Nghiên cứu một số đặc điểm di truyền liên quan đến khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật và đối kháng nấm bệnh của vi khuẩn pseudomonas phân lập tại một số tỉnh miền nam việt nam

Trên đây là một định nghĩa chính thức, tuy nhiên chưa nhan mạnh tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học của nhóm vi khuân này, chăng hạn như khà nàng phân hủy một số lượng lớn các hợ

ĐẠT HỌC QUÓC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HỌC TỤ NHIÊN

CHƯ NGUYÊN THANH

Ngành: Di truyền học

Mã số ngành: 62420121

Phản biện 1: PGS TS Lê Đình Đôn

Phán biện 2: PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp

Phàn biện 3: GS TS Lê Huyền Ái Thúy

Phản biện độc lập 1: TS Lê Tiến Dũng

Phán biện độc lập 2: TS Huỳnh Hữu Đức

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Bùi Văn Lệ

TS Hoàng Thị Thanh Minh

Tp Hồ Chí Minh - Năm 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Di truyền học, với đề tài “Nghiên cứu một

số đặc điếm di truyền liên quan đến khả năng thúc đấy tăng trưó ’ng thực vật và đối kháng nấm bệnh của vi khuẩn Pseudomonas phân lập tại một số tỉnh miền nam Việt Nam” là công trinh khoa học do Tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS

TS Bùi Văn Lệ và TS Hoàng Thị Thanh Minh

Những kct qua nghiên cứu cua luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và không trùng lắp với các công trình đã công bố trong và ngoài nước

Nghiên cứu sinh (Kỷ tên, ghi họ tên)

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT iv

DANH MỤC CÁC BÁNG V DANH MỤC CÁC HÌNH VÊ, ĐỔ THỊ vi

Mở đầu 1

Chương 1:TỔNG QUAN 3

1.1 Tong quan về vi khuan Pseudomonas 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại 3

1.1.2 Đặc điêm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh thái 5

1.1.3 Đặc đicm bộ gcnc 6

1.2 Sự tương tác của Pseudomonas với vùng rễ thực vật 8

1.2.1 Rhizospheric - Sự xâm chiếm vùng rề thực vật 9

1.2.2 Endophytic - Sự nội sinh trong rễ thực vật 10

1.3 Cơ chế thúc đày tăng trường thực vật cũa Pseudomonas 12

1.3.1 Pseudomonas hoạt động như một loại phân bón sinh học 13

1.3.2 Càm ứng sự phát triển hệ rề 19

1.3.3 Bào vệ thực vật khỏi các tác nhàn gây bênh 22

1.3.4 Bâo vệ thực vật khỏi các điều kiện bất lợi cũa môi trường 27

1.3.5 Vai trò như một vi khuẩn trợ giúp 28

1.4 Tiếp cận khai thác bộ gcnc trong nghicn cửu PGPR 29

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 35

1.5.1 Nghiên cứu trên thế giới 35

1.5.2 Nghiên cứu trong nước 36

Chương 2: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 37

2.1 Vật liệu 37

2.1.1 Mầu đẩt và rễ 37

2.1.1 Hạt giống và vật liệu thực vật 38

2.1.2 Chúng nẩm bệnh thực vật 39

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử và môi trường nuôi cấy 39

2.2.1 Phân lập và tuycn chọn vi khuân 43

2.2.2 Giải trình tự bộ gene và phân tích bioinfonnatic 47

2.2.3 Nghiên cứu ãnh hưởng của vi khuân lên sự tăng trường của thực vật 49 2.2.4 Nghiên cứu khá năng ức chế nấm bệnh cua vi khuẩn 53

2.2.5 Phương pháp xử lý thống kè 55

Chương 3: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 56

3.1 Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn 56

3.1.1 Phân lập và nhận diện vi khuẩn 56

3.1.2 Tuyển chọn chủng thúc đấy tăng trướng thực vật 59

3.1.3 Tuyển chọn chủng đối kháng nấm bệnh 63

3.1.4 Đặc điểm bộ gene và vị trí phàn loại cua chững PS01 67

3.1.5 Đặc điêm bộ gene và vị trí phân loại cua chủng AF10 76

3.2 Cơ chế thúc đấy tăng trương thực vật cùa PS01 trong điều kiện không stress 83

3.2.1 Đáp ứng rễ của A thalỉana với chung PS01 84

3.2.2 Vai trò của IAA vi khuân trong các đáp ứng rề của A thaỉiana 87

3.2.3 Ánh hương cua PSOI lên sự tổng hợp auxin nội sinh và sự phân bo auxin trong cây 98

3.2.4 PSO1 thúc đẩy sự tăng trường cùa cây bắp trong vườn ươm 103

3.2.5 Đặc đièm bộ gene cua PS01 liên quan đến khá năng thúc đấy tâng trướng thực vật 105

3.3 PS01 cái thiện sự tăng trưởng cúa thực vật trong điều kiện stress mạn 114

3.3.1 Thử nghiệm khả năng chịu mặn cùa chủng PS01 114

3.3.2 PS01 táng cường tính chống chịu với stress mặn cùa A thalìana 115

3.3.3 PS01 cải thiện các thông số tăng trưởng cua cây bắp trong điều kiện stress mặn 124

3.3.4 Đặc diêm bộ gene cùa vi khuấn liên quan đến khả năng tăng cường tính chống chịu với stress mặn cúa thực vật 127

3.4 Khả năng đối kháng nấm bệnh cua các chủng Pseudomonas 129

3.4.1 Pseudomonas ức chế sự nảy mam cùa bào tử c acutatum 129

3.4.3 Đặc điểm bộ gene cùa vi khuấn liên quan đến kha năng đối kháng với

nấm bệnh 136

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 58

4.1 Kết luận 146

4.2 Tính mới của luận án 147

4.3 Giới hạn cúa luận án 147

4.4 Kiến nghị 148

DANH MỤC CÔNG TRÌNH TÁC GIẢ 149

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 150

PHỤ LỤC 180

LỜI CẢM ƠN

Xin gửi lời tri ân sâu săc đên PGS TS Bùi Văn Lệ, người thây đã kiên nhân

r

hướng dân tôi trong suôt thời gian thực hiện luận án

Xin cám ơn các thây cô trong bộ môn đã chia sé những kicn thức, những kỹnăng và cỏ nhừng đóng góp xây dựng giúp luận án được hoàn thành

Xin cám ơn TS Hoàng Thị Thanh Minh, một người bạn, người thây và cũng là

một cộng sự đăc lực đã cùng tôi đi tới cuôi hành trình này

Xin cám ơn tất cà các cộng sự Đào Ngọc Điệp, Nguyễn Thị Bạch Lê, Nguyễn Yen Nhi, Trần Thị Hoài Bảo, Nguyễn Hồng Bửu Vinh, Nguyễn Thải Ngọc Dù cho

chúng ta không the đi cùng nhau đen cuối hành trình, nhưng ở mồi chặng đường đều

có những thành quả và những kỷ niệm khó quèn

Xin cám ơn bạn Thiên Phúc đã rất nhiệt tình hỗ trợ và chỉ dẫn các công cụ phân

tích sinh tin học

Xin cám ơn TS Nguyễn Hồng Nhã Trân, TS Trần Minh Tuấn, TS Bùi Hoàng

Báo Ngọc đã tận tình giúp đỡ trong việc chinh sứa và công bố các bài báo khoa học

Xin cám ơn TS Nguyễn Mỳ Nương đà luôn cỏ mặt kịp thời và trợ giúp những khúc mắc về thủ tục báo vệ luận án

Xin cám ơn tât ca những ân nhân dã giúp đỡ tôi cách này hay cách khác, giúp cho luận án được hình thành và hoàn thiện • • •

Cũng không quên cám ơn gia đình đã luôn động viên và chờ đợi tôi tại diêm

r

cuôi cúa cuộc hành trinh

Xin chân thành cám ơn tât cà

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AHL: N-acyl-l-homoserine lactone

AM: Arbuscular mycorrhiza

ANI: Average Nucleotide Identity - độ tương dong nucleotide trung bình

BGC: Biosynthetic gene cluster

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

Bp: base pair - cặp bazo

BSL: Biosafety Level - Cap độ an toàn sinh học

CDS: Coding sequence - trình tự mã hoá

COG: Cluster of Orthologous Group - cụm các gene tương tự

EPS: exopolysaecharide

IAA: Indole Acetic Acid

ISR: Induction of Systemic Resistance - Sự cảm ứng hệ thống kháng

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

Mbp: Mega base pair

NCB1: National Center for Biotechnology Information (US)

NST: nhiem sac the

PCR: Polymerase chain reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Báng 1-1 Đặc điểm bộ gene cua một số loài thuộc chi Pseudomonas [37] 7

Bàng 2-1 Thông tin mẫu và địa điểm lấy mẫu 37

Báng 2-2 Các chúng nam bệnh sử dụng trong nghiên cứu 39

Báng 2-3 Trình tự mồi cho A thaliana 41

Bảng 3-1 Kết quả phân lập và định danh ban đầu các chùng vi khuẩn 57

Băng 3-2 Kha năng cố dịnh đạm, hoà tan phosphate và sinh tông hợp phytohormone IAA cùa các chủng vi khuẩn 61

Bảng 3-3 Khà năng đối kháng nấm bệnh của các chung p aeruginosa 65

Báng 3-4 So sánh kết quả lắp ráp trình tự bộ gone cùa PS01 sử dụng công cụ SPADES và VELVET 68

Bảng 3-5 So sánh đặc điếm bộ gene của các chúng p. taiwanensis 72

Báng 3-6 So sánh kết quả lắp ráp trình tự bộ gene của AF10 sử dụng công cụ SPADES và VELVET 77

Báng 3-7 Gene sinh tổng hợp 1AA của PS01 89

Báng 3-8 Gene sinh tổng hợp một số voc cua PS01 93

Bảng 3-9 Gene liên quan đến sự xâm chiếm và định cư tại vùng rề cua PS01 108

Báng 3-10 Gcnc liên quan đến sự hòa tan và khoáng hóa p cua PS01 110

Bàng 3-11 Gone sinh tổng hợp pyovcrdinc cùa PS01 112

Báng 3-12 Gene mà hoá cho các enzyme thuỷ giái cúa PS01 113

Báng 3-13 Gcnc liên quan đến kliá năng tăng cường tính chống chịu stress mặn ớ thực vật của PS01 127

Bâng 3-14 Gene sinh tông hợp các chất đối khảng của AF10 138

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1-1 Anh chụp SEM của vi khuân Pseudomonas aeruginosa 3

Hình 1-2 Mô hình hệ vi sinh vật rễ 9

Hình 1-3 Tóm lược các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của Pseudomonas Hình 1-4 Tổng quan về các con đường sinh tổng hợp 1AA ở vi khuẩn 21

