vũ quỳnh mai nghiên cứu lựa chọn chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông khô để tạo nguyên liệu probiotic chứa bacillus spp

LỜI CẢM ƠN Đề tài “Nghiên cứu lựa chọn chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông khô để tạo nguyên liệu probiotic chứa Bacillus spp.” được thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn Công nghệ sinh

TỔNG QUAN

Vài nét về probiotic

Thuật ngữ probiotic là “for life”, nghĩa là “dành cho cuộc sống” và hiện nay được dùng để gọi tên VSV có lợi cho người và động vật Năm 2001, hội nghị chuyên gia tư vấn của các nhà khoa học quốc tế làm việc thay mặt cho Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đề xuất định nghĩa mới cho probiotics như sau: “các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [31]

Khi quần thể vi sinh vật bên trong cơ thể vật chủ bị phá vỡ, chế phẩm probiotic được đưa từ ngoài vào cơ thể có thể tạm thời thiết lập sự xâm chiếm trong đường ruột, khôi phục sự ổn định chức năng cho hệ vi sinh vật trong đường ruột Thông qua các cơ chế, probiotic phát huy tác dụng một cách đa dạng và nhiều mặt, bao gồm việc sản xuất các chất kháng khuẩn như điều hòa phản ứng miễn dịch, giảm nguy cơ dị ứng, tiết IgA để chống lại mầm bệnh tiềm ẩn, tăng cường chức năng hàng rào niêm mạc ruột, thúc đẩy sự phục hồi hệ vi sinh vật đường ruột, giải phóng các protein chức năng như enzyme tự nhiên hoặc lactase, cùng với đó là ức chế sự bám dính của mầm bệnh [59]

Cụ thể, probiotic có vai trò trong một số bệnh sau: [22]

 Điều trị một số bệnh tiêu hóa:

- Phòng ngừa tiêu chảy do một số vi khuẩn và virus gây bệnh

- Điều trị nhiễm Helicobacter pylori và các biến chứng

- Sàng lọc sớm bệnh ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC)

- Khắc phục triệu chứng bệnh viêm ruột và hội chứng ruột

 Tăng cường chức năng hệ miễn dịch

 Giảm nguy cơ bị dị ứng

Sử dụng men vi sinh ở người khỏe mạnh

Hệ vi sinh vật đường ruột nhạy cảm với nhiều yếu tố như chế độ ăn uống và độ tuổi Ngay cả ở những người có vẻ khỏe mạnh, những thay đổi về chất lượng chế độ ăn uống và lượng rượu nạp vào có thể ảnh hưởng đáng kể đến hệ VSV trong đường ruột Một chế độ ăn nghèo trái cây và rau quả (như một nguồn prebiotic tốt) có thể không cung cấp thực phẩm cần thiết cho sự tồn tại và duy trì probiotic Điều này có thể giải thích nhu cầu thường xuyên về thực phẩm và chất bổ sung probiotic để duy trì sự cộng sinh và sức khỏe đường

3 ruột Việc bổ sung men vi sinh cần phải một quá trình liên tục để duy trì sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột ở người trưởng thành khỏe mạnh [35]

Những lo ngại về an toàn của probiotic

Một số chủng probiotic nhất định có thể hoạt động như mầm bệnh cơ hội ở những quần thể bị suy giảm miễn dịch, người già hoặc trẻ sơ sinh.Ví dụ như khi hàng rào ruột bình thường bị phá vỡ, men vi sinh có thể xâm nhập vào hệ tuần hoàn, dẫn đến nhiễm trùng xâm lấn Nói chung, ở những nhóm người dễ bị tổn thương, khi có yếu tố nguy cơ như tình trạng suy giảm miễn dịch thì cần thận trọng khi sử dụng men vi sinh [42]

Probiotic có thể bị tổn thương hoặc mất khả năng sống sót do các điều kiện bất lợi trong quá trình sản xuất một số loại thực phẩm hoặc trong quá trình đi qua dạ dày của người, động vật Để khắc phục những hạn chế đó, việc nuôi cấy probiotic tạo bào tử sẽ tăng khả năng chống chịu với môi trường khắc nghiệt Cụ thể, một số loài có khả năng hình thành bào tử như chi Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus và Brevibacillus Khả năng đề kháng cao của bào tử vi sinh vật với nhiệt độ cao, độ pH thấp và áp suất cao, cùng với các đặc tính như độ ổn định tốt và nảy mầm nhanh khi gặp điều kiện thích hợp, khiến việc sử dụng chúng trở nên được ưa chuộng đối với công thức cải tiến của một số loại thực phẩm probiotic [55]

Khái quát về Bacillus clausii

 Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey 1994 (Bergey’s manual of determinative bacteriology), Bacillus clausii thuộc: Bộ: Eubacteriales - Họ: Bacillaceae - Chi: Bacillus - Loài: Bacillus clausii [14]

Phân bố của Bacillus clausii đã được xác định trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm rễ của cây Ononis angustissima Lam tại Algeria (chủng GM17) và trong các mẫu đất bị ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ.

 Hình thái: là vi khuẩn gram dương, có khả năng hình thành bào tử, di động, hình que, hiếu khí, xâm chiếm ruột ngay cả khi có kháng sinh B clausii ưa kiềm, có kích thước tế bào dao động từ 0,5 àm đến 0,7 àm chiều rộng và 2 àm đến 4 àm chiều dài [39], [9], [8]

Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus clausii [5] Hình 1.2 Bào tử Bacillus clausii [68]

 Đặc tính sinh lý: B clausii có khả năng chịu nhiệt, acid và muối mật; giúp tăng cường chức năng hàng rào ruột; có khả năng kháng kháng sinh phổ rộng và tự tổng hợp được vitamin [25]

 Đặc tính sinh hóa: B clausii có khả năng sản xuất catalase và oxydase, thủy phân casein, gelatin, tinh bột và khử nitrat, nhưng không thủy phân Tween 20 và Tween

Các loài B clausii N/R, T, O/C, SIN có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí Mỗi chủng sẽ có điều kiện nuôi cấy thích hợp khác nhau Trong môi trường kiềm (pH 8 và 10) năng suất tăng trưởng của các loài B clausii O/C, N/R, SIN và T tương đương nhau, trong khi ở pH 7, tỷ lệ O/C và SIN cao hơn Chủng DSM 8716T được tối ưu cho hoạt động ở pH

8 [16] B clausii KSM-16 có tốc độ tăng trưởng tối ưu ở pH 9 ở 40°C [57]

1.2.3 Tác dụng sinh học của Bacillus clausii

 Chức năng miễn dịch đường ruột: Tăng cường chức năng hàng rào ruột Điều trị bằng các chủng B clausii làm giảm tỷ lệ tế bào ruột bị hoại tử hoặc chết theo chương trình cũng như tăng sản xuất chất nhầy và tổng hợp các protein liên kết chặt chẽ, tăng tính toàn vẹn của hàng rào ruột [25]

 Hoạt động kháng khuẩn và điều hòa miễn dịch:

Bacillus clausii là vi khuẩn có khả năng sản sinh clausin, một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Clausin từ chủng B clausii UBBC07 có tác dụng chống lại các vi khuẩn Gram dương Trong khi đó, clausin từ chủng O/C của B clausii không chỉ ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương mà còn vô hiệu hóa độc tố của Clostridium difficile.

