trùng: Sốt cao đột ngột, ho, đau họng, mệt mỏi, nhức đầu Tình trạng nhiễm trùng, nhiễm độc nặng (sốc), có thể tử vong nhanh trong vòng 24 giờ

+ Dấu hiệu màng não - não: Đau đầu dữ dội, nôn, gáy cứng (trẻ nhỏ có thể có tiêu chảy, thóp phồng và gáy mềm), rối loạn ý thức, kích thích vật vã, có thể có co giật, hôn mê…

+ Ban xuất huyết hoại tử hình sao, xuất hiện sớm và lan nhanh

+ Cấy máu phân lập được N meningitidis

+ Soi và cấy phân lập được N meningitidis trong tử ban

+ PCR (+) với N meningitidis trong dịch não tủy, máu, tử ban

● Kỹ thuật nhuộm soi

Bệnh phẩm là dịch não tủy (ly tâm lấy cặn nếu dịch não tủy trong) nhuộm Gram,

soi trên kính hiển vi thấy hình ảnh song cầu Gram (-) nằm trong và ngoài tế bào

● Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập

Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán NMC là phân lập được N meningitidis từ dịch

tiết vô trùng của cơ thể như: dịch não tủy, máu (lấy trước khi dùng kháng sinh), được cấy trên môi thạch máu, môi trường Thayer - Martin cải tiến hoặc chocolate (có bổ sung kháng sinh VCN) và được ủ ở 37℃, 10% khí CO2 Chọn khuẩn lạc, thử các tính chất sinh vật hoá học và ngưng kết với kháng huyết thanh để xác định

nhóm Sự khác biệt với các vi khuẩn thuộc loài khác là khuẩn lạc được thử nghiệm oxidase, catalase dương tính và thử nghiệm sinh hóa lên men Cuối cùng là xác định

về huyết thanh nhóm của N meningitidis, đây là vấn đề quan trọng trong giám sát

dịch tễ học, phần này chỉ có thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên dụng

Hình 1.6 N meningitidis nhuộm Gram (-) từ dịch não tủy [59]

● Kỹ thuật điện di miễn dịch:

Phát hiện polysaccharide đặc hiệu của N meningitidis trong dịch não tuỷ, máu

và nước tiểu Kỹ thuật này có thể phát hiện được polysaccharide ở mức 0,1µg/ml

Hình 1.7 N meningitidis mọc trên thanh định danh API NH

●Kỹ thuật ngưng kết

Gắn anti-polysaccaride lên hồng cầu hoặc hạt latex để phát hiện kháng

nguyên polysaccaride của N meningitidis trong bệnh phẩm máu, dịch não tủy, nước tiểu, độ nhạy dao động từ 2,5 - 62,5 ng/ml (62,5ng/ml đối với N meningitidis nhóm

B) và chỉ dùng trong phát hiện ca bệnh Do đó Trung tâm kiểm soát bệnh tật CDC khuyến cáo không sử dụng kỹ thuật này trong thường qui xét nghiệm chẩn đoán

nhiễm não mô cầu

Hình 1.8 Bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N meningitidis

● Kỹ thuật sinh học phân tử

Phương pháp PCR, Real-time PCR là công cụ tốt cho phát hiện tác nhân vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (dịch tiết, máu và dịch não tủy, dịch tử ban…)

và không cần thiết vi khuẩn phải sống trong mẫu bệnh phẩm (vi khuẩn chết, hoặc đang bị ly giải do điều kiện bảo quản hoặc trước khi sử dụng kháng sinh) Cho đến nay PCR đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán và giám sát tác nhân vi sinh vật

vì có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đã được chứng minh là công cụ bổ sung tốt cho các phương pháp xác định kiểu hình như: nuôi cấy, nhuộm gram, và ngưng kết hạt latex để nâng cao nhận định khẳng định kết quả Kỹ thuật PCR rút ngắn thời gian xét nghiệm còn khoảng 4 - 6 giờ, phù hợp với yêu cầu chẩn đoán nhanh trên đối

tượng bệnh nhân và điều tra người mang N meningitidis trong vụ dịch Tuy nhiên,

kỹ thuật PCR không thể thay thế hoàn toàn được kĩ thuật nuôi cấy, phân lập thường quy Nuôi cấy, phân lập vừa tiêu chuẩn vàng vừa có thể lưu giữ chủng não mô cầu, thử nghiệm kháng sinh đồ, tuyển chọn chủng sản xuất vắc xin và thực hiện những nghiên cứu chuyên sâu khác