Hình 1-5 Quá trình tuyển chọn PGPR cho mục đích ứng dụng 31

Hình 1-6 Pan-genome của 20 bộ gene Pseudomonas tiêu biểu 34

Hình 2-1 Tóm lược nội dung nghiên cứu và các thí nghiệm được thực hiện 42

Hình 2-2 Quy trình gian lược hướng dẫn xử lý dữ liệu và lấp ráp bộ gene 47

Hình 3-1 Ảnh hưởng cua các chúng vi khuẩn lên sinh khối A thaliana 60

Hình 3-2 Khà năng ức chế nấm bệnh cua PS01 64

Hình 3-3 Hiệu quả kháng nấm phổ rộng cúa Pseudomonas AF10 66

Hình 3-4 Bân phác thảo bộ gene PS01 thê hiện ớ dạng vòng 69

Hình 3-5 Dự đoán sự hiện diện của các plasmid trong bân thào bộ gene PS01 70

Hình 3-6 Độ tương đong trinh tự DNA giữa PS01 và các chủng p taiwanensis khác .73

Hình 3-7 Trắc đồ chức năng COG của PS01 và các chùng p taiwanensis khác 74

Hình 3-8 Biểu đồ Venn của bốn chủng p taiwanensis 76

Hình 3-9 Bàn phác thào bộ gene AF10 thể hiện ở dạng vòng 78

Hình 3-10 Dự đoán sự hiện diện của các plasmid trong bản thảo bộ gene AF10 .79

Hình 3-11 Độ tương đông trình tự DNA giữa AF10 và các chúng p aeruginosa khác .81

Hình 3-12 Trắc đồ chức năng COG cua AF10 và các chủng p aeruginosa khác 82

Hình 3-13 Ảnh hướng cùa PS01 lên kiến trúc hệ rễ của A thaliana 85

Hình 3-14 PSO1 thúc đẩy sự khởi phát rễ bên của A thaliana 86

Hình 3-15 Vai trò của các hợp chất khuếch tán và voc sinh ra bởi PS01 lên sự biến đồi kiến trúc rễ của A thaliana 91

Hình 3-16 Vai trò của auxin vi khuẩn trong sụ biến đổi kiến trúc rc qua trung gian PS01 95Hình 3-17 Ánh hưởng của PS01 lên sự biếu hiện các gene điều hòa sự phát triển rễ bên phụ thuộc auxin ờ A thaliana 96

Hình 3-18 Ảnh hưởng cua PS01 lên sự biêu hiện các gene sinh tông hợp tryptophan

và auxin ở Arabidopsis 99

Hình 3-19 Anh hướng của PS01 lên sự biêu hiện các gene tham gia vận chuyển và

truyền tín hiệu auxin ớ Arabidopsis 100Hình 3-20 Pseudomonas PS01 làm gia tăng biên độ gradient auxin ờ vùng ngọn rễ cua A thaliana 101Hình 3-21 Vai trò cua quá trình vận chuyển auxin trong sự biến đồi kiến trúc rễ ờ A thaỉiana qua trung gian PS01 102Hình 3-22 Hiệu quá cua việc bố sung vi khuẩn PS01 lên sự sinh trướng của cây bẳp

104 Hình 3-23 Một số đặc điểm thúc đẩy tăng trường thực vật cùa PS01 106

Hình 3-24 Khá năng tăng trưởng của Pseudomonas PSO1 ở các nồng độ muối khác nhau 115Hình 3-25 PS01 cái thiện tỉ lệ nãy mầm của hạt A thaliana trong điều kiện stress mặn

116 Hình 3-26 PS01 gia tăng tỉ lệ sống của cày con A thaliana trong điều kiện stress mặn

119 Hình 3-27 Pseudomonas PS01 làm thay đối sự biổu hiện một so gene liên quan đến tinh chổng chịu stress abiotic cua A thaliana 122Hình 3-28 Pseudomonas PS01 tâng khả năng chống chịu với stress của A thaỉiana ở giai đoạn trường thành 124

Hình 3-29 PS01 cải thiện tĩ lệ này mầm của hạt bắp trong điều kiện stress mặn 125 Hình 3-30 PS01 thúc đây sự tăng trướng cây bắp trong điều kiện stress mặn 126Hình 3-31 Các chung Pseudomonas ức chế sự nảy mầm cùa bào từ nấm c acutatum

130

Hình 3-32 Dịch nuôi cấy vi khuân ức chế sự nãy mầm cúa bào tư nấm c acutatum

132 Hình 3-33 Các chủng Pseudomonas ức chế sự phát triến của sợi nấm c acutatum

133 Hình 3-34 Ánh hường cùa các hợp chất khuếch tán và voc sàn sinh bời vi khuấn lên

sự tăng trường của nấm c acuta turn 135Hình 3-35 cấu trúc cụm gene sinh long hợp L-2-amino-4-methoxy-trans-3-butenoic

acid của AF10 140Hình 3-36 cấu trúc cụm gene sinh tống hợp biocyclomycin cúa AF10 140Hình 3-37 cấu trúc domain của cụm gene NRPS mới ờ AF10 140

Việt Nam là một trong năm quốc gia bị ánh hường nặng nề bời biến đôi khí hậu Làm

thế nào đe duy trì sán lượng nông nghiệp mặc cho diện tích đất canh tác ngày càng

thu hẹp, vừa đáp ứng nhu cầu của dân số đang ngày một gia tăng mà không anh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sổng và đám bao chất lượng nông sán là một thách thức

rất lớn Trong bối cảnh đó, việc sử dụng phân bón sinh học (bio-fcrtilizcr), các chất

kích thích có nguồn gốc thực vật (phyto stimulator) và các tác nhân kiểm soát sinh học (bio control agent) là cách tiếp cận phù hợp nhất [4-8] Chiến lược sứ dụng vi

sinh vật trong nông nghiệp đà có một lịch sử lâu dài, và dan trơ nên phô biến hơn trong nhừng năm gần đây với nhiều sản phẩm được phát triển trên thị trường toàn cầu [9,10], Việc ứng dụng vi khuân vùng rễ thúc đây tăng trướng thực vật (PGPR - plant

growth promoting rhizobacterium) đà được báo cáo ờ nhiều chi vi khuấn khác nhau [7,11J Trong số đó, Pseudomonas phân bố rộng rài trong đất, nước và các hệ sinh thái nông nghiệp, có khá năng thích nghi cao độ với những yếu tố bất lợi tù’ môi trường nhờ việc sở hữu các quá trình biến dưỡng và sinh lý đa dạng [12] Khả năng

tổng hợp hàng loạt các chất biến dường có giá trị, khả năng làm sạch môi trường khói

các chất gây ô nhiễm, điều kiện nuôi cấy cực kỳ đơn gian cùng với tốc độ táng trường cực nhanh khiến chúng nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu [12]

Hiện nay, những nghiên cứu về PGPR đã có những bước tiến nháy vọt Ngày

càng nhiều trinh tự bộ gene của các PGPR được công bố và việc khai thác các dừ liệu

này đã mở rộng những hicu biết về mối tương tác giữa PGPR với thực vật ở cấp độ

phân tứ và di truyền So với the giới, lình vực nghiên cứu này còn khá mới mẻ tại Việt Nam Vi vậy, mục tiêu của luận án này là tìm hiểu đặc điểm di truyền và CO ’

vật, ở miền nam Việt Nam, liên quan tói một số €0' chế thúc đấy tăng trưởng thực vật và ức chế nấm bệnh. Luận án bao gồm bốn nội dung nghiên cứu chính:

Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn: vi khuẩn được phân lập và tuycn chọn dựa trên khả năng kích thích tăng trương thực vật và đối kháng

nấm bệnh Trinh tự bộ gcnc của các chung tuyên chọn sẽ được mô ta phục vụ cho việc phân loại chính xác và so sánh với các chủng đã công bố trước đó

Nghiên cửu khả năng thúc day tăng trưởng thực vật trong điều kiện bình thường: hiệu qua cua vi khuẩn lên sự tăng trường cua thực vật được đánh giá trên đối tượng cây mô hình và cây nông nghiệp Khai thác dừ liệu bộ gene

nhằm lý giải các kết quà kiểu hình và định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

Cụ thể, vai trò cua IAA vi khuẩn lên sự biến đổi kiến trúc rễ sẽ được làm rõ

Nghiên cứu khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong điều kiện stress: hiệu quả của VI khuẩn lên sự tăng trương cứa thực vật trong điều kiện stress mặn được đánh giá trên đối tượng cây mô hình và cây nông nghiệp Bước

đầu tìm hiểu CƠ chế phân tử được vi khuấn sử dụng trong việc hồ trợ thực vật chống chịu với stress mặn Khai thác dữ liệu bộ gcnc nham lý giái các ket qua kiêu hình và định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu khả năng đối kháng nấm: đánh giá khả năng của vi khuấn trong việc ức chế sự này mầm bào tứ và sự tăng trường sợi nấm Colletotrichum

acutatum. Bước đầu xác định vai trò cũa dịch tăng sinh vi khuẩn và các họp chất bay hơi trong việc ức chế nấm bệnh Khai thác dừ liệu bộ gcnc, dự đoán các

gene sinh tổng hợp các hợp chất kháng tiềm năng

Luận án được thực hiện tại phòng thử nghiệm vi sinh - Trung tâm Kỳ thuật 3

và Trại thực nghiệm sinh học - Bộ môn công nghệ sinh học thực vật và chuyến hóa

sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Chương 1: TỐNG QUAN

1.1 Tông quan về vi khuấn Pseudomonas

1.1.1 Dặc điểm phân loại

Vị trí phân loại cua chi Pseudomonas trên NCBI:

Theo đề nghị của De Vos và cộng sự, cũng là đề nghị được chấp nhận rộng

rãi, chi Pseudomonas chú yếu bao gồm các loài có quan hệ gần gũi với Pseudomonas

“Gammaprotcobactcria” Các loài trong nhóm này đôi khi còn được gọi là

“Pseudomonas thật” hoặc “Pseudomonas huỳnh quang” do khá năng tiết sắc tố huỳnh

quang tan trong nước Dù vậy, không phải tất cà các loài “Pseudomonas huỳnh quang” thực sự sán sinh sac tố phát huỳnh quang như trường hợp Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas medocina, Pseudomonas aỉcaligenes Thuật ngữ

“pseudomonad” (không viết hoa và in nghiêng) cũng thường được sử dụng với nghĩa

bao gồm că các loài gần giống với các loài thuộc chi Pseudomonas [13]

Việc nhận diện và phân loại chính xác các loài thuộc chi này cần phái được thực hiện một cách nghiêm túc liên quan tới rủi ro về khả năng gây bệnh cùa chùng cho thực vật, động vật và cá con người Đe phàn biệt vi khuấn thuộc chi Pseudomonas

với các chi vi khuẩn khác một cách hệ thống, cần xem xét dựa trên nhiều đặc điềm:

ti lệ bazơ trong bộ gcne, trinh tự rRNA, thành phần lipid cua tế bào, sự biến dưỡng

các amino acid, các protein của tế bào [13] Một báo cáo công phu được thực hiện

bới Stanicr và các cộng sự đã mô tả chi tiết về các đặc điếm kiều hình của chi này

Hơn 200 chung cua các loài khác nhau đã trái qua các thư nghiệm kiều hình, quan trọng nhất là các thư nghiệm về dinh dưỡng [14],

Ke từ khi được phát hiện, đã có rất nhiều loài vi khuẩn được gán vào chi

Pseudomonas. Kỹ thuật lai rRNA-DNA đã cho phép phân chia lại chi này thành năm nhỏm dựa trên rRNA [15] Theo đó, rRNA nhóm I bao gồm p aeruginosa và tất cà các loài phát huỳnh quang (Pseudomonas fluorescens', Pseudomonas putida', Pseudomonas syringae ) và một so loài không phát huỳnh quang (P. stutzeri; p alcaligenes', p mendocina ) được giừ lại tên “Pseudomonas” Các nhóm còn lại được gán cho tên phân loại khác Cụ thê, rRNA nhóm 11 dôi thành chi Burkholderia

và Ralstonia', rRNA nhóm 111 đối thành chi Acidovorax, Comamonas và

Hydrogenophaga', rRNA nhóm 4 đồi thành chi Brevundimonas và rRNA nhóm 5 đổi

thành chi Stenotrophomonas [16-22],

Hiện nay, trong số các phương pháp được sử dụng để nhận diện và phân loại

chi Pseudomonas, các kỳ thuật dựa trên việc giải trinh tự gene được sử dụng phô biến

nhất mang lại hiệu quả và độ tin cậy cao [23] Dựa trên kết quả giải trình tự gene 16S rDNA bởi Moore và các cộng sự, chi Pseudomonas đã được phân thành 2 nhóm, bao

gôm p aeruginosa cluster (P aeruginosa, p resinovorans, p mendocina, p flavescens) và p fluorescens cluster (P fluorescens, p syringae, p cichorii, p

putida, p agarici) Độ tương đồng trinh tự giữa các loài vào khoảng 93,3% tới 99,9% [24] Mặc dù 16S rDNA rất hữu dụng trong việc phàn loại và nhận diện vi khuẩn,

trong một số trường hợp, nó có độ phân giải khá hạn chế ở mức độ chi và loài, do đó, các gene báo tồn khác như gyrB (DNA gyrase tiểu phần B) và rpoD (nhân tố ơ70) đã được sử dụng đế mang lại độ phân giái cao hơn [25,26] Gần đây, một kỹ thuật mới

cho việc nghiên cứu phân loại vi khuẩn là phân tích trình tự đa locus (MLST/MLSA

- Multilocus sequence typing/analysis) Phương pháp này dựa trên các đoạn trình tự dài khoáng 400 - 600 bp của các house-keeping gene thường hiện diện ở hầu hết vi

khuân Dựa trên nghiên cứu trình tự đa locus (16S rDNA, gyrB, rpoB và rpoD) chi

Pseudomonas như trước đó đã được chia thành 2 nhánh (P. aeruginosa gôm 3 nhóm

và p fluorescens gồm 9 nhóm) Các loài p oryzihabitans', p luteolcr, p pachastrelỉae

và p pertucinogena có khoảng cách di truyền xa hơn so với các loài khác nên chúng không được bao gồm trong hai nhánh nói trên [27]

Số lượng các loài thuộc chi Pseudomonas hiện nay khoảng trên 200 loài (06/2020) và liên tục được cập nhật tại http://www.bactcrio.nct

1.1.2 Đậc diêm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh thái

Theo mô ta trong hệ thống phân loại vi khuẩn cùa Bcrgcy, tế bào vi khuẩn

Pseudomonas có dạng thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, đường kính khoảng 0,5 - l,0pm, dài khoảng 1,5 - 5,0pm Hầu hết các loài thuộc chi này không tích lũy các hạt poly-p-hydroxybutyratc, nhưng tích lũy poly-hydroxyalkanoatcs với các monomer dài hơn 4C khi tãng trưởng trên môi trường chứa ankan hoặc gluconate Các tế bào không tạo choi và không được bao quanh bởi màng bao, không hình thành thế nghi, nhuộm Gram âm, di động bới một hoặc một vài lông roi ớ 2 cực (hiếm khi

không di động) Pseudomonas là các vi khuấn hiếu khí, sừ dụng oxy làm chất nhận điện từ cuối cùng, một số trường hợp có thể sử dụng nitrat làm chất nhận điện tử thay

thế và cho phép tăng trường xảy ra trong điều kiện kỵ khí Chúng không tạo

xanthomonadin, phần lớn các loài không tăng trưởng trong điều kiện acid (pH 4,5 hoặc thấp hơn), có thế tăng trướng trên môi trường khoáng tối thiểu với ammonium

hoặc nitrate là nguồn Nitrogen và một hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon và năng

lượng Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trường là khoang 28°c, mặc dù một vài loài có thề

tăng trướng ở 4°c hoặc 41°c Chúng có phán ứng Oxidase và catalase dương tính, hướng hóa, chứa các thành phần acid béo hydroxy hóa 3-OH 10:0 và 12:0, và 2-OH 12:0, và ubiquinone Q-9 Hàm lượng G+C của DNA khoảng 58 - 69%

Trên đây là một định nghĩa chính thức, tuy nhiên chưa nhan mạnh tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học của nhóm vi khuân này, chăng hạn như khà nàng phân hủy một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ, khả năng tương tác với thực vật và

liên kết với vùng rễ tạo thuận lợi cho nông nghiệp Một số chúng từ lâu đã được chứng

công bố ngày một nhiều và những hiếu biết về cơ chc liên quan ngày một tăng Chúng hiện diện rộng rãi trong tự nhicn, và có thể thích nghi tốt với nhiều ồ sinh thái khác nhau do nhu cầu dinh dưỡng đơn giàn Một sổ loài Pseudomonas là những vi khuẩn gây bệnh ở người, động thực vật và là tác nhân gây ô nhiễm thực phàm [12,28,29],

Một đặc đicrn quan trọng khác của Pseudomonas là sự sản sinh một loạt các sắc tố Các sắc tố này có thề tan trong nước và khuếch tán vào môi trường nuôi cấy hoặc liên kết với tế bào vi khuẩn Pseudomonas có thể tạo các sắc tố khuếch lán và phát huỳnh quang ở bước sóng uv 365nm Một số trong số này, như pyovcrdinc màu

vàng xanh (fluorescein) là các siderophore (các chất mang Fe) có vai trò sinh lý quan trọng trong việc hấp thu Fe ở vi khuân Pyoverdine cũng là một công cụ hiệu qua đê nhận diện Pseudomonas vì mỗi nhóm di truyền được mô tá bới các pyoverdine đặc trưng Các sắc tố khác được tạo ra bới các loài Pseudomonas bao gồm pyocyanin (P aeruginosa, màu xanh da trời), pyorubin (P. aeruginosa, màu đó), chlororaphin (P.

chỉororaphis, màu xanh lục), pyomelanin (P aeruginosa, màu đen hoặc nâu) Ngoài

ra, p mendocina còn có thê tạo ra các sắc tố carotenoid [12,29],

Các thành viên thuộc chi Pseudomonas cũng được biết là có khá năng phân hủy một phố rộng các cơ chất như hydrocarbon, các hợp chất có vòng thơm và các dần xuất của chúng Một số chất này có nguồn gốc tự nhiên như toluene, styrene,

naphthalene, phenol, các chất khác là sàn phấm cuối hoặc trung gian của các hoạt động công nghiệp như polychlorobiphenyl, dioxin, nitrotoluene [12],

1.1.3 Đặc điểm bộ gene

Bộ gone cua các vi khuẩn Pscudomonad thường có kích cỡ khoảng 5-7 Mbp

Khi so sánh với hơn 100 bộ gene vi khuân đà được giải trình tự, chi có một số ít vi khuẩn sở hữu bộ gcnc lớn hơn bộ gene Pseudomonas (ví dụ, bộ gene cua

Bradyrhizohium japonicum 9,1 Mbp) Thật vậy, bộ gene của p aeruginosa là bộ gene

vi khuẩn lớn nhất tại thời diem nó được giải trình tự [30], Bộ gene của p aeruginosa

PAO1 là trinh tự bộ gcnc vi khuẩn thứ 25 được hoàn thiện (2000) [31] Sau đó, bộ

gene cùa các loài p putida (2002) [32], p. syringae (2003) [33], p.fluorescens (2005)

[34], p entomophila (2006) [35] và p. stutzeri (2008) [36] cũng lần lượt được công

bổ Một số đặc điểm cơ bản cứa bộ gcnc được thể hiện trong Bang 1-1

Bảng 1-1 Đặc điểm bộ gene của một số loài thuộc chi Pseudomonas [37]

Các yếu tố di truyền có khả năng dịch chuyến đã được xác định ớ tất cả các

loài mà chúng được tìm kiếm Mặc dù chúng thường tuân theo các kiểu mẫu đã được

thiết lập (ví dụ như sự chèn vào các gene tRNA), nhưng cũng có sự khác biệt đáng

kể về danh tính, vị trí và hàm lượng gene chức năng, ngay cả trong các chung cùa

thẻ có chức năng trong khi nhừng yếu tố khác là tàn dư bị phân hủy), một số trình tự

mã hóa (CDS) tương tự với gcnc transposasc và trình tự liên quan đến plasmid [37]

Tỉ lệ các trình tự lặp lại trong bộ gene là một đặc điếm đơn giàn nhưng đáng lưu ý Các trình tự lặp lại trên toàn bộ gene (global repeats) bao gồm các vùng lặp lại

cùa nhiễm sắc thế, ví dụ sự lặp lại cùa các cụm rRNA, trung binh các trình tự này chiếm khoảng 4% trong bộ gene Tì lệ cùa các trình tự này phân ánh số lượng các yếu

tố có khả năng chuyển dịch trong bộ gene [30]

Bộ gene Pseudomonas có tỉ lệ các trình tự lặp lại cùng chiều nhiều hơn các trình tự lặp lại đăo ngược, xu hướng này tìm thấy trong hầu hết các bộ gene vi khuẩn

Bộ gene Pseudomonas khác biệt so với bộ gene cua các vi khuân khác ớ chồ chúng

có xu hướng giám các chuồi purine, trong khi bộ gene các vi khuân khác có xu hướng gia tăng các chuỗi này Ngược lại, những chuỗi xen kẽ pyrimidin/purine lại phổ biến

hơn trong bộ gene Pseudomonas. Khuynh hướng này có thè liên quan tới các yếu tổ môi trường và rất thú vị khi thay ràng các vi khuẩn với tỉ lệ các chuồi purine thấp

thường được dự đoán là vi khuân đàt [30],

1.2 Sự tương tác của Pseudomonas với vùng rễ thực vật

Tất cá những đặc điểm có lợi mà một vi khuẩn tiềm năng có thế cung cẩp cho

thực vật sẽ trờ nên vô hiệu nếu chúng không thê định cư thành công và bền vững trong vùng rễ hoặc trong các mô rễ của thực vật Quá trình này là kết quà của một sự cân bằng phức tạp, liên tục và mong manh giữa rất nhiều các yếu tố biotic (thực vật, bân thân PGPR, các vi sinh vật khác ) và yếu tố abiotic (chùng loại đất, hàm lượng nước và chất khoáng, pH, nhiệt độ, thành phan dịch tiết từ rề, chất dinh dường)

[28,38], Việc xác định sự đóng góp cùa các yếu tổ này cũng như mối tương tác giữa chúng là rất quan trọng đê giãi thích tại sao ứng dụng thực tế của PGPR thường không như mong đợi [28]

Hình 1-2 Mô hình hệ vi sinh vật rễ. Hệ vi sinh vật rễ bao gồm các vi sinh vật trong vùng không gian xung quanh rễ (Rhizosphere microbiome), vi sinh vật bám trên bề mặt rễ (Rhizoplane microbiome) và vi sinh vật nội sinh bên trong re (Root interior microbiome hay còn gọi là Endophyte) Nam ngoài vùng ảnh hướng cùa rễ là quần xã vi sinh vật đất (Bulk soil microbiome) Nguồn: Gaiero và cộng sự (2013) [38],

Môi quan hệ giũa PGPR và thực vật có the phân thành 2 nhỏm: rhizosphcric

và endophytic (Hình 1-2) Trong mối quan hệ rhizosphcric, PGPR có the định cư trong vùng rễ hoặc bám dính trên bề mật rễ Không phải vi khuấn đất nào cũng có thê định cư trong khu vực này vì thực vật làm thay đồi các đặc tính lý hóa cùa đất (pH,

thế nước, áp suất Oxi từng phần ) làm ánh hường tới khá năng tăng trưởng cua vi

sinh vật Trong mối quan hệ này, PGPR thực sự bám dính lên bề mặt của thực vật

Ảnh hiển vi điện tứ quét cùa vi khuẩn trên bề mặt rễ đã được công bố rộng rãi [39][40] Sự định cư cua PGPR trên bề mặt rễ thường không đồng nhất Ví dụ,

Kỉuyvera ascorbata định cư tại 2/3 phía trên cùa bề mặt rễ cây cai dầu nhưng không phát hiện vi khuẩn xung quanh chóp rỗ [41], Trong mối quan hệ endophytic, PGPR thực sự cư trú bèn trong không gian apoplast cua thực vật Mặc dù đã có một số chứng

cứ cho thấy các vi khuấn endophyte chiếm cứ các khoáng không giữa các tế bào nhưng các báo cáo này không nhiều [39],

1.2.1 Rhizospheric - Sự xâm chiếm vùng rễ thực vật

Trong môi trường đất có nguồn dinh dưỡng hạn chế và sự cạnh tranh gay gắt,

rễ cây và vùng lân cận cua chúng (rhizosphere) là nơi cực kỳ hấp dẫn cho cà các vi

hóa học sẽ thu hút các tế bào vi khuẩn [42] Sư dụng các kỳ thuật video và kính hiển

vi, Espinosa-Urgcl và cộng sự (2002) đã cho thấy các tế bào vi khuẩn Pseudomonas

có thế nhận diện dịch tiết từ hạt bấp và di chuyên hướng về hạt [43], Khả năng di

động được xem là một đặc điềm thiết yếu liên quan đen khả năng định cư tại vùng rễ Rất nhiều các hướng tiếp cận khác nhau đã được sử dụng đe xác định các gene liên

quan đến tính hướng hóa và khả năng bám dính trên bề mặt [44] Ngoài lông roi thi lóp lipopolysaccharide vi khuân, đặc biệt là kháng nguyên o, cùng với tốc độ tăng trường cao, khá năng tống hợp vitamin Bl và tiết NADH dehydrogenase cũng là

những yếu tố góp phần vào quá trinh định cư cùa p fluorescens WCS365 [28], Trong trường hợp của p putida, 180 gene có vai trò trong sự xâm chiếm vùng rễ đã được nghiên cứu chi tiết [44], Trong số đó, vai trò cúa 25 protein giúp vi khuẩn bám dính

lên các bề mặt biotic và hình thành biofilm; 13 protein liên quan đến sinh tồng họp

và lắp ráp cúa lông roi (flagella) cùng với 2 protein đáp ứng hướng hóa cùa vi khuân

đà được nhấn mạnh [44], Nghiên cứu trên các chúng đột biến cho thấy vai trò thiết

yếu của hai protein trong quá trình xâm chiếm vùng rề thực vật: (1) LapA, cùng với các gene lien quan đen sự tổng hợp và vận chuyền cua protein này (LapB, LapC, LapD) là thành phần thiết yếu nhất trong các bước khởi sự bám dính lên bề mặt thực vật, hình thành biofilm và sự định cư thành công cùa vi khuân trong vùng rề và (2) LapF đóng vai trò quan trọng ớ các giai đoạn trễ trong việc duy trì cấu trúc biofilm trong suổt giai đoạn phát triển của quá trinh xâm chiếm [45-47] Ngoài ra, vai trò cua các exopolysaccharide (EPS) như alginate, các hệ thống hấp thu sắt, các protein điều

hòa và sensor, các hệ thống đáp ứng stress và nhiều protein chưa rõ chức năng khác cũng đã được ghi nhận [44][48]

1.2.2 Endophytic - Sự nội sinh trong rễ thực vật

Hiện tượng nội sinh (endophytic) cùa các vi khuân là một hiện tượng phố biến

ở thực vật Trong sô các vi khuân nội sinh ở thực vật thuộc bộ Firmicutcs, Bacillus

và Pseudomonas là các chi chiêm ưu thế nhất [49], Rất nhiều báo cáo đã công bố sự hiện diện của vi khuân Pseudomonas trong mô rề cùa các loài thực vật khác nhau,

như Brassica napus L. (cải dầu), Calystegia soldanella L. (bìm bìm), Daucus carota

L. (cả rổt), Elymus mollỉs Trin., Tagetes spp (họ cúc), Zea mays L (bắp) [50-54].

Cơ chế liên quan đến sự xâm nhập và nội sinh bên trong thực vật cua

Pseudomonas vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ Quá trinh này có the lien quan đến một loạt các enzyme phân húy thành tế bào [55,56] Các vị trí khởi sự xâm nhập có thế là các vị trí rễ bị tổn thương, các vùng phát sinh rễ bên hoặc các vùng kéo dài và biệt

hóa cùa rễ [38,57,58], Từ các vị trí này, vi khuân có thể lan truyền tới những bộ phận khác nhau cua cây, xâm chiếm cả các mô và cơ quan bên dưới mặt đất lẫn các cơ

quan bên trên nhờ khả nàng vận chuyên nhanh theo mạch dẫn từ rề tới các mô khi sinh [28,38,59],

Bước đầu tiên cùa quá trình xâm nhập là sự ổn định của vi khuân tại vùng rễ Các sự kiện khởi đầu này, chăng hạn như sự nhận diện dịch tiết từ rễ và hướng hóa,

đã được xem xét bởi Lugtcnbcrg và cộng sự [60-62], Sau khi định cư tại vùng rề, vi

khuấn bám chặt vào bề mặt rễ (rhizoplane) Một số thành phần trên bề mặt vi khuẩn tham gia vào quá trình này Ví dụ trường hợp vi khuân Azoarcus sp BH72, thì hệ thống tiem mao kicu IV được mã hóa bới /V/AB là cần thiết cho việc bám dính, trong

khi đó ở Herhaspirillum seropedicae là vai trò cua lớp lipopolysacharide [62,63],

Các vị trí thích hợp cho sự bám dinh và xàm nhập của vi khuẩn bao gồm: vùng

chóp rễ với lớp tế bào bề mặt có vách mỏng, chăng hạn các tế bào lông hút và các tế bào đang kéo dài (đây là vùng xâm nhập chu động) và vùng gốc rễ với nhùng vết nứt nhó do sự xuất hiện các rồ bên (đây là vùng xâm nhập thụ động) [38J[39] Tại các vị

trí này, vi khuấn thường tập trung thành các vi khuẩn lạc gồm vài trăm tế bào Đối

với quá trinh xâm nhập chu động, vi khuẩn cần được trang bị các enzyme thúy phân cellulose có khá năng thuy giái vách tế bào thực vật [39,59,62], Các enzyme này cũng

liên quan đến sự cảm ứng các con đường phòng vệ ở thực vật vì nhiều protein trong

hệ thống phòng vệ và sứa chừa thường được liên kết với vách tế bào Việc cam ứng

các đáp ứng phòng vệ hạn che sự lan truyền của các vi khuân gây bệnh bên trong thực

vật Trong trường hợp các vi khuân nội sinh thì không như vậy, chúng có khá năng

độ nào đó Trong trường hợp thụ động, vi khuẩn xâm nhập thông qua các vết nứt tự

nhiên tại ví trí xuất hiện các rễ bên và dường như vô hình với hệ thống miễn dịch cúa

thực vật Quá trinh này đã được nghiên cứu ớ Azoarcus sp BH72 và Burkholderia

vietnamiensis trong lúa gạo, Burkhoỉderia phytofirmans PsJN trong cây nho, Bacillus subtil is Lu 144 và Burkholderia cepacia Lu 10-1 trong cây dâu, G diazotrophicus Pal5 trong cây mía, và Herbaspirillum seropedicae Z67 trong cây lúa [62],

1.3 Co’ chê thúc đây tăng trưởng thực vật cúa Pseudomonas

Hình 1-3 Tóm lược các CO’ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của Pseudomonas

Khi đã định cư trong vùng rễ hoặc xâm nhập và nội sinh trong rễ thực vật,

Pseudomonas thường sở hữu một hoặc nhiều đặc điểm có lợi cho sự tăng trưởng cua thực vật bao gồm: (1) tăng cường dinh dưỡng ở thực vật, (2) kích thích sự phát triền

hệ rễ, (3) bảo vệ thực vật khói các stress biotic và (4) abiotic, (5) hồ trợ hoạt động cua các PGPR khác Các cơ chế hoạt động thúc đầy tăng trương cùa Pseudomonas cỏ thể được khái quát như trong Hình 1-3 Trong thực tế, hiệu quà thúc đầy tăng trướng thực

vật hiếm khi do một cơ chế riêng 1c mà thường do tác động cộng gộp cua nhiều cơ

chế khác nhau

1.3.1 Pseudomonas hoạt động như một loại phân bón sinh học

Phân bón sinh học (biofertilizer) được định nghĩa là một “chất” chứa vi sinh

vật sống mà khi ứng dụng trên hạt giống, các bề mặt thực vật hoặc đất, chúng sẽ xâm

chiếm vùng rễ hoặc nội sinh trong thực vật và thúc đấy sự tăng trưởng bàng cách gia

tăng hàm lượng hoặc tính sằn có cùa các nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cây [39], Theo định nghía này, nhiều loài thuộc chi Pseudomonas có tiềm năng rất lớn trong việc ứng dụng làm phân bón sinh học do chúng có khá năng cố định đạm sinh học,

làm giàu các chất hữu cơ cho đất thông qua sự sán sinh cúa các enzyme thúy phân, cài thiện tính chất vật lý và hóa học cua đất, duy trì tính sẵn có cùa các chất dinh dưỡng trong đất [9][11],

1.3.1.1 Cô định đạm sinh học

Nitơ (N) là nguyên tố thiết yếu cho tất cả các sinh vật sống và nó là nguồn

dinh dưỡng quan trọng nhất ảnh hường đến sự tăng trưởng và năng suất của cày trồng Mặc dù chiếm tới 78% khi quyển, nhưng đáng tiếc là không có loài thực vật nào có khả năng cố định N? khi quyên vào các hợp chất chứa N và sư dụng chúng cho sự sinh trướng phát triển [64], Trong khi đó, một số vi sinh vật lại có khá năng chuyên

đổi N2 thành ammonia (dạng N được sừ dụng bởi thực vật) sử dụng phức hợp enzyme nitrogenase gọi là quá trình cố định đạm sinh học [65] Trong suốt một thời gian dài, các thành viên thuộc chi Pseudomonas được cho là không có khả năng cố định N2 [66], Tuy nhiên, nhận định này đã phải thay đôi khi các chủng cố định N2 lần đầu tiên

được báo cáo bởi Anderson (1958) [67], Sau đó, Krotzky và Werner (1987) đã phân

lập được 2 chúng từ rễ cây cao lương (Sorghum tricolor) [68] You và cộng sự (1991)

đà phân lập chủng Alcaligenes faecalis cố định N2 từ lúa, chủng này sau đó được xác định là p stutzeri [69][70], Cho đến nay, các chủng Pseudomonas cố dịnh N2 hầu hết được báo cáo là p stutzeri [68,70,71], Các điều kiện tối ưu và cấu trúc cùa các gene

Các PGPR cố định đạm có the được chia thành 2 nhóm: nhóm cộng sinh và

nhóm sống tự do [64] Các chúng Pseudomonas cố định đạm chú yếu là các vi khuẩn sống tự do [73], Các gene cố định đạm, được gọi là gene Mz/tìm thấy ờ cả hai phương

thức cộng sinh và không cộng sinh Nhóm này bao gồm các gcnc cấu trúc tham gia vào sự hoạt hóa của các protein Fe, sinh tống hợp các cofactor sat và molypdcn, nhận điện từ, và các gene điều hòa cần cho sự sinh tổng hợp và hoạt động chức nàng cùa

các enzyme [64,73]

Một điều thú vị là rất nhiều PGPR có kha năng cố định Nj, nhưng cơ chế dẫn

đến hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng cua chúng lại không phai từ việc cung cấp nguồn

N cho thực vật [39,60] Điều này cho thấy rằng: (1) có lẽ khá năng cổ định N? chỉ làm cho vi khuấn thích nghi với cuộc sống ở vùng rễ (nơi mà hàm lượng N rất thấp do sự

hấp thu cua thực vật), (2) mặc dù hàm lượng N cố định có thể không có ý nghĩa trong

nông nghiệp nhưng lại thực sự có lợi với thực vật trong tự nhiên Sau cùng, nhiều tác giá vẫn cho rằng khả năng cố định đạm có vai trò ít quan trọng hơn so với các cơ chế

khác trong sự thúc đẩy tăng trường thực vật của các PGPR [39],

1.3.1.2 Làm giàu dinh dường cho đát nhờ quá trình phân hủy sinh học

Pseudomonas là nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế trong đất và có khả năng phân húy các chất hữu cơ phức tạp vô cùng hiệu qua Chúng tăng cường chất dinh dưỡng

cho đất thông qua việc phân huy các vật liệu hửu cơ và làm gia tăng tính sẵn có cùa

các chất dinh dưỡng Egambcrdiycva (2007) đã nhận thay p alcaligenes PsA15 kích thích sự tăng trưởng cua bắp và tăng cường hấp thu dinh dưỡng trong điều kiện đất nghèo dinh dưỡng [74] Tương tự, Mathiyazhagan (2010) đã báo cáo p fluorescent

làm tăng sàn lượng và hàm lượng dinh dường cua chuối (Musa spp.) [75] Họ đề nghị rang các van đề môi trường do sự lạm dụng phân hóa học có thế được tối thiêu hóa

bàng việc áp dụng hiệu quá các chủng PGPR [76],

1.3.1.3 Hòa tan các hợp chất chứa Phosphorus:

Phosphorus (P) là nguyên tố then chốt thứ hai sau Nitrogen (N) trong dinh

chính cua thực vật bao gồm quang họp, chuyển hóa năng lượng, truyền tin hiệu, sinh

tổng họp các phân tứ và hô hấp Mặc dù nguồn p luôn dồi dào và có sẵn trong các loại đất ờ cà hai dạng hữu cơ và vô cơ nhưng thực vật lại không thế sừ dụng vi 95- 99% p tồn tại ở dạng không tan, dạng cố định và dạng tua Thực vật chi có thố hấp

thụ p ở dạng hòa tan (H2PO4)’ và (HPO4)2’ [64,73,77,78],

Trong đất, các PGPR có thể sử dụng các chiến lược khác nhau để sư dụng các nguồn p không tan, đong thời cung cấp cho thực vật Các chiến lược này bao gom sự hòa tan phosphate vô cơ và sự khoáng hóa các hợp chất p hữu cơ Quá trình hòa tan phosphate vô cơ chù yểu liên quan đến sự sàn sinh các phân tử acid hừu cơ, trong đó, gluconic acid và 2- kctogluconic acid đóng vai trò quan trọng nhất [77,79] Ngoài ra vai trò của các acid khác như acetic, citric, lactic, propionic, glycolic, oxalic, malonic,

succinic, fumaric và tartaric cũng đã được xác định [77,80] Các acid này là san phàm cùa quá trình biến dưỡng vi sinh vật, chủ yếu là sự oxy hóa hô hấp hoặc lên men cùa các nguồn carbon hữu cơ như glucose [80,81], Cơ chế hoạt động của chúng là hạ thấp

pH vùng đất xung quanh rề hoặc thông qua phân ứng chelate với các cation liên kết với gốc phosphate hoặc cạnh tranh các vị trí bám cua phosphate trong đất [77,79,82], Một già thuyết khác cho rằng quá trinh hòa tan p vô cơ có thể cũng liên quan đến sự tiết H+ trong quá trinh hô hấp hoặc đồng hóa ammonium [77], Gần đây, vai trò gián

tiếp cùa EPS vi khuấn trong việc hòa tan khoáng phosphate cũng đã được báo cáo EPS có khả năng bám với các ion kim loại trong đất nhờ đó hòa tan các phosphate kim loại [80,82], Sự khoáng hóa p hữu cơ trong đat liên quan đen 3 nhóm enzyme: (1) các phosphatase không chuyên biệt có khả nãng dcphosphoryl hóa từ các liên kết

phospho-ester hoặc phosphoanhydride trong các vật liệu hừu cơ; (2) các phytase có

khả năng giai phóng p từ phytic acid và (3) các phosphonatase và C-P Lyase có the cắt liên kết C-P trong các organophosphonate [77,79,80,82],

Pseudomonas là một trong sô những chi vi khuân có khả năng hòa tan phosphate mạnh mẽ nhất Rất nhiều loài thuộc chi này như p. fluorescens NJ-101, p fluorescens EM85, p aeruginosa, Pseudomonas sp., p chlororaphis, p savastanoi,

p pickettii, p ỉutea 0K2, p rhizophaerae LMG21640, p graminis DSM11363, p striata và p corrugate đã được báo cáo [79].

Những ảnh hường tích cực lên thực vật từ việc bồ sung các chủng vi sinh vật

có khả năng hòa tan và khoáng hóa p hoặc phối hợp với các PGPR khác đã được

chứng minh cã trong điều kiện in vitro lần ngoài đồng ruộng [80,81] Mặc dù các vi sinh vật này luôn có sẵn trong đất, nhưng thông thường mật độ của chúng không đủ

hiệu quả để cạnh tranh với các vi khuẩn vùng rề khác Do đô, việc bổ sung để gia tăng mật độ cùa các vi sinh vật này tại vùng rẽ là điều cần thiết [77], Thử nghiệm ánh

hường của p letiola trên sự cố định p và tăng trường của cây táo (Ligol) đã cho thấy

sự gia tăng dáng kế chiều dài chồi [83], p chlororaphis, Bacillus cereus và p

fluorescens khi thư nghiệm trên cây óc chó đã cải thiện chiều cao cây, trọng lượng khô cùa rễ và chồi cũng như kha năng hấp thụ N và p cua cây con [84], I lai công thức

dựa trên chất mang cua B cereus và p moraviensis thúc đấy sự tăng trương ở

Triticum (cây lúa mì) cũng đã được báo cáo [85] Tuy nhiên, chi riêng khả năng hòa tan p của một chủng vi sinh vật vùng rễ không làm cho chúng trở thành PGPR cũng như không phái tất cã PGPR có khả năng hòa tan p đều anh hưởng đến sự tăng trưởng thực vật bàng cách làm gia tăng hàm lượng p hiệu dụng cho cây [39], Cattelan và các cộng sự (1999) đà cho thấy chi có hai trong số năm chủng vi khuẩn vùng rễ hòa tan

p thực sự có tác động tích cực đến tăng trướng cây đậu tương [86], Freitas và cộng

sự (1997) tim thấy một sổ chúng Bacillus hòa tan p và một số chung Xanthomonas phân lập từ vùng rễ cây cai dầu (Brassica napus L.) tác động tích cực đến tăng trương thực vật, nhưng không ánh hường đen hàm lượng p cua cây [86],

r

ỉ ỉ 1.4 Hòa tan các hợp chât chứa Kali:

Kali (K) là nguyên tổ thiết yếu thứ ba cho sự tăng trưởng thực vật sau N và p

Mặc dù K là nguyên tố phong phú thứ bày trong vò quá đất, nhưng lượng K hòa tan

trong đất thường rất thấp (chi 1 - 2%), phần lớn tồn tại ở dạng khoáng không tan và không the hấp thụ bởi thực vật [87], Quá trình thâm canh và bón phân không cân đối khiến cho lượng K dự trừ trong đất nhanh chóng cạn kiệt và hệ quà là sự thiếu hụt K

đang trơ thành một trong những thách thức với sản xuất nông nghiệp Ncu không có

đú K, hệ rễ kém phát triển, tăng trưởng chậm, cho hạt nho và giám năng suất [88]

Rất nhiều PGPR có thể giãi phóng K từ các nguồn khoáng chứa K cũng như

K ở dạng hừu cơ không tan cho cây hấp thụ Việc phân lập và sàng lọc các vi sinh vật hòa tan K có thố được tiến hành trên môi trường Aleksandrov hoặc môi trường cải

biên của Rajawat [87,89], Feng Sun và cộng sự (2020) đà phân lập từ vùng rễ cùa

Mikania micrantha (cây cúc leo) được 18 chủng vi khuân hòa tan K, chu yếu thuộc các chi Burkholderia và Pseudomonas [90], Trước đó, ánh hướng cua chung p

putida cỏ khả nâng hòa tan K lên sản lượng và chất lượng trà (Camellia sinensis) đã được báo cáo bởi Bagyalakshmi và cộng sự (2012) [91J

Cơ chế hòa tan K bời PGPR có nhiều điểm tương đồng với cơ chế hòa tan phosphate Quá trinh này chũ yếu liên quan đến sự sản sinh các acid hữu cơ và sự giải

phóng proton giúp chuyến đổi K từ dạng không tan (mica, muscovite và fenspat biotit) thành dạng dễ tan cho cây hấp thụ [87,88] Các acid hữu cơ khác nhau như oxalic,

tartaric, gluconic, 2-ketogluconic, citric, malic, succinic, lactic, propionic, glycolic, malonic, fumaric và các acid khác có the giải phóng K từ dạng khoáng không tan [87,88], Ngoài việc hạ thap pH, các acid hữu cơ còn có thê giãi phóng K thông qua hoạt tính chelate (hình thành phức) với các ion liên kết với K trong các dạng khoáng như Si4+, Al3+, Fe2+ và Ca2+ [87], Ngoài ra, sự sản sinh của các polymer ngoại bào (chu yếu là protein và polysaccharide) và sự hình thành biofilm vi khuân cũng có vai

trò trong quá trình hòa tan và giái phóng K [87,92],

1.3.1.5 Duy trì tinh săn có của săt:

Sắt (Fc) là một trong những nguyên tố phố biến nhất của vỏ trái đất và là nguyên tổ thiết yểu cho sự tăng trướng và nhiều quá trinh sinh tống hợp ở thực vật (quang hợp; hô hấp; đóng vai trò là tác nhân khứ và là cofactor cũa các enzyme; tham

gia sinh tông hợp nucleoside và các amino acid) Cà vi sinh vật lần thực vật đều có

nhu cầu cao đối với Fe và đê thu nhận đu lượng Fe cho nhu cầu cúa tế bào không phái việc dề dàng Mặc dù Fe luôn có sẵn trong đất, sự thiếu hụt Fe thường xảy ra ở đất bị

vôi hóa do khả năng hòa tan kém của hydroxide Fc (111) [73], Khi pll đất vượt quá 7,

sự sẵn có cua ion Fc trong đất sẽ bị giam đáng kể Đất vôi hóa chiếm 30% đất nông

nghiệp toàn cầu và với đặc điểm pH cao, quá trình hấp thụ sắt của thực vật trên các

loại đất này trở nen vô cùng khó khăn Trong điều kiện đó, một số thực vật họ hòa thảo (cỏ, ngũ cốc và lúa gạo) tiết ra các phytosidcrophore vào đất, một số khác lại có

thể hấp thụ Fe thông qua các siderophore được tạo ra bởi vi sinh vật [93] Vi sinh vật

đã tiến hóa những cư chế chuyên biệt cho việc đồng hoá Fe, bao gồm việc sản sinh các chelate Fe gọi là siderophore, đế vận chuyển nguyên tố này vào trong tế bào [73],

Siderophore theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là những chất mang Fe (sidero - sát

và phore - chất mang) Những hợp chất chelate phân tữ lượng thấp này (<10kDa)

được tạo ra bởi các vi khuân vùng rề trong điều kiện thiếu hụt sắt (Fe) và chức nàng

chính cùa nó là cung cấp Fe cho các tế bào nhờ ái lực cao cùa chúng với Fe3* [93],

Không chi Fc, siderophore cũng hình thành phức hợp ben với các kim loại nặng khác như AI, Cd, Cu, Ga, In, Pb và Zn, thậm chí cà với các nguyên tố phóng xạ như u và

Np [94,95], Cho tới nay, đã có hơn 500 siderophore được báo cáo và 270 trong số đó

đã được xác định cẩu trúc [78],

Pseudomonas có thê tạo ra rất nhiều các siderophore khác nhau, trong đó pyoverdine hay pseudobactin là nhóm chiếm ưu thế với nhiều cấu trúc đa dạng và phức tạp [93] Bên cạnh pyoverdine, một vài chung Pseudomonas có thể tạo ra nhiều hơn một loại siderophore Một hợp chất khác có hoạt tinh siderophore được tạo ra bời

Pseudomonas là salicylic acid (SA; 2-hydroxybcnzoic acid), đồng thời cũng là tiền chất trung gian tổng hợp siderophore như pyochelin và dihydroaeruginoic acid ở p aerugionosa hoặc pseudomonine ở p fluorescens [28].

Nhiều báo cáo đã cho thay việc bố sung các vi sinh vật sinh siderophore giúp

cài thiện sự tăng trưởng của thực vật thông qua việc hỗ trợ hấp thụ Fe Phức hợp Fe- pyoverdine được tông hợp bởi p fluorescens C7 làm gia tăng hàm lượng Fe trong

mô và cái thiện sự tăng trướng cua cây Arabidopsis [96], Sự sàn sinh siderophore cua

Pseudomonas sp chung GRP3 làm giám triệu chứng chlorotic, gia táng hàm lượng

Fe và chlorophyll ơ cây đậu xanh (Vigna radiate) [97], Tuy nhiên, cũng có những ý

kiến trái chiều về tầm quan trọng cùa siderophore vi khuẩn lèn sự hấp thu Fc ở thực

vật Một sổ tác giã cho rằng đóng góp cua các siderophores đến nhu cầu Fc cua thực

vật là không đáng kề, một số khác lại đề nghị chúng có một vai trò quan trọng, thậm

chí một vai trò thiết yếu, đặc biệt là trong đất vôi [39], Bar-Ncss và cộng sự từng ủng

hộ quan diem siderophore vi khuấn hỗ trợ hấp thu Fc ớ thực vật nhưng sau đó đã kết luận ràng hai siderophore vi khuân (pseudobactin và tèrrioxamine B) không phãi là các nguồn Fe hiệu quả cho thực vật và thậm chí các vi khuân vùng rề sản sinh

siderophore có the trờ thành đối thu cạnh tranh Fe với thực vật [98,99], Anh hường

có lợi hay có hại cùa siderophore còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện thí nghiệm

và đối tượng thực vật được kháo sát Trong điều kiện gnotobiotic, sự hấp thu Fe ớ

cây đậu và cây bắp đã bị ức chế khi bố sung pseudobactin tinh khiết [100], Trong một

báo cáo khác, sự tồng hợp diệp lục tố của lúa mạch (Hordeum vulgare L.) trồng thúy canh đã được kích thích khi sư dụng ferric pscudobactin-358 làm nguồn cung cap sắt

[ 101 ] Vì những lý do trên, phần lớn các nghiên cửu về siderophore cua Pseudomonas

thường gắn với hoạt tính kiểm soát sinh học, liên quan đến sự ức chế mầm bệnh, được trình bày trong mục 1.3.3.1

1.3.2 Cảm ứng sự phát triển hệ rễ

Các PGPR không chi làm gia tăng tính sằn có cua các chất dinh dường trong

đất mà còn cảm ứng mạnh mè sự phát triển của hệ rễ làm gia tâng diện tích bồ mật

hấp thụ dinh dưỡng Dày cũng là đáp ứng phổ biến nhất ờ thực vật khi được cấy với các PGPR Trong đa số trưởng hợp, sự san sinh phytohormonc bời PGPR được cho

là nguyên nhân dẫn đến sự phát triển cua hệ rễ [39]

1.3.2.1 Sự sán sinh Indole Acetic Acid (IAA)

Trong số các chất điều hòa tăng trướng thực vật, 1AA là auxin tự nhiên phổ biến nhất được tìm thấy ở thực vật và có tác động tích cực đối với sự phát triển cùa

rễ Có tới 80% vi khuẩn vùng rễ có thể tống hợp 1AA [64,73] Sự sản sinh IAA của

vi khuấn kết hợp với auxin nội sinh từ thực vật ảnh hướng đến sụ phân chia, kéo dài

và chicu dài re vi the cung cấp cho thực vật nhiều khả năng hấp thụ dinh dường từ

đất [64,73,78] Đổi lại, 1AA vi khuẩn nới lóng thành tế bào rề và dẫn tới sự gia tăng

lượng dịch tiết rễ, cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho sự tăng trướng của vi khuấn [102,103], Khi nồng độ 1AA trong cây ờ mức tối ưu, việc bổ sung 1AA tù vi khuấn

có the có các hiệu quả trung tính, tích cực hoặc tiêu cực lên sự tăng trướng cúa thực vật [104], Xứ lý cây cài dầu với chung p putida đột biến mất khả năng sinh IAA đã thúc đẩy sự kéo dài rễ, qua đó xác nhận rằng auxin vi khuân sản sinh ở nồng độ cao

có thể làm giám chiều dài rễ [105,106],

Tryptophan (Trp) là một amino acid thường được tìm thấy trong dịch tiết rễ,

là tiền chất cho việc sinh tông hợp 1AA bới vi khuân Có ít nhất năm con đường tông

hợp IAA ơ vi khuẩn đã được mô tá (Hình 1 -4) và hầu hết cho thấy sự tương đồng với những con đường đã được mô tã ở thực vật, chi khác một vài chất trung gian: (1) con đường thông qua indolc-3-pyruvic acid và indolc-3-acctic aldehyde được tìm thấy ở phần lớn vi khuẩn như Erwinia herbicola, Agrobacterium, Pseudomonas,

Bradyrhizobium, Rhizobium, Azospirillum, Klebsiella, và Enterobacter, (2) con đường thông qua sự hình thành tryptamine như ở Pscudomonad và Azospirilla-, (3) con đường thông qua sự hình thành indole-3-acetamide đã được báo cáo ở các vi

khuân gây bệnh thực vật như Agrobacterium tumefaciens, p syringae và E.

herbicola-, các loài Pseudomonad hoại sinh như p putida và p fluorescens; (4) con đường chuyên đôi tryp thành indole-3-acetonitrile được tìm thấy ở cyanobacterium

(Synechocystis sp.) và (5) con đường không phụ thuộc vào tryp, phô biến hơn ớ thực vật nhưng cũng được tìm thấy ớ azospirilla và cyanobacteria [64]

Các nhân tổ môi trường anh hường tới sự sinh tổng hợp IAA ớ vi khuân bao gồm pH acid, stress thẩm thấu và chất nền, sự giới hạn nguồn carbon Bên cạnh đó,

yếu tố di truyền bao gồm vị trí gene và kiêu biêu hiện của gene cũng ành hường tới mức độ sản sinh IAA [107], ơ Pseudomonas savastanoipv savastanoi, các gene này định vị trên plasmid trong khi ở p. syringae pv syringae, các gene này định vị trên nhiễm sác thê Các gene định vị trên plasmid thường hiện diện nhiều bàn sao, hệ quà

là lượng IAA sản sinh bởi p savastanoi pv savastanoi cao hơn so với p syringae

pv syringae Sự sản sinh IAA ở p syringae pv syringae cũng có thê được gia tăng nhiều lần bằng cách chuyền vào một plasmid đa ban sao mang opcron sinh tổng hợp 1AA [104,107,108] Tuy nhiên, kể cả ở nồng độ thấp, các phytohormone nguồn gốc

vi khuẩn vẫn có thê đạt hiệu quả cao do chúng được sán sinh liên tục và tiết ra ngay

Tryptophan side-chain oxidase

ydrc

*■ lndota-3-acotic acid

dehydrcocnaso Ammo transferase _ IPDO

-> Indole 3 pyrưvate - — - ► Indole 3- acetaldehyde

Trp decarboxylase - — - ► Tryplamme

pp-indeponden! biosynthesis pathway

Amino oxidaee

Indole- 3-laciate Tryplcphol

Hình l-4 Tông quan ve các con đường sinh tông họp IAA ở vi khuân [107]

L3.2.2 Các phytohormone và các phán từ tin hiệu khác

Một vài PGPR tạo ra cytokinin và gibberellin nhưng vai trò cùa chúng đối với thực vật và cơ chế tổng hợp ơ vi khuẩn vẫn chưa được hiểu rõ Sự tương tác của các hormone này với auxin có thế làm thay đôi kiến trúc rễ Một số chúng PGPR có the

sản sinh một lượng tương đối lớn các gibberenllin kích thích sự tăng trương chồi

trong khi sự sản sinh cytokinin có thể tăng cường sản sinh các chẩt tiết từ rễ, làm gia tăng sự hiện diện cùa các PGPR trong vùng rẽ [7,39,106] Tuy nhiên, các vi khuân

này cũng tổng hợp các hormone khác như auxin và gibberellins, nên thật khó để khắng

định hormone nào có vai trò chu yếu trong sự thúc đấy tăng trưởng thực vật Trong một báo cáo khác, sự sản sinh cytokinin của p.fluorescens G20-18 đã được xác nhận

là yếu tố then chốt điều hòa sự phát triền cùa Arabidopsis. Khi cấy các đột biến mất

chức năng sản sinh cytokinin thì hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng không thè quan sát được [ 109] Ngoài ra, một loạt các họp chất biến dưỡng thứ cấp và các hợp chất hữu

cơ bay hơi (VOC) được tạo ra bởi vi khuân có thè cái thiện kha năng chống chịu với stress và/hoặc kích thích sự tăng trướng thực vật cũng đã được báo cáo [7], Một điều

cần lưu ý là các chùng vi khuân hoặc nấm có khá năng san sinh phytohormonc không phải lúc nào cũng là vi sinh vật có lợi như trường họp của Gibberella fujikuroi có thê sản sinh gibberellin và gây bệnh trên lúa, hay sự sản sinh IAA bời vi khuân gây bệnh

p syrỉngae [110,111]

1.3.3 Bảo vệ thực vật khởi các tác nhân gây bệnh

Các vi sinh vật gây bệnh là mối đe dọa chủ yếu và thường xuyên đối với nông

nghiệp bền vừng và sự ôn định cua hệ sinh thái đất Chúng phá vờ môi trường, làm

suy giảm độ phì cùa đất và cho thấy những ảnh hưởng có hại đến sức khoe con người

do lây nhiễm theo nguồn nước ngầm Sư dụng PGPR là một cách tiếp cận đầy hứa

hẹn đè kiêm soát tác nhân gây bệnh thực vật Trong đó, các loài thuộc chi

Pseudomonas sở hữu rất nhiều các đặc điểm giúp chúng kiêm soát bệnh hại thực vật một cách hiệu quả Các cơ che chính được sứ dụng bới Pseudomonas bao gồm: (1) cạnh tranh không gian sống và dinh dưỡng trong vùng rề; (2) sản sinh các hợp chất

đối kháng và (3) cám ứng các hệ thống kháng bệnh ơ thực vật

7.3.3 7 Cạnh tranh không gian sông và dinh dưỡng trong vùng rê

Nhiều PGPR có khá năng xâm chiếm và thiết lập nhanh chóng không gian

sổng cùa chúng trong vùng rễ thực vật và cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật

khác Việc gia tăng áp lực cạnh tranh các nguồn dinh dưỡng như c, N hay Fe trong vùng re có the làm hạn chế sự lan rộng và khả năng lây nhiễm cúa các tác nhân gây bệnh Vì thế, tốc độ và mức độ cúa quá trình xâm chiếm vùng rễ được cho là một đặc

tính quan trọng Hầu hết các chủng Pseudomonas có thời gian thế hệ ngắn, khoảng 3

- 6 giờ ngay tại vùng rễ, nơi được biết là có hàm lượng dinh dưỡng thấp hơn nhiều

so với các môi trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm [112], Trong trường hợp p

fluorescens WCS365, chúng có thê thiết lập các vi khuân lạc trên rễ cà chua chỉ một

ngày sau khi cấy [113,114], Quần the Pseudomonas được thiết lập trên be mặt rễ có the hoạt động như một “bể chứa”, giới hạn nguồn dinh dưỡng và kha năng xâm chiếm

rễ của các tác nhân gây bênh Sự cạnh tranh Fe qua trung gian siderophore, một cofactor thiết yếu cho sự tăng trưởng của sinh vật sống, là một trong những cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng được biết rõ nhất Mối liên hệ giữa khả năng sinh tống hợp

siderophore của các Pseudomonas phát huỳnh quang và khả nãng kiêm soát nấm bệnh

đã sớm được chứng minh in vitro [115-117]. Các chùng đột biến mất khả năng sinh tống hợp siderophore cho thấy sự giảm đáng kề hiệu quá đối kháng [118] Tuy nhiên,

trong một số trường hợp, siderophore từ Pseudomonas lại không thê hiện vai trò gì hoặc chi đóng vai trò phụ trong việc ức che tác nhàn gây bệnh [28], Ngoài ra, sự canh

tranh citrate và glucose bởi P. fluorescens WCS365 được cho là nguyên nhân làm trì hoàn sự nảy mầm của bào tư Fusarium oxysporum trong vùng rễ cà chua [119]

So với việc cạnh tranh dinh dưỡng, vai trò của việc cạnh tranh không gian sống trong vùng rễ bởi các chúng PGPR mặc dù đã được thừa nhận rộng rãi trong hàng thập kỷ, song vần chưa có nhiều bằng chứng thực nghiệm chứng minh nhận định này [60], Kamilova và cộng sự (2005) đã đề xuất phương pháp cho phép chọn lọc các

chủng có khả năng xâm chiếm vùng rễ hiệu quà hon nhiều lần so với chủng mô hình

là p fluorescens WCS365 [112] Kết quả nghiên cứu cho thấy bốn trong số năm

chung mới được chọn lọc không có hiệu quá kiểm soát bệnh thối rễ ớ cà chua gây ra bới F oxysporum Điều đó cho thấy, về tổng thể thì khả năng xâm chiếm vùng rễ không đú hiệu qua để kiểm soát sinh học Sau đó, Pliego và các cộng sự (2008) cũng báo cáo về hai chúng Pseudomonas sp. khác nhau được tãng cường khả năng xâm chiếm vùng rễ nhưng chi một trong hai chúng có khà năng kiềm soát bệnh thổi rễ ở

Persea Americana (cây bơ) gây ra bới Roselỉinia necatrix. Các tác giá cho rằng các chung vi sinh vật khác nhau xâm chiếm và thiết lập không gian sống cùa chúng ở những vị trí khác nhau trong vùng rễ Do đó, đê đạt được hiệu quả kiêm soát sinh học, các chúng sử dụng phải chiếm lĩnh cùng một vị trí với các tác nhân gây bệnh [120],

r ' '

ỉ.3.3.2 Sự tiêt các chát có hoạt tính đôi kháng

Pseudomonas có thê tồng hợp một loạt hợp chất biến dường và rất nhiều trong

số đó có hoạt tính đối kháng với các tác nhân gây bệnh thực vật Những tiến bộ trong

lĩnh vực giải trình tự bộ gcnc và mctagcnomic cùng với hướng tiếp cận khai thác bộ gene (genome mining) bới các công cụ sinh tin học đã dẫn tới sự khám phá rất nhiều các hợp chất mới có khả năng kiếm soát nấm, oomycctcs và vi khuẩn gây bệnh trôn

thực vật [23,28] Các công cụ dùng cho việc khám phá, dự đoán và phân tích các sản phẩm từ Pseudomonas đã được tông kết bởi Olorunleke và các cộng sự (2014) [23] Các độc tố kháng côn trùng và các chất ức chế khối u từ Pseudomonas cũng đã được báo cáo [23,121], Sự đa dạng của các hợp chất kiêm soát sinh học do các chủng

Pseudomonas tạo ra đã thực sự làm kinh ngạc các nhà nghiên cứu

Sự tiết kháng sinh được coi là một trong những cơ chế kiểm soát sinh học

mạnh mẽ nhất cũa Pseudomonas Một loạt các hợp chất có tính kháng sinh được tạo

ra bao gồm 2,4-diacetyl phloroglucinol, phenazine-1-carboxylic acid, phenazine-1- carboxamide, pyolutcorin, pyrrolnitrin, pyocyaninc, oomycin A, viscosinamide,

butyrolactones, kanosaminc, zwittcrmycin A, acruginc, rhamnolipids, ccpaciamidc A

và ccomycins đã được thào luận rất chi tiết bới nhiều nhóm tác gia

[23,78,112,121,122] Gần đây, sự sản sinh cyclic lipopeptide bởi các chủng

Pseudomonas cũng nhận được nhiều sự chú ý từ giới nghiên cứu [123] Rất nhiều yếu

tố khác nhau có thể ảnh hưởng đen sự sàn sinh các kháng sinh này như nhiệt độ, pH

và hàm lượng cùa các ion kim loại, đặc biệt là Zn2+ [112], Mặc dù sự tiết kháng sinh bới Pseudomonas là một cơ chế mạnh mẽ và hap dẫn, nhưng một môi quan tâm rõ ràng là sự xuất hiện phàn ứng kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh, dẫn đến mất

hiệu quả kiểm soát sinh học Tuy nhiên, hiệu quả cúa các kháng sinh Pseudomonas

không chí dừng lại ở việc ức chế sự tăng trướng hoặc hoạt động cua tác nhân gây bệnh mà chúng còn có thế cám ứng các hệ thống kháng bệnh ớ thực vật (xem 1.3.3.3)

Bên cạnh đó, nhiều chùng PGPR có thề tống hợp và tiết các enzym thúy giải như chitinase, dehydrogenase, p-glucanasc, lipase, phosphatases, protease tấn công vào tính toàn vẹn cua vách tế bào nấm bệnh như Botrytis cinerea, Sclerotium rolfsii,

Fusarium oxysporum, Phytophthora sp., Rhizoctonia solani và Pythium ultimum

[73,78] Chalotra và cộng sự (2019) đã quan sát thấy hoạt tính chitinase, lipase và protease ở hầu hết các chùng Pseudomonas được khảo sát [ 124]

1.3.3 3 Sự cám ứng hệ thống kháng (ISR)

1SR (Induction of Systemic Resistance) được định nghĩa là một trạng thái sinh

lý mà khã năng phòng vệ được tăng cường do sự đáp ứng với các kích thích nhất định

của môi trường và kết quả là sự phòng vệ bấm sinh cùa thực vật có thể chống tại những tác động tiếp theo của các tác nhân gây bệnh [125],

Quá trình “mồi sinh học” (biopriming) bởi một số PGPR có thể kích hoạt sự kháng hệ thống với một phổ rộng các tác nhân gây bệnh ở thực vật Các bệnh do nấm,

vi khuẩn, virus và thậm chí trong một số trường hợp, sự phá hoại cua côn trùng và tuyến trùng cũng có thể giám nhờ ứng dụng các chứng PGPR [60,121,126], Một số

nghiên cứu cho thấy, khi được “moi” bằng cách cay Pseudomonas spp vào vùng rề thực vật, mức độ biêu hiện các gene ờ lá không có sự thay đồi đáng kế trong khi sự thay đòi biêu hiện một so gene ở rễ đà được ghi nhận tuy không rõ rệt [122] Hệ quà khi được “mồi” bời vi khuân là thực vật phản ứng nhanh hơn và mạnh hơn khi chúng

bị tấn công bởi các tác nhân gây bệnh [122,126] Nghiên cứu trên các đột biến A

thaliana đã chí ra 1SR liên quan đến con đường tín hiệu jasmonate và ethylene được điều hòa bới NPR1, đã kích hoạt các phán ứng phòng vệ cua cây [28,122,126] Khác

với trường hợp kháng do mắc phải (SAR-Systemic Acquired Resistance), sự tích lùy

cua salicyclic acid không có nhiều ý nghĩa trong 1SR [28,122,126], Sự hoạt hóa cúa các protein liên quan đến bệnh (PR - Pathogenesis- Related Proteins) được xem là

các marker cua SAR (PR-1, PR-2, PR-5) đã không được ghi nhận trong trường hợp ISR gây ra bởi p fluor escens WCS417 [126], Mặc dù vậy, một số báo cáo khác đã ghi nhận sự tích lũy cùa các protein này [121], ISR cũng làm thay đôi cấu trúc và siêu cấu trúc cua vách tế bào thực vật như sự làm giàu callose hoặc sự lignin hóa, đồng thời cũng dẫn đen những thay đối về sinh lý và sinh hóa trong cây như sự tổng hợp

các phytoalcxin, một số enzyme như peroxidase, các protein hòa tan và các chất biến

dưỡng thứ cấp khác [1211(127]

Các tín hiệu gây ra ISR bời Pseudomonas đã được xem xét và báo cáo bởi nhiều nhóm nghicn cứu Có thê ke đến là Phl trong trường hợp cúa CHAO, salicylate,

pyocyanin và pyochclin, lipopolysaccharide, lông roi, siderophore, lipopcptidc vòng,

2, 4-diacetylphloroglucinol, lactone homoserine, và các voc như acetoin và 2, 3- butanediol [28,60,121,122], Trong nhiều trường hợp, rất khó để xác định elicitor chuyên biệt cho ISR Vi thế các nhà nghiên cứu cho rằng đó là sự kết hợp cua siderophores, O-antigens và flagella [122] Phức tạp hon, nó còn khác nhau giừa các chung và phụ thuộc vào đối tượng thực vật nghiên cứu [122],

1.3.3 4 Quorum-Sensing (QS) vá sự nhiêu tín hiệu

ọs là một cơ chế điều hòa biểu hiện gene được tìm thấy ơ nhiều loài vi khuân

Nó đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh lý, phát triền và đáp ứng cua

vi khuấn với môi trường Cơ chế này dựa trên sự sàn sinh và sư dụng các phân tử tín hiệu nhỏ chuyên biệt gụi là autoinducer, cho phép các tế bào vi khuân “giao tiếp” với

nhau Bằng cách sán sinh và “cảm nhận” sự tích lũy cua các phân tử tín hiệu, vi khuân

có thê giám sát mật độ quần thê của chúng và thay đổi sự biêu hiện cùa các gene mục

tiêu Hệ thống QS điều hòa nhiều quá trình như sự tống hợp kháng sinh, sự hình thành biofilm, sự phát quang sinh học, sự hình thành nội bào tứ và thậm chí là sự biếu hiện cua các nhân tố gây bệnh [28]

Hâu hêt vi khuân chi biêu hiện các nhân tô gây bệnh (các enzyme phân húy thành tế bào và các phytotoxin) khi ở mật độ cao, được “cảm nhận” thông qua sự tích

lũy cùa các phàn tử tín hiệu như N-acyl-l-homoserine lactone (AHL) trong môi trường Ví dụ trường hợp bệnh do Erwinia carotovora, AHL là cần thiết cho sự tống hợp các enzyme phân huy thành tế bào Sự nhiễu tín hiệu là cơ chế kiếm soát sinh

học thông qua sự phân hủy các phàn tứ tín hiệu như AHL bởi các PGPR [60,121] Các voc tạo ra bới Pseudomonas có thè phá hóng ọs ờ nhiều tác nhân gây bệnh thực vật như Agrobacterium, Chromobacterium, Pectobacterium và cả

Pseudomonas, từ đó ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh cua chúng [121], Ngoài ra,

sự phân húy cua AHL cũng ánh hưởng đến khá năng hình thành biofilm và làm cho

chúng dễ bị kiểm soát sinh học hơn [60]

1.3.4 Báo vệ thực vật khói các điều kiện bất lọi của môi trường

Điểm mấu chốt đế một chùng PGPR có thế hoạt động hiệu quả trong điều kiện

thực tế là khá năng tồn tại của chúng trong điều kiện sổng bất lợi và liên tục thay đối

Pseudomonas có khả năng biến dường vô cùng linh hoạt và khá năng tồn lại trong những điều kiện stress đa dạng Sự hình thành biofilm và sàn sinh EPS không chi giúp chúng có thể chổng chịu với stress hạn, stress mặn, nhiệt độ cực đoan, nồng độ cao cua các chất ô nhiễm mà còn có thổ bảo vệ thực vật duy trì dược sự tăng trương

ồn định dưới những điều kiện stress này [76], EPS có thô liên kết với các cation, bao

gồm cá Na+ cho thay vai trù trong việc giam nhẹ stress mặn cho thực vật [ 128] Trong trường hợp stress hạn, chúng vừa giúp vi khuân duy trì được sự tăng trưởng vừa bào

vệ thực vật khói sự khô hạn [73,76]

Sự sàn sinh ACC-dcaminasc bởi các PGPR cũng là một cơ chê quan trọng

giúp thực vật vượt qua stress Ethylene là một phytohormone ở dạng khí, chịu trách nhiệm trong đáp ứng khởi tạo rễ, ức chế sự kéo dài rễ, thúc đẩy quá trình chín cua

quá, thúc đấy sự héo non, kích thích sự náy mầm cúa hạt, thúc đẩy hiện tượng rụng

lá, kích hoạt quá trình tổng hợp các hormon thực vật khác Nồng độ cao của ethylene

ức chế sự phát triển hệ rồ, cam ứng sự rụng lá và các quá trinh khác cua tế bào có thồ dần đến giam năng suất cây trồng [39,73] Dưới những điều kiện stress như hạn, mặn, nhiệt, hoặc sự hiện diện cua nồng độ cao các chất ô nhiễm, nồng độ ethylene trong cây gia tăng do sự gia tăng tiền chất của nỏ là ACC dần đến làm tổn thương hệ rễ Rất nhiều PGPR sản sinh ACC deaminase, có the be gãy ACC thành ammonia và a- ketobutyrate và vì thế làm giảm sự sản sinh ethylene, giâm ảnh hường cùa stress

[129] Sự hiện diện cùa ACC-deaminase đã được báo cáo ở rất nhiều chủng

Pseudomonas [130132],

Bên cạnh đó, nhiều báo cáo cũng cho thấy Pseudomonas làm gia tăng hoạt động cùa các enzyme chổng oxy hóa trong cây (catalase, peroxidase, glutathion và ascorbate) hoặc bàng cách làm giảm ảnh hướng của stress vì thế làm giảm nồng độ cua các gốc oxy hóa [76], Tương tự, sự tích lũy các chất tan tương ứng với stress cũng là một chiến lược phô biến ở thực vật Hcidari và cộng sự (2011) đã quan sát thấy các cây được cấy với Pseudomonas sp có thề gia tàng tính chống chịu với stress bang cách tăng cường khả năng tích lũy proline so với các cây không cấy vi khuẩn [133],

Các chung p tolaasii and p.fluorescens kháng Cadmium (Cd) đà thúc đây sự tăng trưởng cua Brassica napus (cải dầu) dưới điều kiện stress gày ra bơi Cd [134], Trong trường hợp này, sự thúc đấy tăng trường thực vật trong điều kiện stress là hiệu quả tích lũy cua nhiều đặc điếm như khả năng san sinh IAA, siderophore và ACC deaminase

1.3.5 Vai trò như một vi khuân trợ giúp

Trong nhiều trường hợp, Pseudomonas không chĩ hoạt động như một PGPR đơn độc mà còn đóng vai trò như những vi khuấn trợ giúp (Helper bacteria), hỗ trợ hoạt động của các PGPR khác Nhiều nghiên cứu đã kiêm tra hiệu quà phối hợp khi

đồng nuôi cay các nhóm vi sinh vật vùng rề khác nhau, kết qua cho thấy sự phối hợp này thường dần đen hiệu qua cao hơn so với áp dụng từng chung riêng lè Các sự phối hợp có thể là Pseudomonas với nấm hoặc Pseudomonas với các chi vi khuẩn khác hoặc phối hợp giữa các loài Pseudomonas khác nhau

Sự kết hợp của các loài nấm với Pseudomonas thường gặp nhất là Arbuscular mycorrhiza (AM) [78] Đồng nuôi cấy p fluorescens 92rk và G mosseae BEG 12 có hiệu quả cộng hướng lên trọng lượng tươi cua rễ, biến đồi kiến trúc rễ, thúc đấy sự tăng trưởng và tăng cường khả năng hấp thụ p ở Solanum lycopersicum (cây cà chua)

Sự gia tăng các vị trí có sự xâm nhiễm của nấm rề khi được cay với p fluorescens

92rk đề nghị rằng chúng này hoạt động như một vi khuân trợ giúp [135] Tuy nhiên, mối quan hệ giữa Pseudomonas và AM không phải lúc nào cũng là tương tác dương