- Điều hòa miễn dịch: Khi dùng cho chuột mắc bệnh hen suyễn do ovalbumin gây ra, B clausii làm giảm số lượng bạch cầu ái toan, bạch cầu trung tính và tế bào lympho cũng như làm giảm độ dày của biểu mô đường thở [25]

- Ức chế vi khuẩn đường ruột: B clausii có khả năng ngăn ngừa nhiễm trùng đường ruột Ở chuột bị nhiễm vi khuẩn E coli O127:H21, các nhung mao ruột bong ra, quan sát thấy các tổn thương và thâm nhiễm tế bào lympho Xử lý trước bằng bào tử B clausii O/C, N/R, SIN và T làm giảm tổn thương, thâm nhiễm tế bào lympho, mảnh vụn đường ruột và làm tăng tế bào tiết hình trụ trong biểu mô đường tiêu hóa có chức năng tiết chất nhầy [25]

1.2.4 Khả năng hình thành bào tử

Khi điều kiện môi trường khắc nghiệt, vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử sẽ trải qua một quá trình phát triển phức tạp và biệt hóa thành bào tử Bào tử được hình thành trong khoang tế bào mẹ của một tế bào sinh bào tử Khi tế bào mẹ ly giải, bào tử sẽ được giải phóng ra môi trường và là dạng sống sót có khả năng chống chịu cực kỳ tốt với hầu hết các yếu tố bất lợi của môi trường Bào tử có ít hoặc không có hoạt động trao đổi chất nên bào tử có thể tồn tại vô thời hạn trong điều kiện không có nước, chất dinh dưỡng, nhiệt độ khắc nghiệt, độ pH, tia cực tím, các hóa chất độc hại và có thể chịu được muối mật, tồn tại trong môi trường acid của đường tiêu hóa Do đó, bào tử ổn định hơn dạng sinh dưỡng trong các điều kiện khắc nghiệt của môi trường [51]

Các bào tử có thể tồn tại nhiều năm ở trạng thái không hoạt động, nhưng nếu được kích thích thích hợp bằng chất nảy mầm, các bào tử có thể nhanh chóng mất đi các đặc tính tiềm ẩn và kháng thuốc trong quá trình nảy mầm và chuyển thành tế bào sinh dưỡng Có một số loại tác nhân khác nhau kích hoạt sự nảy mầm của bào tử như chất dinh dưỡng, peptidoglycan, dodecylamin, … [51] Ưu điểm vượt trội của bào tử Bacillus clausii :

Trong khi một số chủng như B anthracis gây bệnh, chủng B clausii lại an toàn và có lợi Chủng này được Cơ quan an toàn Thực phẩm Châu Âu cấp trạng thái “Giả định đủ điều kiện an toàn (QPS)” và FDA công nhận là an toàn để sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm [17]

Bào tử của B clausii (O/C, N/R, SIN và T) có khả năng tồn tại ít nhất 120 phút trong dịch dạ dày mô phỏng, trái ngược với các chế phẩm sinh học khác, phần lớn trong số đó trải qua một giảm khả năng sống sót sau 30 phút tiếp xúc với dịch dạ dày B clausii (O/C, N/R, SIN và T) là những chủng duy nhất thể hiện khả năng sống sót và sinh sản sau 240

6 phút tiếp xúc với dịch ruột mô phỏng, tại thời điểm đó, phần lớn các chế phẩm sinh học được thử nghiệm khác đều trải qua giảm đáng kể khả năng sống sót [25]

Khái quát về Bacillus subtilis

 Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey 1994, Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales - Họ: Bacillaceae - Chi: Bacillus - Loài: Bacillus subtilis [14]

 Phân bố: Phân bố rộng rãi trong đất, không khí, bụi và vật liệu đang phân hủy

Bacillus subtilis được tìm thấy tự nhiên trong một số thực phẩm lên men làm từ đậu nành ở châu Á và châu Phi [14]

 Hình thái: là vi khuẩn gram dương, tạo ra nội bào tử cho phép tồn tại trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt bao gồm nhiệt độ, acid và hút ẩm, là vi khuẩn hiếu khí, hỡnh que dài 2–6 àm và đường kớnh chỉ nhỏ hơn 1 àm [21]

Hình 1.3 Tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis độ phóng đại 1000 [68]

Hình 1.4 Bào tử Bacillus subtilis nằm trong dạng sinh dưỡng ở độ phóng đại

 Đặc tính sinh lý: tạo ra bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng (ức chế sự phát triển và sinh sản của Staphylococcus aureus, Enterococcus, Salmonella và E coli) và ổn định nhiệt tốt Hơn nữa, giá trị pH ít ảnh hưởng đến sự ổn định hoặc hoạt động Vì vậy, nó có tiềm năng lớn để sử dụng thay thế cho thuốc kháng sinh

Trước đây, B subtilis được phân loại là sinh vật hiếu khí nghiêm ngặt Gần đây, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng B subtilis có thể phát triển được trong điều kiện yếm khí, bằng cách sử dụng nitrat hoặc nitrit [44] Bacillus subtilis BSB1 phát triển với điều kiện tối ưu ở 46,9°C và pH 6,8 Đối với chủng B subtilis BZR 336 g, nhiệt độ nuôi cấy tốt nhất là

25,0°C; chủng B subtilis BZR 517 phát triển tốt nhất ở 30,0 °C, và pH tối ưu của môi trường là 7,0–8,0 [54]

B subtilis có thể phát triển trong môi trường chứa glucose, malate và các loại đường đơn giản khác cung cấp nguồn carbon và muối amoni hoặc một số acid amin nhất định làm nguồn nitơ [29]

 Làm giảm các triệu chứng tiêu hóa

Bổ sung chế độ ăn uống 2 × 10 9 CFU Bacillus subtilis BS50 mỗi ngày là một chiến lược an toàn và dung nạp tốt để giảm bớt các triệu chứng tiêu hóa liên quan đến đầy hơi ở người trưởng thành khỏe mạnh [23]

B subtilis DE111 liều ở mức 1 tỷ CFU/ngày có thể cải thiện tình trạng táo bón thường xuyên và tiêu chảy đồng thời giúp duy trì sức khỏe đường tiêu hóa [10]

 Cải thiện lipid máu và chức năng nội mô

Việc bổ sung Bacillus subtilis làm tăng cường sản sinh SCFA, từ đó dẫn đến tác dụng giảm cholesterol đối với cholesterol TC, LDL và non-HDL, mặc dù HDL-c không bị ảnh hưởng Giảm nồng độ cholesterol có tác dụng lớn trong việc giảm nguy cơ phát triển bệnh tim mạch vành (CHD) [61]

1.3.4 Khả năng hình thành bào tử

Quá trình tạo bào tử của B subtilis bắt đầu bằng sự hình thành vách ngăn cực chia tế bào sinh bào tử thành tế bào mẹ lớn và bào tử nhỏ Bào tử sau đó được bao bọc bởi tế bào chất của tế bào mẹ và trưởng thành bên trong đó Cuối cùng, tế bào mẹ tan rã giải phóng bào tử trưởng thành vào môi trường Bào tử có nhiều lớp bảo vệ và lõi mất nước, giúp chúng có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt.

Quá trình đông khô

1.4.1 Đặc điểm của phương pháp đông khô vi sinh vật Đông khô là một thuật ngữ áp dụng cho quy trình đóng băng và thăng hoa nước từ bề mặt lạnh của các chế phẩm đông lạnh trong điều kiện chân không và nhiệt độ thấp, tạo thành sản phẩm khô có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng và sản phẩm ở dạng bột

 Ưu điểm của phương pháp đông khô: tăng khả năng sống sót của vi sinh vật do:

- Phương pháp này không tạo ra sự tăng trưởng vì hoạt độ nước (aw) bằng 0 [63]

Hạn chế sử dụng nhiệt độ cao vì hầu hết các dạng sinh dưỡng của vi sinh vật đều nhạy cảm với nhiệt độ Phương pháp sấy ưa thích đối với vi sinh vật là đông khô.

 Ưu điểm của bột đông khô trong nguyên liệu probiotics:

- Khi sử dụng dạng bột rắn, dược chất và tá dược sẽ được cố định, do đó làm giảm đáng kể các con đường phân hủy hóa học và vật lý, chẳng hạn như thủy phân, oxy hóa, racemic hóa Do đó, nguyên liệu probiotics đạt được độ ổn định kéo dài, ngay cả ở nhiệt độ môi trường

- Nguyên liệu probiotics dạng rắn sẽ dễ dàng xử lý bao bì, bảo quản và giảm chi phí vận chuyển

- Ngược lại với những ưu điểm nêu trên, sản phẩm đông khô có một số nhược điểm như không thuận tiện khi sử dụng (như dung dịch vô trùng sẵn sàng sử dụng); sản phẩm đông khô yêu cầu các bước hoàn nguyên trong quá trình sử dụng (việc đảm bảo tính vô trùng có thể bị ảnh hưởng); và do chi phí sản xuất và thiết bị đắt tiền nên các sản phẩm đông khô nhìn chung đắt hơn các sản phẩm sẵn sàng sử dụng [13]

 Ứng dụng của chế phẩm bột đông khô:

Hình 1.5 Men vi sinh Enterobella

- Được sản xuất tại công ty cổ phần

- Dạng bào chế: thuốc bột – chứa khoảng 10 9 CFU Bacillus clausii trong gói 1g thuốc bột

- Chỉ định: phòng ngừa và điều trị rối loạn tiêu hóa

Hình 1.6 Men vi sinh Bidisubtilis [67]

- Được sản xuất tại Công ty Bidiphar

- Dạng bào chế: thuốc bột – chứa 100 triệu tế bào Bacillus subtilis

- Chỉ định: hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón và hỗ trợ điều trị loạn khuẩn khi dùng kháng sinh

1.4.2 Các giai đoạn của quá trình đông khô

Quá trình đông khô bao gồm ba giai đoạn sau: (1) giai đoạn đông lạnh, (2) giai đoạn sấy sơ cấp và (3) giai đoạn sấy thứ cấp [38]

Khoảng 95% lượng dung môi được chuyển thành chất rắn đông lạnh trong giai đoạn này Quá trình đông lạnh bao gồm 3 giai đoạn: (1) giai đoạn làm mát, (2) giai đoạn chuyển pha, (3) giai đoạn đông đặc Bước này quyết định hình thái, kích thước của tinh thể băng, từ đó ảnh hưởng đến một số thông số như độ bền của sản phẩm khô, tốc độ sấy sơ cấp và thứ cấp, mức độ kết tinh của sản phẩm, diện tích bề mặt riêng và khả năng hoàn nguyên của sản phẩm sấy khô [38]

1.4.2.2 Sấy sơ cấp (Thăng hoa)

Băng được loại bỏ thông qua quá trình thăng hoa, ở nhiệt độ và áp suất thấp Khi dung môi (nước đá) thăng hoa, lớp bên trên được thăng hoa và dần tạo ra một lớp vỏ xốp của vật liệu khô Hơi dung môi (nước) bay hơi được vận chuyển qua lớp vật liệu khô xốp Thời điểm không còn lớp đóng băng nữa chính là thời điểm kết thúc giai đoạn sấy sơ cấp [38]

1.4.2.3 Sấy thứ cấp (Giải hấp)

Nước không đóng băng ở giai đoạn tiền đông (“nước liên kết”) sẽ được loại bỏ thông qua quá trình giải hấp và hơi giải hấp được vận chuyển qua các lỗ rỗng của vật liệu được sấy khô ở áp suất thấp và nhiệt độ cao hơn so với sấy sơ cấp Sấy thứ cấp thường được thực hiện ở nhiệt độ từ 25°C trở lên [46]

Chất bảo vệ lạnh

Trong quá trình đông khô, các tế bào vi khuẩn chịu áp lực thẩm thấu do hoạt độ nước của môi trường giảm và sự gia tăng các chất hòa tan tích lũy bên ngoài Sự hiện diện của chất bảo vệ lạnh giúp duy trì khả năng sống sót tốt bằng các cách như: i, thay đổi độ nhớt trong tế bào vi khuẩn; ii, tham gia vào các tương tác trực tiếp giữa các phân tử; iii, điều chỉnh hoạt động của nước bên trong vi khuẩn; và iv, thay đổi mô hình tạo mầm băng bằng cách làm chậm quá trình hình thành và/hoặc thay đổi kích thước của hạt nhân băng trong quá trình đông đặc

Một cơ chế khác có thể cải thiện khả năng sống sót của tế bào khi đưa chất bảo vệ lạnh vào môi trường sấy khô là giả thuyết thủy tinh hóa, đó là khả năng của chất bảo vệ lạnh tạo thành ma trận thủy tinh bảo vệ trong quá trình đóng băng, trong đó các tế bào được bao phủ Trong ma trận thủy tinh bảo vệ, tất cả các quá trình kiểm soát khuếch tán có thể gây bất lợi đều bị chậm lại, do đó nâng cao khả năng sống sót của vi khuẩn trong quá trình bảo quản lâu dài [45]

Ngoài ra, việc bổ sung chất bảo vệ lạnh làm tăng phần không đông lạnh của tế bào, mang lại nhiều không gian hơn cho vi sinh vật, dẫn đến ít tổn thương tế bào hơn do lực cơ

10 học hoặc áp lực thẩm thấu Do đó, việc lựa chọn chất bảo vệ lạnh là một khía cạnh rất quan trọng của quá trình đông khô [27]

1.5.2 Một số chất bảo vệ lạnh trong quá trình đông khô

- Chất có trọng lượng phân tử nhỏ: acid amin, đường phân tử thấp

- Chất có trọng lượng phân tử lớn: protein, polysaccharide, polymer [18]

1.5.2.1 Các loại đường [45] Đường disaccharide (saccharose, lactose, trehalose) và đường oligomer (maltodextrin) được ưa thích làm chất phụ gia cho quá trình đông khô không chỉ vì chúng có thể dễ dàng thủy tinh hóa mà còn vì chúng là những cấu trúc phân tử nhỏ có thể dễ dàng thay thế các phân tử nước bị loại bỏ trong quá trình sấy và do đó duy trì tính toàn vẹn của tế bào Các phân tử nước hoạt động như những miếng đệm giữa các đầu phospholipid, ngăn cản chúng cọ xát với nhau và sau đó gây ra phản ứng chuỗi acyl Phản ứng dây chuyền này tạo ra lực VanderWaals, làm thay đổi trạng thái chất lỏng trong tế bào sang pha giống gel nhớt hơn Sau khi bù nước, quá trình quay trở lại pha giống dạng tinh thể lỏng không đồng nhất do tính chất không đồng nhất của các lớp phospholipid Điều này dẫn đến khiếm khuyết bên trong tế bào, tế bào mất đi tính toàn vẹn của màng và dẫn đến chết tế bào Do đó, trong quá trình khử nước, việc thay nước bằng các phân tử đường khi thấm qua màng tế bào giúp giữ lại cấu trúc vững chắc vốn có của màng tế bào sau quá trình đông khô

Thành phần chính của sữa gầy là protein và lactose Sữa gầy tạo ra cấu trúc xốp trên bề mặt tế bào thúc đẩy quá trình bù nước Sữa gầy là một chất bảo vệ không thấm nước, tạo thành lớp protein vững chắc phủ ngoài vi khuẩn.

Các phương pháp sấy khô sử dụng nhiệt độ cao thường không được khuyến khích do nhiệt độ sản phẩm vượt quá ngưỡng nhiệt độ tới hạn (Tg'), dẫn đến bất ổn định của sản phẩm Do đó, các thành phần có Tg cao như lactose được thêm vào để tăng Tg' trong quá trình đông khô Lactose có thể thủy tinh hóa dễ dàng, tạo nên ma trận thủy tinh, tương tác với protein và màng tế bào thông qua liên kết hydro, bảo vệ sản phẩm khỏi sự biến tính nhiệt.

Mannitol có thể làm tăng nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (Tg) và đẩy nhanh tốc độ đông khô Mannitol dễ kết tinh trong quá trình đông khô, có thể đóng vai trò vừa là chất thúc đẩy quá trình kết tinh băng vừa là chất ổn định cấu trúc cho vi khuẩn Qua đó, mannitol có thể duy trì hiệu quả tính toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và ngăn ngừa sự sụp đổ [24]

Một số chất bảo vệ lạnh nhớt (ví dụ: glycerol, đường và polyme) làm tăng độ nhớt của dung dịch đậm đặc đông lạnh hoặc tế bào chất tùy thuộc vào tính thấm của chúng Do đó, trạng thái thủy tinh có thể đạt được ở tốc độ làm mát thấp hơn và nhiệt độ đóng băng cao hơn

Glycerol có đặc điểm "không kết tinh", tức là khi làm lạnh sẽ tạo thành ma trận đông lạnh vô định hình Nhờ đó, glycerol ngăn chặn sự hình thành tinh thể trong quá trình đông lạnh.

 Phối hợp các chất bảo vệ lạnh:

Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng không thể bỏ qua sự tương tác giữa các chất bảo vệ lạnh khác nhau, bởi vì khả năng chống chịu với quá trình đông khô của tế bào được cải thiện đáng kể thông qua tác dụng hiệp đồng giữa các chất bảo vệ Vì vậy, việc kết hợp đa chất bảo vệ lạnh để có bột probiotic đông khô tốt hơn và chức năng của chúng trong quá trình bảo quản đang là trọng tâm nghiên cứu hiện nay [53]

Một số nghiên cứu liên quan đến các chất bảo vệ lạnh được sử dụng trong quá trình đông khô vi sinh vật

Năm 2019, trong nghiên cứu của tác giả Guangqiang Wang ở Trung Quốc về sự kết hợp tối ưu của các chất bảo vệ lạnh cho kết quả như sau: hỗn hợp gồm 12,5 g/L Trehalose, 12,5 g/L Saccharose, 37,5 g/L Glycerol và 25,0 g/L Sữa gầy là chất bảo vệ lạnh tối ưu cho L plantarum và L casei với tỷ lệ sống cao (91 –93%) Trong số tất cả các điều kiện đông lạnh và băng tan được kiểm tra, tỷ lệ sống sót của L plantarum là cao nhất ở tốc độ đông lạnh −10°C/phút và nhiệt độ băng tan là 0°C; và của L casei, ở tốc độ đóng băng

−1°C/phút và nhiệt độ băng tan là 0°C Tác dụng bảo vệ lạnh được thực hiện bằng cách giữ tính toàn vẹn của màng tế bào và do đó duy trì sự sống sót của Lactobacilli [26]

Năm 2023, tác giả Baiyan Chen và cộng sự ở Quảng Châu đã chứng minh rằng các chất bảo vệ khác nhau, hoặc thậm chí nồng độ khác nhau của cùng một loại chất bảo vệ lạnh sẽ tác động khác nhau đến tỷ lệ sống sót Nồng độ 10% Trehalose hoặc 10% Glycerol có thể

12 nâng cao hiệu quả bảo vệ tốt hơn đối với Lactobacillus rhamnosus Sữa bột gầy cho tỷ lệ sống đạt tối đa 72,3% ở mức 10% [18]

Một nghiên cứu năm 2008 của Lê Ngọc Trân và Hồ Thị Yến Linh đã chứng minh hiệu quả của môi trường đông khô chứa 1,5% lactose và 3% sữa trong việc bảo quản Lactobacillus acidophilus Môi trường tái hydrat hóa chứa 10% maltose hỗ trợ khả năng hồi phục tối ưu Để tăng cường khả năng sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản, các tác giả đề xuất sử dụng môi trường đông khô chứa 1,5% lactose, 3% sữa và 10% maltose.

Nghiên cứu của tác giả Đỗ Thị Tuyến và Đinh Thị Lan (2023) đã chỉ ra hiệu quả của việc sử dụng các chất bảo vệ như Lactose, Saccharose, Trehalose và Sữa gầy trong việc nâng cao tỷ lệ sống sót của chủng Streptomyces parvullus HT19.1 và Streptomyces sp HT17.8 Trong đó, Trehalose đem lại khả năng bảo quản tốt nhất Kết hợp Trehalose 10%, Sữa gầy 10%, Natri glutamat 1% và NaCl 0,9% cùng tiền xử lý lạnh -80°C cho kết quả bảo quản tối ưu, giúp tỷ lệ sống sót đạt 95% (HT19.1) và 92% (HT17.8) sau 12 tháng, tương ứng với mật độ vi sinh vật ≥ 1010 CFU/mL sau đông khô.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Hai chủng giống được sử dụng trong đề tài này là kết quả được phân lập từ đề tài

“Nghiên cứu sản xuất cốm vi sinh từ hai chủng lợi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus clausii phân lập tại Hải Dương” Hai chủng giống đó là:

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

Các hóa chất được sử dụng trong đề tài đạt tiêu chuẩn dược dụng, danh sách hóa chất đã sử dụng được liệt kê trong bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ

Pepton Ấn Độ Maltodextrin Trung Quốc

Thạch Việt Nam Mannitol Trung Quốc

NaCl Trung Quốc Trehalose Nhật Bản

Cao thịt Đức Glycerol Indonesia

Cao nấm men Ấn Độ Lactose Mỹ

Sữa gầy Newzealand Saccharose Việt Nam

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc

Nồi hấp tiệt trùng Nhật - ALP Máy ly tâm Đức – Sartorius

Máy vortex Hà Lan – Labinco BV Máy đông khô Đức – Christ Alpha

Tủ cấy vô trùng Nhật - Sanyo Tủ âm sâu -80°C Hàn Quốc - LG

Tủ lạnh bảo quản Hàn Quốc - LG Tủ ấm 37°C Nhật - Sanyo

Máy đo hàm ẩm Mỹ - Ohaus Máy đo pH Singapore - Eutech pH

Tủ sấy Hàn Quốc - Daihan Cân kỹ thuật Đức - Sartorius

Bảng 2.3 Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu Đĩa petri Ống nghiệm có nắp

Pipet chia vạch 10 ml Micro pipet 100, 1000 àl Ống ly tâm Giá đỡ ống nghiệm

Bình nón 250 ml Que chang Đèn cồn Cốc có mỏ 100 ml

2.1.3 Môi trường thạch sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.4 Môi trường LB thạch (g/100ml)

Tên nguyên liệu Lượng dùng

Chỉnh pH về 8-8,5 (đối với Bacillus clausii)

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Lựa chọn tá dược bảo vệ giúp quá trình đông khô tạo được nguyên liệu đạt yêu cầu về thể chất

 Khảo sát các chất bảo vệ, hỗn hợp các chất bảo vệ ở tỉ lệ nồng độ khác nhau đến thể chất của nguyên liệu

 Đánh giá hàm ẩm của nguyên liệu bột đông khô từ các chất bảo vệ trên

2.2.2 Đánh giá tỷ lệ sống sót của VSV trong nguyên liệu bột đông khô

 Đánh giá khả năng sống sót của chủng Bacillus subtilis ngay sau đông khô và khả năng bảo vệ VSV theo thời gian

 Đánh giá khả năng sống sót của chủng Bacillus clausii ngay sau đông khô và khả năng bảo vệ VSV theo thời gian

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm Áp dụng để tiệt khuẩn dung dịch nước, pipet tips, dụng cụ thủy tinh Nguyên liệu dụng cụ tiệt khuẩn được bọc giấy bạc, giấy báo hoặc đựng trong bình nón thủy tinh có nút bông Tiến hành tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 115°C trong 20 phút [1]

2.3.2 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật

Chuẩn bị LB thạch: cân, đong các thành phần trong công thức môi trường (công thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần tan trong nước, chuyển dung dịch trên vào bình nón thích hợp, điều chỉnh pH (nếu cần) Đậy kín bình bằng nút bông không thấm nước, sau đó tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm ở 115°C/20 phút

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa chính xác 9ml nước cất, đậy kín nút ống nghiệm, hấp tiệt khuẩn ở 115°C/20 phút, để nguội xuống nhiệt độ 37-40°C

Cách xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy:

Chuẩn bị dãy ống nghiệm có nắp đánh số từ 1,2,3, …, mỗi ống chứa 9 ml nước cất được hấp tiệt trùng 115°C/ 20 phút

Hút chính xác 1ml hỗn dịch đặc pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất, lắc đều, sau đó từ ống nghiệm thứ nhất lại hút chính xác 1ml cho vào ống nghiệm thứ 2… Làm như vậy cho tới ống nghiệm cuối cùng cần pha loãng

Hỳt chớnh xỏc 100àl (= 0,1ml) hỗn dịch chứa vi khuẩn vào đĩa thạch mụi trường LB (làm trên 3 nồng độ cuối, mỗi đĩa một nồng độ), láng đều trên đĩa thạch đến khi bề mặt thạch khô, nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ [1]

Công thức tính số lượng vi khuẩn:

A: số lượng tế bào trong 1ml dịch ban đầu (CFU/ml) n: số thứ tự của ống nghiệm pha loãng tính từ ống nghiệm đầu tiên được cho hỗn dịch

An: số lượng tế bào tại nồng độ pha loãng

Xác định số lượng VSV trong mẫu đông khô

Chuẩn bị một dãy ống nghiệm có nắp đánh số từ 1,2,3, ……đến độ pha loãng mong muốn Ống nghiệm 1 chứa 10 ml nước cất, những ống nghiệm đều còn lại chứa 9 ml nước cất Đem đi hấp tiệt trùng 115°C/ 20 phút, để nguội

Sau đông khô thu được m gam sản phẩm Lấy lượng x gam sản phẩm pha loãng trong ống nghiệm số 1 Hút chính xác 1ml dịch trong ống nghiệm số 1 pha loãng trong ống nghiệm số 2, rồi tiếp tục pha loãng đến ống nghiệm cuối cùng, cấy và ủ như trên

- Số lượng VSV sau đông khô (tương ứng có trong 1g lượng đông khô thu được):

As: Số lượng VSV có trong lượng mẫu sau đông khô tương ứng với 1g lượng đông khô (CFU/g)

An: số lượng vi khuẩn mọc trên đĩa petri tại nồng độ pha loãng n n: số thứ tự của ống nghiệm pha loãng tính từ ống nghiệm đầu tiên được cho hỗn dịch m: khối lượng mẫu đông khô thu được x: khối lượng mẫu đông khô lấy tiến hành đếm số lượng VSV

2.3.3 Phương pháp ly tâm để thu sinh khối [4]

Hút 40 ml hỗn dịch đặc vi sinh vật vào mỗi ống ly tâm đã được hấp tiệt khuẩn Tiến hành bằng máy ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Kết thúc thời gian ly tâm, loại dịch trong, thu sinh khối Sau đó, rửa lại sinh khối với 10 ml nước cất vô trùng, hòa tan đều bằng máy vortex, rồi lại tiến hành ly tâm với tốc độ và thời gian tương tự Loại bỏ lớp dịch trong, thu được sinh khối

Các ống nghiệm chứa chất bảo vệ và nước cất với các tỉ lệ sau:

- Với các chất bảo vệ đơn lẻ nồng độ 10%: cân 2g chất bảo vệ cho vào 20ml nước cất có trong ống nghiệm có nắp

- Phối hợp hai chất bảo vệ với tỉ lệ nồng độ 5% - 5%: cân 1g mỗi chất cho vào 20ml nước cất có trong ống nghiệm có nắp

- Phối hơp hai chất bảo vệ với tỉ lệ nồng độ 7% - 2%: cân 1,4g chất 7% và 0,4g chất 2% cho vào 20ml nước cất có trong ống nghiệm có nắp

- Đa chất bảo vệ theo công thức của nghiên cứu đã công bố, thí nghiệm được tiến hành như sau: cân 0,05g Saccharose; 0,075g Glycerol; 0,05g Sữa gầy rồi cho vào 20ml nước cất có trong ống nghiệm có nắp

Sau đó, tiến hành đồng nhất các ống nghiệm trên Rồi đem các ống nghiệm, ống ly tâm, pipet 10ml đi hấp tiệt khuẩn ở 115°C/ 20 phút

Hút 40 ml từ bình giống hỗn dịch đặc cho vào ống ly tâm đã hấp tiệt trùng Ly tâm thu sinh khối (4000 vòng/phút, trong vòng 15 phút), rửa sinh khối 2 lần bằng nước cất đã hấp tiệt trùng Sinh khối thu được hòa vào trong các ống nghiệm trên Cho hỗn dịch này vào các đĩa petri đã được làm sạch và hấp tiệt trùng từ trước, được đậy kín bằng nắp đĩa petri Tiền đông: Cho mẫu vào trong tủ âm sâu LG (Hàn Quốc) – 80 ° C trong 24 giờ cho đông rắn hoàn toàn Đông khô: Các mẫu sau tiền đông được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô Christ Alpha (Đức) ở nhiệt độ -50 ° C, áp suất 0,055 bar Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4-6 ° C [5]

2.3.5 Phương pháp đo hàm ẩm [1]

 Chuẩn bị: Mẫu bột đông khô tối thiểu 0,6g, thiết bị đo hàm ẩm Ohaus – Mỹ

 Tiến hành: Cho lên đĩa cân của thiết bị đo hàm ẩm một khối lượng tối thiểu 0,6g

Sấy ở nhiệt độ 105 ° C đến khối lượng không đổi

 Yêu cầu: Đối với chế phẩm probiotic có bào tử thì hàm ẩm không được quá 7% [1] 2.3.6 Phương pháp xử lí số liệu [1]

Các số liệu được quản lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 Các kết quả nghiên cứu được biểu thị trong khóa luận dưới dạng: 𝑋̅ ± SD (𝑋̅ là giá trị trung bình, SD để đo lường mức độ biến thiên của một tập hợp các giá trị so với giá trị trung bình của chúng)

Sử dụng phần mềm SPSS: dùng kiểm định T-test để so sánh sự khác biệt giữa hai nhóm biến Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2016

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

Lựa chọn tá dược bảo vệ giúp quá trình đông khô tạo được nguyên liệu đạt yêu cầu về thể chất (khô tơi, ít hút ẩm)

Để đảm bảo khả năng sống sót của VSV, các chất bảo vệ lạnh đang được sử dụng phổ biến trong quá trình đông khô Theo các nghiên cứu trước đây, các chất bảo vệ lạnh khác nhau, hoặc thậm chí nồng độ khác nhau của cùng một chất bảo vệ lạnh sẽ ảnh hưởng khác nhau đến tỷ lệ sống sót của VSV Sự bảo vệ tốt hơn thường có thể đạt được bằng cách kết hợp các chất bảo vệ lạnh khác nhau để duy trì hoạt tính cao hơn trong quá trình đông khô [18] Do đó, đề tài quyết định tiến hành khảo sát việc sử dụng đơn chất bảo vệ lạnh và đa chất bảo vệ lạnh để tìm ra công thức bảo vệ tối ưu cho chủng Bacillus clausii và đảm bảo đạt chỉ tiêu về thể chất để tạo ra nguyên liệu probiotic

3.1.1 Đơn chất bảo vệ lạnh

Dựa theo kết quả của một số nghiên cứu đã công bố, việc sử dụng một số chất bảo vệ đơn lẻ ở tỉ lệ nồng độ 10% cho phép VSV có khả năng sống sót cao [18], đề tài lựa chọn khảo sát các chất bảo vệ đơn lẻ ở nồng độ 10%: Saccharose, Lactose, Sữa gầy, Maltodextrin, Mannitol, Trehalose, Glycerol.