Một số gene đích xác định loài và nhóm N meningitidis

Trong xác định N meningitidis bằng kỹ thuật PCR, tiêu chí được đặt lên

hàng đầu là lựa chọn các đoạn gene đặc hiệu và phù hợp Nhiều phòng thí nghiệm

trên thế giới sử dụng các đoạn gene đặc hiệu như ctrA, porA, crgA, sodC, IS1106

để phát hiện loài N meningitidis Để phát hiện nhóm huyết thanh, gene sacD hoặc Orf-2 được sử dụng cho phát hiện nhóm A, gene siaD cho phát hiện nhóm B và C

Hình 1.9 Bản đồ gene capsule (CPS) của N meningitidis Nguồn CDC

Mỗi gene đều có vai trò và chức năng nhất định, ví dụ: gene ctrA và sodC là hai gene vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào Gene ctrA là đoạn gene mã hóa

protein màng ngoài có tính bảo thủ cao, ít thay đổi cấu trúc và được tìm thấy trong

tất cả các nhóm huyết thanh Gene sodC phát hiện khả năng hình thành vỏ của cầu

khuẩn, có vùng đặc hiệu cho NMC trên người bệnh và nhất là ở người mang mầm

bệnh không triệu chứng mà ở đó không có gene ctrA và được tìm thấy trong N

meningitidis nhưng không có trong loài Neisseria spp Gene porA là một protein

màng ngoài có chức năng như một tế bào mitogen B hay các chất hoạt hóa, và LOS,

là tác nhân chính có chức năng nội độc tố, gene crgA thuộc vùng gene bảo thủ, tham gia điều tiết độ bám dính của N meningitidis để bám dính vào tế bào vật chủ [53]

1.3.3 Đáp ứng miễn dịch [9, 36]

Kháng nguyên gây miễn dịch của N meningitidis nhóm A, C là

polysaccharide vỏ và tạo kháng thể chuyên biệt là IgG hay IgM Riêng đối với nhóm B, kháng nguyên gây miễn dịch chưa được định nghĩa rõ ràng, có thể bao gồm cả protein màng tế bào và chỉ tạo đáp ứng IgM đơn thuần Kháng nguyên vỏ

của nhóm B trong chẩn đoán miễn dịch thường gây phản ứng chéo với vỏ E coli

serotype K1 (thường gây viêm màng não ở trẻ nhỏ)

Trẻ sơ sinh có thể có miễn dịch thụ động IgG do được mẹ truyền qua nhau thai Miễn dịch sau tiêm vắc xin thu được ở các mức độ khác nhau tùy theo nhóm huyết thanh

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu này là 59 chủng Neisseria meningitidis trên đối tượng người lành mang mầm bệnh thu thập từ một số tỉnh phía

Bắc (Lạng Sơn, Thái Nguyên, Hà Giang…) Các chủng đã được phân lập, định danh

và khẳng định bằng kỹ thuật Real-time PCR ở phòng thí nghiệm Viện Y sinh nhiệt đới

- Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách chủng Neisseria meningtidis (2017-2020)

Các máy móc và trang thiết bị chính được dùng trong nghiên cứu bao gồm:

Hệ thống Real-time PCR (Bio-Rad – Mỹ); Hệ thống luân nhiệt PCR (Bio-Rad – Mỹ); Hệ thống điện di và soi gel (Bio-Rad – Mỹ); Hệ thống giải trình tự DNA (ABI prism 3100 Sequencer, Applied Biosystems); Tủ an toàn sinh học cấp II (ESCO); Máy ly tâm (Eppendorf); Nồi hấp tiệt trùng 110 (Hirayama);

2.2.2 Hoá chất, sinh phẩm

Các hoá chất được sử dụng đều có nguồn gốc từ các hãng uy tín: bộ kit tách

QIAamp DNA mini kit (QIAGEN - Đức); kit FEP/FRT Neisseria meningitidis/STI

(Nga); các cặp mồi cho phản ứng khuếch đại được sản xuất bởi hãng Invitrogen -

Mỹ và Biosearch Technologies – Vương quốc Anh Các hoá chất còn lại đều được mua từ các hãng tin cậy như Sigma Aldrich, Serva, , đạt độ tinh khiết cho phân tích và nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA

Tách DNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA mini kit (QIAGEN - Đức)

Hút 400µl dung dịch tăng sinh chủng phân lập từ các mẫu bệnh phẩm (nồng

độ N meningitidis 108 CFU/1ml) ly tâm 250 g trong vòng 5 phút Hút loại bỏ dịch nổi Tra 200 µl TE buffer hoặc PBS vào các ống chứa mẫu bệnh phẩm Tra 20 µl protein K và 200 µl dung dịch Lysis vào hỗn hợp tách Trộn đều, ủ tại nhiệt độ 56ºC trong vòng 10 phút Tra 20 µl dung dịch Rnase A vào các ống hỗn hợp, trộn đều và

ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút Tra 400 µl dung dịch ethanol (50%) vào hỗn hợp dung dịch tách trên Lắc đều, ly tâm nhanh Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột

đã đánh dấu số thứ tự mẫu Ly tâm cột tại 6000 g trong vòng 1 phút Loại bỏ dung

dịch bằng cách chuyển cột sang ống mới Tra 500 µl dung dịch rửa Wash Buffer I vào, ly tâm trong 8000 g trong vòng 1 phút Loại bỏ dung dịch bằng cách chuyển cột sang ống mới Tra 500 µl dung dịch rửa Wash Buffer II vào, ly tâm trong 13.000 g trong vòng 3 phút để loại bỏ toàn bộ dung dịch rửa Loại bỏ dung dịch bằng cách chuyển cột sang ống mới Tra 200 µl dung dịch Elution Buffer vào cột, ủ

ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 phút, ly tâm 8000 g trong 1 phút Bỏ bỏ các cột lọc, thu hồi DNA Lưu trữ và bảo quản DNA tại nhiệt độ -20ºC

2.3.2 Xác định nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật

multiplex-PCR

Trình tự các cặp mồi cho multiplex - PCR: Thiết kế các cặp mồi phát hiện

nhóm huyết thanh A trên cùng gen orf-2 và phát hiện nhóm huyết thanh B, C, W135, Y trên vùng gen siaD Mồi do hãng Invitrogen - Mỹ sản xuất có trình tự

trong Bảng 2.2

Phản ứng khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Bio-Rad (Mỹ) với tổng thể tích phản ứng 50 µl chứa các thành phần (Bảng 2.3)

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi xác định nhóm huyết thanh [53]

SP PCR (bp)

5’-CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC-3’

orf-2 (A)

400 5’-CGTAATAGTTTCGTATGCCTTCTT-3’

5’-GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA-3’

siaD (B)

450 5’-GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA-3’

5’-TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT-3’

siaD (C)

250 5’-CA ATCACGATTTGCCCAATTGAC-3’

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR

PCR master mix (Intron biotechlonogy Hàn Quốc) 25

cả đoạn DNA đang được tổng hợp đều hoàn tất, sau đó mẫu được giữ ở 4°C cho đến khi phân tích bước tiếp theo

Sản phẩn của phản ứng PCR sau đó được kiểu tra trên gel agarose 2,5% và được chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Bio-Rad)

2.3.3 Phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen MLST

Trình tự các cặp mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen MLST [46] được sản xuất bởi hãng Biosearch Technologies – Vương quốc Anh (Bảng 2.4)

Phản ứng khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Bio-Rad (Mỹ) với tổng thể tích phản ứng 50 µl với các thành phần Bảng 2.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen MLST gồm các bước như sau: Biến tính DNA ở 94°C trong 2 phút; tiếp theo 35 chu kỳ gồm 3 bước: i) biến tính DNA ở 94°C trong 20 giây, ii) gắn mồi ở 51-64°C trong 20 giây, iii) kéo dài chuỗi ở 72°C trong 60 giây Hỗn hợp PCR được ủ tiếp ở 72°C trong 4 phút để đảm

bảo tất cả đoạn DNA đang được tổng hợp đều hoàn tất, sau đó mẫu được giữ ở 4°C cho đến khi phân tích Sản phẩn của phản ứng PCR sau đó được kiểu tra trên gel agarose 2,5% và được chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Bio-Rad)