Với các chất bảo vệ đơn lẻ nồng độ 10%: tiến hành như mục 2.3.4, thu được các mẫu sản phẩm đông khô

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1, hình 3.1 và hình 3.2

- Bảng dưới đây thể hiện kết quả về hàm ẩm và thể chất của cả hai chủng B clausii và

B subtilis khi dùng đơn chất bảo vệ ở nồng độ 10%:

Bảng 3.1 Thể chất và hàm ẩm của các mẫu đông khô B subtilis và B clausii với đơn chất bảo vệ

Công thức chất bảo vệ lạnh

Hàm ẩm Thể chất Hàm ẩm Thể chất

1.1 Saccharose 10% 4% Bên ngoài: Đóng bánh, hơi xốp, màu trắng ngà, hơi nâu

- Bên ngoài: Đóng bánh ít, hơi xốp, màu trắng ngà

Bên trong: thể chất dính nhiều

Bên trong: thể chất dính nhiều

1.2 Lactose 10% 7,09% Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu trắng ngà, hơi nâu

Bên trong: thể chất dính

- Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu trắng ngà

Bên trong: thể chất dính nhiều

1.3 Sữa gầy 10% 7,1% Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu nâu Bên trong: bột khô, tơi

8,26% Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu trắng ngà

Bên trong: bột khô, tơi 1.4 Maltodextrin

8,93% Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu trắng ngà

Bên trong: thể chất hơi dính

8,4% Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu trắng ngà

Bên trong: thể chất hơi dính

1.5 Manitol 10% 5,02% Bên ngoài: Đóng bánh đẹp, đặc, màu trắng mịn

Bên trong: bột khô, tơi

5,08 % Bên ngoài: Đóng bánh đẹp, đặc, màu trắng mịn

Bên trong: bột khô, tơi

1.6 Trehalose 10% - Bên ngoài: Đóng bánh, đặc, màu trắng ngà, hơi nâu

Bên trong: thể chất dính

- Bên ngoài: Đóng bánh, hơi xốp, màu trắng ngà

Bên trong: thể chất hơi dính

- Hình ảnh các mẫu đông khô của chủng Bacillus subtilis khi dùng đơn chất bảo vệ ở nồng độ 10%:

Mẫu 1.1 Sac 10% Mẫu 1.2 Lac 10% Mẫu 1.3 SG 10% Mẫu 1.4 Malt 10%

Mẫu 1.5 Man 10% Mẫu 1.6 Tre 10% Mẫu 1.7 Gly 10%

Hình 3.1 Hình ảnh các mẫu đông khô của B subtilis khi phối hợp với đơn CBV

- Hình ảnh các mẫu đông khô của chủng Bacillus clausii khi dùng đơn chất bảo vệ ở nồng độ 10%:

Mẫu 1.1 Sac 10% Mẫu 1.2 Lac 10% Mẫu 1.3 SG 10%

Mẫu 1.4 Malt 10% Mẫu 1.5 Man 10% Mẫu 1.6 Tre 10%

Với các chất bảo vệ khác nhau, các mẫu đông khô sinh khối của B clausii thu được có sự khác biệt về màu sắc, độ tơi xốp và hàm ẩm

+ Saccharose 10% (1.1), Lactose 10% (1.2), Sữa gầy 10% (1.3), Maltodextrin 10% (1.4), Trehalose 10% (1.6): màu trắng ngà

- Các mẫu cho thể chất đóng bánh: Saccharose 10% (1.1), Lactose 10% (1.2), Sữa gầy 10% (1.3), Maltodextrin 10% (1.4), Mannitol 10% (1.5), Trehalose 10% (1.6)

- Trong đó, các mẫu cho thể chất bột khô, tơi: Sữa gầy 10% (1.3), Mannitol 10% (1.5)

- Các mẫu đạt hàm ẩm dưới 7%: Mannitol 10% (1.5)

 Mẫu Manitol 10% (1.5) cho thể chất đẹp, dạng bột trắng mịn, và hàm ẩm đạt yêu cầu

Hai chủng vi khuẩn B clausii và B subtilis có đặc điểm chung là cùng thuộc chi Bacillus Điều này có thể lý giải tại sao chúng có sự tương đồng về kết quả bảo vệ lạnh sau khi sử dụng đơn chất bảo vệ lạnh.

Hình 3.2 Hình ảnh các mẫu đông khô của B clausii khi phối hợp với đơn CBV

Trong đó, Mannitol 10% là mẫu cho thể chất đẹp nhất DĐVN V yêu cầu nguyên liệu bột đông khô cho chế phẩm probiotic yêu cầu hàm ẩm thấp, tạo bột màu trắng [1], do đó Mannitol 10% cho thấy tiềm năng để làm bột đông khô probiotic chứa B clausii Kết quả này khác so với chủng Lactobacillus rhamnosus được nghiên cứu năm 2023 bởi tác giả Baiyan Chen, khi tác giả này chọn các đơn chất bảo vệ lạnh như 10% Trehalose, 10% Glycerol, 5% Natri glutamate hoặc 15% Sữa gầy để nâng cao hiệu quả bảo vệ VSV và tạo bột đông khô probiotic

Có sự khác nhau về kết quả hàm ẩm giữa chủng B clausii và B subtilis Mẫu Saccharose 10%, Lactose 10% của chủng B clausii bên trong bị dính bết nên không tiến hành đo hàm ẩm Còn với chủng B subtilis, cũng có sự bết dính nhưng mức độ ít hơn Sự khác nhau này có thể được giải thích là do môi trường nuôi cấy của 2 chủng này khác nhau a Về thể chất

Các mẫu tá dược tạo khung 10% bao gồm saccharose, lactose, sữa gầy, maltodextrin, manitol và trehalose giúp tạo nên thể chất đóng bánh, được giải thích bởi vai trò tạo khung của tá dược Các chất tạo khung điển hình trong đông khô là đường phân tử lượng thấp (saccharose, trehalose, lactose), polyol (như manitol) và polysaccharide đường phân tử lượng cao (maltodextrin) Chúng góp phần tạo cấu trúc lỗ xốp phù hợp cho bánh đông khô, cho phép nước thăng hoa nhanh hơn trong quá trình sấy sơ cấp Nghiên cứu năm 2013 của Mehta Mehak cũng cho thấy chất tạo khung như manitol có thể tạo ra bánh đông khô có thể chất tốt.

Mannitol là chất tạo khung phổ biến trong các công thức đông khô Sự tồn tại của tinh thể Mannitol trong sản phẩm cuối giúp tạo ra những bánh đông khô thể chất đẹp [41] Mannitol kết tinh dễ dàng trong dung dịch nước đông lạnh do nhiệt độ eutectic cao của Mannitol - nước (-2,2°C) [41] Khung tinh thể tạo nên một chiếc bánh đông khô đẹp mà không bị co ngót hoặc nứt và giúp tăng khối lượng của bánh hoặc đạt được độ bền chắc mong muốn của công thức bù nước [33] Nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp với kết quả của đề tài khi bột đông khô chứa Mannitol cho thể chất bánh đẹp, trắng, khô tơi và không bị nứt bánh

Mẫu 1.7, Glycerol được sử dụng như một chất bảo vệ đơn lẻ, thể chất tạo thành sau đông khô bị chảy dính Kết quả này có thể giải thích như sau: giá trị nhiệt độ chuyển hóa

23 thủy tinh Tg của glycerol thấp (-93 °C), điều này sẽ dẫn đến sự phá hủy toàn bộ cấu trúc nếu glycerol được sử dụng như một thành phần duy nhất trong một công thức [32]

Thể chất của Saccharose 10% (1.1) bị xốp hơn, không đặc như mẫu Lactose 10% (1.2) Điều này được giải thích là do khối lượng riêng của Saccharose (1,587 g/cm 3 ) cao hơn Lactose (1,525 g/cm 3 ), do đó Saccharose có thể bị xẹp nhẹ cấu trúc trong quá trình sấy khô [62] b Về hàm ẩm

Hoạt độ nước thấp khiến tỷ lệ tử vong tế bào tăng nhanh Hoạt độ nước cao dường như đẩy nhanh quá trình oxy hóa lipid của màng tế bào bằng cách tăng cường huy động các thành phần không phản ứng ở hoạt độ nước thấp do bị giữ lại hoặc "bao gói" trong ma trận (khi độ ẩm cao, chỉ số acid béo không bão hòa/bão hòa giảm rõ rệt hơn) [28] Do đó, đề tài được tiến hành để chọn ra những chất có hàm ẩm đạt yêu cầu để duy trì sự sống sót của VSV theo thời gian

Manitol 10% (1.5) cho hàm ẩm đạt yêu cầu là do Mannitol là TD không hút ẩm và tồn tại dưới dạng chất rắn kết tinh, sự có mặt của TD kết tinh cũng làm sản phẩm đông khô có hàm lượng nước thấp hơn khi so sánh với các TD tạo khung vô định hình [60]

3.1.2 Phối hợp đa chất bảo vệ lạnh

Sự hiệp đồng tác dụng của các chất bảo vệ lạnh giúp tế bào tăng khả năng chống chịu với quá trình đông khô [27], vì thế đề tài khảo sát sự kết hợp giữa hai chất bảo vệ ở các tỉ lệ nồng độ khác nhau:

Bảng 3.2 Tỷ lệ phối hợp đa chất bảo vệ lạnh được khảo sát

Tỷ lệ phối hợp 5% - 5% Tỷ lệ phối hợp 7% - 2%

Lactose + saccharose Lactose + glycerol Sữa gầy + glycerol Mannitol + glycerol Trehalose + glycerol Maltodextrin + glycerol

Dựa theo một nghiên cứu của Guangqiang Wang năm 2019, thí nghiệm được tiến hành với công thức 2,5% Saccharose: 3,75% Glycerol: 2,5% Sữa gầy để đánh giá thể chất cũng như khả năng sống sót theo thời gian

Đánh giá tỷ lệ sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông khô

Từ kết quả mục 3.1 có thể thấy việc sử dụng Mannitol cho thể chất bánh đông khô đẹp, bột khô, tơi Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng Mannitol để tạo nguyên liệu bột đông khô Tuy nhiên, để một nguyên liệu được đưa vào sản xuất, thì nguyên liệu phải đảm bảo được khả năng sống sót của VSV trong quá trình đông khô và sau thời gian bảo quản Nghiên cứu dưới đây nhằm đánh giá khả năng bảo vệ VSV của các chất bảo vệ lạnh Đề tài lựa chọn các mẫu thể chất bột khô, tơi: Sữa gầy 10% (1.3), Mannitol 10% (1.5), Mannitol 5% + glycerol 5% (2.4) để xác định số lượng VSV ngay sau đông khô và sau một thời gian bảo quản trong tủ lạnh

Cân một khối lượng cụ thể (khoảng vài mg) bằng Eppendorf từ mẫu đông khô trong đĩa petri Cho vào ống nghiệm thứ nhất, tiến hành pha loãng nuôi cấy xác định số lượng VSV sống sót sau đông khô bằng phương pháp pha loãng liên tục đã nêu ở mục 2.3.2

Xác định số lượng VSV từ bình giống gốc ban đầu theo phương pháp “Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy” đã nêu ở mục 2.3.2

Số lượng VSV từ bình giống gốc ban đầu:

Kết quả số lượng VSV trong các mẫu đông khô được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Định lượng số VSV B subtilis và B clausii theo thời gian

Ngay sau đông khô (CFU/g)

Ngay sau đông khô (CFU/g)

- Mẫu đạt khả năng sống sót > 10 10 CFU/g ngay sau khi đông khô: Mannitol 10%, Mannitol 5% - glycerol 5%

- Mẫu đạt khả năng sống sót > 10 10 CFU/g sau đông khô 1 tháng: Mannitol 10%, Mannitol 5% - glycerol 5%

 Mannitol 10% (1.5), Mannitol 5% + glycerol 5% (2.4) đảm bảo khả năng bảo vệ VSV theo thời gian khảo sát (> 10 10 CFU/g)

Bacillus clausii cho hai mẫu đạt yêu cầu về khả năng sống sót (Mannitol 10%, Mannitol

5% - glycerol 5%) Khác so với B subtilis, chỉ mẫu Mannitol 10% đạt yêu cầu Sự khác

31 nhau là do mẫu Mannitol 5% - glycerol 5% đối với B subtilis cho khả năng sống sót sau đông khô < 10 10 CFU/g Điều này có thể được giải thích là do lượng nguyên liệu đầu vào của B subtilis (10 11 CFU/ml) có mật độ thấp hơn B clausii (10 13 CFU/ml) Ngoài ra, điều này có thể được giải thích bằng việc B clausii có khả năng sống sót tốt hơn B subtilis sau đông khô Mặc dù chưa có bằng chứng rõ ràng về điều này, tuy nhiên có thể giải thích dựa trên kết quả sau: bào tử B clausii có khả năng đề kháng 100% với điều kiện đường tiêu hóa (GIT) trong mô phỏng hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột ở người khi được cho ăn và nhịn đói [9] Trong khi đó, bào tử B subtilis, sau 6 giờ, khả năng sống sót của bào tử sau khi đi qua dạ dày và ruột non là 74 ± 1% [30] Kết quả này cho thấy sức đề kháng của B clausii tốt hơn B subtilis trong một số điều kiện môi trường khắc nghiệt Tuy nhiên, cần có thêm bằng chứng cụ thể để chứng minh về khả năng sống sót của B clausii so với B subtilis sau quá trình đông khô

Ngay sau đông khô, Sữa gầy 10% (1.3), Mannitol 10% (1.5) cho khả năng sống tốt Điều này có thể được giải thích bằng hai cơ chế (thủy tinh hóa và thay thế nước) của chất bảo vệ lạnh đã được đề cập trong mục 1.5.2

Trong nghiên cứu năm 2015, Mannitol có thể dễ dàng tách ra khỏi dung dịch đông lạnh ở dạng pha tinh thể, dẫn đến mất độ ổn định của sản phẩm sau khi đông khô Hiệu ứng này được cho là nguyên nhân dẫn đến việc dược chất ít được bảo vệ trong quá trình sản xuất dược phẩm [40] Có báo cáo về tác dụng phụ của Mannitol đối với sự ổn định của thuốc dưới dạng chế phẩm đông lạnh Herman và cộng sự báo cáo rằng tỷ lệ quá trình thủy phân methylprednisolone natri succinat trong trạng thái rắn đông khô nhanh hơn đáng kể khi sử dụng Mannitol làm chất tạo khung so với việc sử dụng chất vô định hình Sự mất ổn định của thuốc một phần là do việc Mannitol tiếp tục kết tinh trong quá trình đông khô [6] Ngược lại, Schersch et al (2010) đã chứng minh rằng việc bổ sung Mannitol như một chất tạo khung không làm ảnh hưởng đến sự ổn định của protein, và nó ngăn chặn sự sụp đổ trong quá trình đông khô [15]

Trong thí nghiệm được tiến hành, Mannitol dùng làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô nguyên liệu probiotics chứa Bacillus subtilis và Bacillus clausii ở điều kiện đông khô ở nhiệt độ -50 ° C, áp suất khoảng 0,2 mbar thì thấy Mannitol vẫn đáp ứng được yêu cầu về khả năng bảo vệ VSV (> 10 10 CFU/g) ngay sau đông khô Điều này được giải thích là vì Mannitol có thể làm tăng nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (Tg) và đẩy nhanh tốc độ đông khô Mannitol dễ kết tinh trong quá trình đông khô, có thể đóng vai trò vừa là chất thúc đẩy quá trình kết tinh băng vừa là chất ổn định cấu trúc cho vi khuẩn Qua đó, Mannitol có thể duy trì hiệu quả tính toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và ngăn ngừa sự sụp đổ [24]

Mẫu Mannitol 10% (1.5) bị giảm 3 log VSV sau một thời gian bảo quản trong tủ lạnh Nguyên nhân có thể là do nhược điểm của tá dược tạo khung Mannitol, cụ thể là nếu nồng độ Mannitol không đủ lớn, chúng vẫn ở dạng vô định hình trong quá trình đông khô, từ đó có thể tạo ra rủi ro về độ ổn định của protein do khả năng kết tinh trong quá trình bảo quản [15]

Một nhược điểm tiềm ẩn khi sử dụng Mannitol là khi bổ sung tá dược vô định hình, Mannitol sẽ dễ bị kết tinh thành dạng hemihydrate trong quá trình đông khô [56] Nước thoát ra do mất nước hemihydrate trong quá trình bảo quản có khả năng gây ra những thay đổi vật lý và hóa học không mong muốn [41] Nước thoát ra có thể làm dẻo các thành phần vô định hình, glycerol lại rất dễ hút ẩm [47], tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình kết tinh, và từ đó, tác động bất lợi đến sự ổn định của protein [41] Điều này có thể lý giải cho việc sự kết hợp giữa Mannitol 5% - glycerol 5% (2.4) cho khả năng bảo vệ VSV kém hơn Mannitol 10% dùng đơn lẻ (1.5)

3.2.2 Biểu đồ thể hiện số lượng VSV và hàm ẩm của các mẫu đông khô a Bacillus subtilis

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện số lượng VSV và hàm ẩm của các mẫu đông khô chứa B subtilis

Mẫu 1.3 Sữa gầy 10% Mẫu 1.5 Mannitol 10%

Biểu đồ kết hợp đánh giá khả năng sống sót và hàm ẩm của các mẫu chứa Bacillus subtilis

Ngay sau đông khô (CFU/g) Sau đông khô 2,5 tháng (CFU/g) Hàm ẩm (%)

Mẫu Mannitol 10% (1.5) là mẫu duy nhất đạt tiêu chuẩn về tính chất lý hóa (khô, tơi, ít hút ẩm) và độ ổn định sinh học (khả năng sống sót > 10^10 CFU/g) trong toàn bộ thời gian khảo sát Kết quả này cho thấy Bacillus clausii bảo quản trong mẫu Mannitol 10% có khả năng duy trì sức sống tốt và đáp ứng yêu cầu về chất lượng trong thời gian bảo quản lâu dài.

Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện số lượng VSV và hàm ẩm của các mẫu đông khô chứa B clausii

 Mẫu Mannitol 10% (1.5), Mannitol 5% + glycerol 5% (2.4) đạt độ ổn định về khả năng VSV sống sót > 10 10 CFU/g theo thời gian khảo sát và đạt chỉ tiêu về thể chất (khô tơi, ít hút ẩm)

Từ kết quả thực nghiệm mục 3.2 cho thấy việc sử dụng đơn chất bảo vệ lạnh Mannitol 10%, hay đa chất bảo vệ lạnh Mannitol 5% + glycerol 5% trong quá trình đông khô Bacillus clausii sẽ cho phép tạo ra mẫu bột đông khô đạt chỉ tiêu về thể chất cũng như khả năng bảo vệ tốt VSV (> 10 10 CFU/g) Vì vậy, hai công thức chất bảo vệ lạnh trên có tiềm năng làm nguyên liệu bột đông khô cho chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii

3.2.3 Đánh giá bột đông khô Bacillus clausii theo một số chỉ tiêu về Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu probiotic theo DĐVN V

Từ kết quả mục 3.2.1 và 3.2.2 cho thấy, mẫu Mannitol 10% và mẫu Mannitol 10% - glycerol 10% cho thể chất bột tơi khô, màu trắng sữa, hàm ẩm thấp và cho khả năng bảo

Mẫu 1.3 Sữa gầy 10% Mẫu 1.5 Mannitol 10% Mẫu 2.4 Mannitol 5% + Glycerol 5%

Biểu đồ kết hợp đánh giá khả năng sống sót và hàm ẩm của các mẫu chứa Bacillus clausii

Ngay sau đông khô (CFU/g) Sau đông khô 1 tháng (CFU/g) Hàm ẩm (%)

34 vệ VSV tốt Do đó đề tài tiến hành đánh giá những mẫu này theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V tập 2

Trong phụ lục 1.26 “Yêu cầu chung đối với chế phẩm probiotic” của Dược điển Việt Nam V tập 2, để kiểm tra chất lượng bán thành phẩm, Dược điển yêu cầu 5 tiêu chí: cảm quan, kiểm tra vi khuẩn, độ nhiễm khuẩn, giảm độ sống do làm khô, xác định số lượng vi khuẩn sống Đề tài đã tiến hành đánh giá các chỉ tiêu: cảm quan, kiểm tra chủng vi khuẩn, xác định số lượng vi khuẩn sống Tuy nhiên, chỉ tiêu “xác định số lượng vi khuẩn sống” đã được trình bày cụ thể tại mục 3.2.1 a Cảm quan:

Mẫu Mannitol 10% (1.5): bột khô rời, mịn, màu trắng sữa, hàm ẩm 5,08%

Mẫu Mannitol 5% - Glycerol 5% (2.4): bột khô rời, mịn, màu trắng sữa, hàm ẩm 4,96%

 Kết quả đạt chỉ tiêu Dược điển về thể chất (bán thành phẩm có màu trắng, hàm ẩm đạt dưới 7%, thể chất khô tơi) b Kiểm tra chủng vi khuẩn:

Nuôi cấy từ bột đông khô Mannitol 10%, để qua đêm trong điều kiện 37 0 C/24h trên đĩa thạch LB, lấy 1 giọt sinh khối làm vi phẫu, nhuộm Gram và quan sát khả năng bắt màu

Hình 3.7 Kết quả nhuộm Gram của dạng sinh dưỡng B clausii

Hình ảnh nhuộm Gram cho thấy vi sinh vật bắt màu xanh tím (Gram dương) Điều này phù hợp với nghiên cứu năm 2023 của tác giả NV Kanimozhi về việc vi khuẩn gram dương sẽ giữ lại màu khi nhuộm [34] Trên hình ảnh cũng cho thấy VSV có hình que, có thể đứng

35 thành chuỗi hoặc riêng lẻ Kết quả này cho thấy các bào tử đã phát triển tốt thành các tế bào sinh dưỡng

Lấy một ít bột, hòa vào nước cất, lấy 1 giọt làm vi phẫu, nhuộm Gram và quan sát khả năng bắt màu

Hình 3.8 Kết quả nhuộm Gram của bào tử B clausii - mẫu đông khô Mannitol 10%