Bảng 2.4 Trình tự các cặp mồi khuếch đại các đoạn gen MLST [46]

KTSP PCR (bp)

aroE-P1B 5'- TTTGAAACAGGCGGTTGCGG - 3' aroE (shikimate

dehydrogenase) 490 aroE-P2B 5'- CAGCGGTAATCCAGTGCGAC - 3'

fumC-P1B 5'- TCCCCGCCGTAAAAGCCCTG -3' fumC (fumarate

hydratase) 465 fumC-

P2B 5'- GCCCGTCAGCAAGCCCAAC -3'

gdh-P1B 5'- CTGCCCCCGGGGTTTTCATCT - 3' gdh

(glucose-6-phosphate dehydrogenase) 501

gdh-P2B 5'- TGTTGCGCGTTATTTCAAAGAAGG - 3'

pdhC-P1B 5'- CCGGCCGTACGACGCTGAAC -3' pdhC (pyruvate

dehydrogenase subunit) 480

pdhC-P2B 5'- GATGTCGGAATGGGGCAAACA -3'

(phosphoglucom utase) 450

pgm-P2 5'- CGGATTGCTTTCGATGACGGC -3'

2.3.4 Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen kháng nguyên mã hoá protein màng ngoài PorA và PorB

Trình tự các cặp mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen kháng nguyên mã hoá protein màng ngoài PorA và PorB được sản xuất bởi hãng Biosearch Technologies – Vương quốc Anh (Bảng 2.5)

Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi khuếch đại các đoạn gen kháng nguyên mã hoá

protein màng ngoài PorA [10] và PorB

đích

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

Nhiệt

độ gắn mồi (°C)

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen porA và porB gồm

các bước như sau: Biến tính DNA ở 94°C trong 2 phút; tiếp theo 35 chu kỳ gồm 3 bước: i) biến tính DNA ở 94°C trong 20 giây, ii) gắn mồi ở 50-64°C (nhiệt độ gắn mồi cho từng gen đích ở trong Bảng 2.5) trong 20 giây, iii) kéo dài chuỗi ở 72°C trong 60 giây Hỗn hợp PCR được ủ tiếp ở 72°C trong 4 phút để đảm bảo tất cả đoạn DNA đang được tổng hợp đều hoàn tất, sau đó mẫu được giữ ở 4°C cho đến khi phân tích Sản phẩn của phản ứng PCR sau đó được kiểu tra trên gel agarose 2,5% và được chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Bio-Rad)

2.3.5 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

Các sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 2,5% được chuẩn bị từ bột agarose (Invitrogen) với 300 ml đệm TAE 1X 5 µl mẫu DNA được trộn với 2

µl loading dye 6X (chất chỉ thị màu bromophenol, xanh xylene cyanol và glycerol 20%) và tra vào các giếng trên gel Quá trình điện di trong đệm TAE 1X được thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 100V trong 30 phút Bản gel sau khi điện di được ngâm trong Ethidium Bromide (EtBr) ở nồng độ 0,1 µg/ml và sau đó được soi và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại của hệ thống Geldoc (Bio-Rad)

Sản phẩm sau khi tinh sạch được định lượng bằng máy đo Fluorometer Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) sử dụng bộ kit Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ), theo khuyến nghị của nhà sản xuất

2.3.7 Giải trình tự gen các sản phẩm PCR

Bảng 2.6 Trình tự các mồi giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đóng gói cẩn thận, ghi rõ thông tin mẫu của mỗi ống Và được gửi đi giải trình tự tại công ty 1st BASE (website:

http://www.base-asia.com) bằng phương pháp tổng hợp Sanger cải biến với bộ kit

xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems trên máy ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems)

- Phân týp huyết thanh vùng VR1 và VR2 được xác định từ cơ sở dữ liệu của

N meningitidis trên website: : https://pubmlst.org/organisms/neisseria-spp/pora

- Týp huyết thanh vùng VR1-VR4 gen PorB được xác định bằng sự kết hợp giữa

công cụ dịch mã trên website: http://web.expasy.org/translate để xác định trình tự

axit amin suy diễn với dữ liệu protein PorB trên website: