TỔNG QUAN
Đại cương về Probiotic
1.1.1 Khái niệm và lịch sử về Probiotic
Probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp, mang ý nghĩa "thân thiện với đời sống con người," phản ánh vai trò của chúng trong việc duy trì sức khỏe đường ruột Theo định nghĩa của Parker năm 1974, probiotic được hiểu là “các vi sinh vật và các chất góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột,” bao gồm cả men vi sinh và các yếu tố liên quan như kháng sinh nhằm duy trì sự cân bằng vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa.
Fuller (1989) đã định nghĩa lại chế phẩm sinh học probiotic là “một chất bổ sung thức ăn chứa vi sinh vật sống có lợi cho vật chủ”, giúp cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và nâng cao sức khỏe tổng thể.
Thuật ngữ probiotic và khái niệm về chất bổ sung chứa vi sinh vật đã được định nghĩa chính thức từ năm 1989, nhưng lịch sử cho thấy những hoạt động liên quan đã tồn tại từ hàng nghìn năm trước Các bức tranh trên tường có niên đại 2500 năm trước Công nguyên chứng minh rằng người Sumari đã sử dụng sữa lên men, đây được xem là thực phẩm đầu tiên chứa vi sinh vật sống lên men.
Thuật ngữ Probiotic được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lương Liên Hợp Quốc (FAO) đưa ra khái niệm hoàn chỉnh nhất năm 2002 như sau:
Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe khi được tiêu thụ với số lượng lớn, giúp cải thiện hệ tiêu hóa và tăng cường đề kháng cho cơ thể Khái niệm này được xác nhận bởi Hiệp hội khoa học quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP) và thường xuyên xuất hiện trong các công trình nghiên cứu khoa học hàng đầu.
1.1.2 Vai trò của Probiotic với sức khỏe con người
Probiotic được biết đến với vai trò “thân thiện với con người” nhờ những lợi ích sức khỏe đã được chứng minh, đặc biệt trong việc duy trì cân bằng hệ vi sinh đường ruột bằng cách cạnh tranh, ức chế và loại trừ các vi sinh vật có hại trong đường tiêu hóa Ngoài khả năng hỗ trợ điều trị các bệnh lý tiêu hóa, probiotic còn có tiềm năng mang lại nhiều lợi ích sức khỏe khác, đang được khai thác, nghiên cứu và phát triển để nâng cao chất lượng cuộc sống.
Giảm nồng độ cholesterol trong máu : Theo kết quả nghiên cứu của Pereira
D.I.A và cộng sự, các sản phẩm chứa chủng probiotic thích hợp có khả năng làm hạ cholesterol máu do đó hỗ trợ ngăn ngừa nguy cơ tim mạch [54] Trong đó, các loài
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei và Bifidobacterium longum cũng đã được báo cáo là có tác dụng hạ mỡ máu [38]
Phòng ngừa và điều trị bệnh tiêu chảy : Theo nghiên cứu của Gill Harsharnjit
Nghiên cứu của S (2004) cho thấy, việc sử dụng đồng thời men vi sinh cho bệnh nhân đang điều trị kháng sinh, cả ngắn hạn và dài hạn, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy do tác dụng phụ của kháng sinh Các thử nghiệm về hiệu quả phòng và điều trị tiêu chảy do kháng sinh đã được thực hiện trên nhiều chủng probiotic khác nhau, như Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus và nấm men, cho thấy lợi ích rõ ràng trong việc duy trì cân bằng vi sinh đường ruột.
Phòng ngừa các bệnh lý tiết niệu – sinh dục liên quan đến mất cân bằng hệ vi sinh tại âm đạo và đường tiết niệu, gây thay đổi pH và tạo môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Nghiên cứu đã chỉ ra rằng bổ sung Lactobacillus spp và các sản phẩm probiotic giúp cân bằng hệ vi sinh, từ đó giảm nguy cơ nhiễm trùng đường tiết niệu và âm đạo Việc duy trì cân bằng vi sinh vật mang lại lợi ích quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe sinh lý nữ giới.
Probiotic giúp chống lại tác nhân gây bệnh bằng cách tổng hợp các chất chuyển hóa có hoạt tính kháng khuẩn như exopolysaccharid, bacteriocin và các acid hữu cơ Ngoài ra, probiotic còn sử dụng cơ chế kết tụ nhằm tạo điều kiện cho việc đào thải mầm bệnh ra khỏi hệ tiêu hóa Sự đối kháng của probiotic còn liên quan đến quá trình sản xuất acid acetic và acid lactic khi chuyển hóa carbohydrate, giúp duy trì môi trường pH thấp hơn và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh.
Probiotic đang được nghiên cứu và phát triển mở rộng với nhiều mục tiêu quan trọng, bao gồm chống viêm nhiễm đường tiêu hóa, hỗ trợ điều trị các vấn đề về dị ứng, kiểm soát cân nặng và chống béo phì, cũng như tăng cường khả năng hấp thu dinh dưỡng, góp phần thúc đẩy sức khỏe toàn diện.
Lactobacillus acidophilus là một trong những loài vi sinh vật probiotic phổ biến nhất hiện nay, thuộc họ Lactobacillaceae và chi Lactobacillus Loài vi khuẩn này là thành viên của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), đóng vai trò quan trọng trong cân bằng vi khuẩn đường tiêu hóa và âm đạo của người và động vật Việc bổ sung Lactobacillus acidophilus giúp cải thiện hệ tiêu hóa, hỗ trợ sức khỏe sinh sản và tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên.
Đặc điểm hình thỏi của trực khuẩn hình que, có kích thước 0,6-0,9 x 1,5-6,0 micromet, là Gram dương, tồn tại đơn lẻ hoặc dạng đôi, chuỗi ngắn Chúng không di động, không sinh bào tử và có phản ứng catalase âm tính Ngoài ra, loại trực khuẩn này có khả năng chuyển hóa đường lactose và sản xuất ra sản phẩm lactic L(+), giúp phân biệt chúng trong quá trình xét nghiệm và chẩn đoán.
4 a Ảnh dưới kính hiển vi điện tử b Ảnh dưới kính hiển vi thường
Lactobacillus acidophilus phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C, với khả năng chịu đựng tối đa đến 43-48°C, trong khi không phát triển ở nhiệt độ 20-22°C Vi khuẩn này không bắt buộc phải phát triển trong điều kiện kỵ khí nhưng có thể chịu được môi trường có pH từ 5,0 đến 6,0 trong vòng 24-36 giờ.
1.1.4 Tiềm năng của loài Lactobacillus acidophilus
Hiện nay, vi khuẩn Lactic (Lactic acid bacteria, LAB), đặc biệt là Lactobacillus acidophilus, đang thu hút nhiều sự quan tâm và nghiên cứu nhờ tiềm năng lớn trong sản xuất các sản phẩm lên men từ vi sinh vật này Các ứng dụng chính của Lactobacillus acidophilus trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm đã được xác định rõ, gồm có khả năng cải thiện hệ tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch, và phát triển các sản phẩm chức năng phù hợp với xu hướng chăm sóc sức khỏe tự nhiên Nghiên cứu về các sản phẩm lên men từ LAB mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các loại thực phẩm bổ sung lợi khuẩn và dược phẩm sinh học an toàn và hiệu quả.
Sinh khối tạo chế phẩm probiotic mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm việc tạo môi trường axit thuận lợi cho hệ vi sinh đường ruột và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Gram (-) Ngoài ra, chúng cạnh tranh vị trí bám và nguồn thức ăn, giảm số lượng vi sinh vật hoặc nấm gây hại trong ruột non Đặc biệt, sinh khối probiotic còn có khả năng sản xuất enzyme lactase, thúc đẩy quá trình chuyển hóa sữa ở trẻ nhỏ, góp phần cải thiện tiêu hóa và tăng cường hệ miễn dịch.
Đại cương về vi nang probiotic
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, chứa thành phần gồm dược chất hoặc phối hợp dược chất và tá dược bên trong một lớp màng bảo vệ Công dụng của vi nang giúp bảo vệ hoạt chất khỏi tác động của môi trường, tăng khả năng giải phóng chậm và nâng cao hiệu quả điều trị Nhờ cấu trúc kín đáo, vi nang còn giúp giảm tác dụng phụ và cải thiện sinh khả dụng của thuốc Vi nang là công nghệ tiên tiến trong lĩnh vực dược phẩm, mang lại nhiều lợi ích trong việc nâng cao độ an toàn và hiệu quả của thuốc.
5 polyme thiờn nhiờn hoặc tổng hợp; cú kớch thước trong khoảng từ 1 tới 5000 àm (trong thực tế thường điều chế vi nang trong khoảng 100 – 2000 àm) [4]
Các mô hình vi nang, theo quan điểm về vi nang probiotic, được phát triển dựa trên nguyên tắc tạo ra các vi nang kích thước nhỏ chứa một hoặc hỗn hợp polymer tạo vỏ và khối nhân là vi sinh vật probiotic These vi nang nhằm mục đích bảo vệ vi sinh vật probiotic khỏi các tác nhân bên ngoài trong quá trình tiêu hóa và giúp chúng được giải phóng tại vị trí thích hợp trong đường tiêu hóa Các ứng dụng của vi nang probiotic đã chứng minh hiệu quả trong việc duy trì hoạt tính của vi sinh vật và nâng cao hiệu quả điều trị, phù hợp với các yêu cầu về an toàn và khả năng kiểm soát phóng thích.
Vi nang được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực bào chế thuốc nhờ nhiều ưu điểm vượt trội như giúp phối hợp các hoạt chất có tính tương kỵ bằng cách vi nang hóa từng loại trước khi kết hợp, tăng độ ổn định của hoạt chất nhờ lớp bao cách ly dược chất khỏi môi trường bất lợi, ứng dụng trong chế tạo các dạng thuốc giải phóng kéo dài hay phóng thích có kiểm soát, đồng thời giúp che giấu mùi vị của dược chất, từ đó nâng cao hiệu quả và khả năng sử dụng của thuốc.
Từ quan điểm vi sinh học, vi nang probiotic chứa VSV đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng vi sinh vật tại các vị trí thích hợp trong đường tiêu hóa Các lợi ích của vi nang probiotic bao gồm giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch, từ đó góp phần cải thiện sức khỏe tiêu hóa tổng thể Vi nang probiotic cung cấp một cách hiệu quả để cung cấp vi sinh vật sống tới đường tiêu hóa, đảm bảo vi sinh vật phát triển tối ưu và duy trì sự cân bằng vi sinh đường ruột Chính nhờ khả năng bảo vệ và giải phóng chủ động này, vi nang probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả của các sản phẩm probiotic.
Vi nang probiotic cho phép thiết kế lõi kép giúp bổ sung đồng thời hai hoặc nhiều chủng vi sinh vật có lợi khác nhau, tăng cường hiệu quả probiotic Nghiên cứu của Cheng Zhao và cộng sự đã chứng minh rằng công nghệ này giúp cải thiện khả năng sống sót và hoạt động của các chủng probiotic trong môi trường tiêu hóa, từ đó nâng cao lợi ích sức khỏe cho người dùng.
(2020) đã khảo sát quá trình tạo men vi sinh dạng bào chế vi nang bao bọc
Lactobacillus spp và Bacillus subtilis hỗ trợ điều trị Hội chứng chuyển hóa (MetS) bằng cách bổ sung hai loại vi sinh vật có lợi này Nghiên cứu cho thấy sự phối hợp đồng thời của chúng tạo ra mối quan hệ cộng sinh có lợi, trong đó Bacillus subtilis tiêu thụ oxy và cung cấp môi trường khí thích hợp để Lactobacillus phát triển Sự tương hỗ này thúc đẩy chức năng của lợi khuẩn và tăng cường khả năng hỗ trợ sức khỏe của hệ tiêu hóa, góp phần vào quản lý hiệu quả các vấn đề liên quan đến MetS.
Hình 1.3: Vi nang kép và quá trình vận chuyển trong đường tiêu hóa [26]
Lớp polyme tạo vỏ trong vi nang probiotic có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu, giúp tế bào vi sinh vật (VSV) được cách ly khỏi môi trường xung quanh, qua đó bảo vệ và hạn chế sự tổn thất số lượng tế bào VSV Nhờ lớp vỏ này, vi sinh vật được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như pH thấp hoặc muối mật, đồng thời chỉ giải phóng VSV tại vị trí mong muốn, nâng cao hiệu quả của probiotic.
Nguyên liệu tạo vi nang có đặc điểm cấu trúc và tính chất vật lý, hóa học khác nhau giúp nghiên cứu khả năng bao tan và giải phóng VSV tại vị trí đích trong đường tiêu hóa, đảm bảo hiệu quả điều trị tối ưu.
(iv) Nguyên liệu thường là các polyme tự nhiên, an toàn và lành tính đối với người sử dụng
So với các dạng bào chế khác, vi nang probiotic còn tồn tại một số nhược điểm cần được tối ưu hóa trong quá trình nghiên cứu và phát triển sản phẩm Trong đó, việc lựa chọn nguyên liệu tạo màng đóng vai trò quan trọng, cần đảm bảo đáp ứng yêu cầu bao gói vi sinh vật (VSV) để nâng cao hiệu quả và độ bền của sản phẩm probiotic.
Là dạng bào chế đòi hỏi điều kiện bảo quản nghiêm ngặt về độ ẩm và nhiệt độ phù hợp, vì khả năng lưu giữ phụ thuộc vào đặc tính của nguyên liệu tạo vỏ và vi sinh vật.
Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò thiết yếu trong việc bảo vệ và kiểm soát quá trình giải phóng vi sinh vật khi cần thiết Lớp màng phải có khả năng chịu lực phù hợp để bảo vệ vi sinh vật sống bên trong mà không gây cản trở quá trình giải phóng, đảm bảo sự cân bằng giữa độ bền và khả năng phân giải [45].
Tinh bột, thạch, gelatin là các polymer tự nhiên được nghiên cứu và sử dụng làm nguyên liệu tạo vi nang probiotic nhờ đặc tính dễ tìm kiếm, chi phí hợp lý và khả năng bao gói hiệu quả Tuy nhiên, sự xâm nhập của vi sinh vật từ bên ngoài qua tạp nhiễm hoặc vi sinh vật trong quá trình bao gói có thể tiêu hóa các nguyên liệu này, gây thủng màng nang do điều kiện bảo quản không phù hợp.
1.2.2 Phương pháp vi nang hóa
Vi nang hóa probiotic là phương pháp cố định tế bào phổ biến hiện nay, giúp bảo vệ các vi sinh vật sống trong quá trình sử dụng Phần nhân của vi nang là các tế bào vi sinh vật (VSV) sống, được bao bọc bằng lớp vỏ làm từ các polyme nhân tạo như polystyren, polyamid, polyacrylamid và polyester Lớp vỏ mỏng này có độ dày từ 0,1 đến 200 micromet giúp giữ cho vi sinh vật luôn duy trì hoạt tính và đảm bảo hiệu quả tốt trong ứng dụng.
Quá trình bao gói hoặc bẫy các tế bào vi sinh vật (VSV) bằng cách bao phủ chúng trong lõi nhân thích hợp đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn cách các tế bào này với môi trường xung quanh, từ đó bảo vệ chúng khỏi tác động tiêu cực Đồng thời, quá trình này giúp giải phóng các tế bào VSV tại vị trí thích hợp trong ruột, tăng hiệu quả tác dụng của chúng trong hệ tiêu hóa Việc kiểm soát quá trình bao gói tế bào VSV là yếu tố then chốt để nâng cao khả năng ứng dụng trong các sản phẩm sinh học và cung cấp lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng.
Các phương pháp tạo vi nang khác nhau được sử dụng để sản xuất vi nang probiotic, trong đó việc lựa chọn phù hợp dựa trên các yếu tố như độ tan của nguyên liệu, tính tương đồng giữa nguyên liệu và VSV, cũng như kích thước vi nang Ngoài ra, quá trình vi nang hóa còn phải phù hợp với điều kiện sinh trưởng của vi sinh vật như nhiệt độ và pH Phân loại quá trình vi nang hóa dựa trên các phương pháp hóa học, hóa lý, tĩnh điện hoặc cơ học giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất và đảm bảo hiệu quả của vi nang probiotic.
1.2.3 Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ
Nguyên liệu tạo vi nang Probiotic
Việc lựa chọn phương pháp vi nang hóa phụ thuộc vào đặc tính của nguyên liệu như độ tan, pH và tính tương đồng để phù hợp với từng loại vi sinh vật (VSV) Các nguyên liệu được ưu tiên chọn phải đáp ứng các tiêu chí quan trọng: khả năng vi nang hóa để tạo ra chế phẩm probiotic, khả năng bao gói và bảo vệ VSV, đồng thời đảm bảo an toàn cho người dùng và tối ưu hóa chi phí Nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên đang được nghiên cứu rộng rãi nhờ tiềm năng phát triển về mặt khoa học và kinh tế Các đặc điểm của một số nguyên liệu chính dùng trong sản xuất vi nang probiotic đã được khảo sát nhằm nâng cao hiệu quả và tính an toàn của các chế phẩm probiotic.
Alginat là tên gọi chung của các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion, mang lại khả năng tạo gel và giữ nước vượt trội Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng, ưa nước, cấu tạo từ hai gốc acid uronic là acid α-L-guluronic (G) và acid β-D-mannuronic (M), liên kết với nhau bằng liên kết β(1→4) glycosid Cả hai gốc này đều chứa các nhóm carboxyl, khiến phân tử Alginat mang điện tích âm và có tính chất lý hóa đặc trưng Do tính chất này, Alginat thường được sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp, y tế và thực phẩm để tạo gel, làm chất giữ ẩm và chất làm đặc.
Alginat là polysaccharid tự nhiên có nguồn gốc từ thành tế bào của vi tảo rong nâu (Phaeophyceae), chủ yếu tồn tại dưới dạng muối ion hóa trị II Nguyên liệu thương mại của Alginat được chiết xuất từ nhiều loài tảo rong nâu khác nhau, đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết cao cho các ứng dụng công nghiệp và y tế.
Laminaria, Macrocystis, Sargas sum, Ascophyllum, Lessonia,… [67] Ngoài ra,
Alginat đã được tìm thấy rất nhiều trong tế bào sinh trưởng của một số VK đất như:
Azotobac tei và Pseudomonas Tùy thuộc vào nguồn gốc của loài, gần đây đã có hơn
200 loại Alginat khác nhau được xác định với khối lượng phân tử, mức độ trùng hợp và tỷ lệ M/G khác nhau [28]
Hình 1.5: Cấu trúc của Alginat: (A) monome, (B) chuỗi, (C) phân bố khối [28]
Alginat có cấu trúc hình thành từ các monome sắp xếp thành các khối M (MMMM) và khối G (GGGG) độc lập, sau đó các gốc acid mannuronic và acid guluronic luân phiên hoán đổi, liên kết với nhau để tạo thành cấu trúc mạng lưới Nghiên cứu chỉ ra rằng chỉ khối G trong cấu trúc Alginat mới tạo liên kết ngang cộng hóa trị liên phân tử với các cation hóa trị II như Ca²⁺ và Ba²⁺, thúc đẩy quá trình hình thành hydrogel Do đó, chiều dài của khối G, khối lượng phân tử và tỷ lệ M/G là những yếu tố quyết định đến khả năng liên kết hóa học và tạo gel của Alginat.
Alginat là nguyên liệu phổ biến hàng đầu trong nghiên cứu tạo vi nang chứa VSV probiotics nhờ vào đặc tính không độc hại, khả năng phân hủy sinh học, giá thành thấp, tương thích sinh học và không gây miễn dịch Cơ chế tạo vi nang từ Alginat dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa ion Na+ trong phân tử Natri alginat và ion Ca2+ của CaCl2, hình thành một dạng biocomposit không tan trong nước, liên kết cấu trúc vững chắc.
Vỉ trứng giúp bao gói vi sinh vật (VSV) trong vật liệu một cách hiệu quả, nhờ cấu trúc gel đặc biệt có khả năng bảo vệ và duy trì sự sống của vi sinh vật Cấu trúc gel này còn đóng vai trò như một lớp chắn chống lại các yếu tố bất lợi của môi trường, giúp bảo vệ VSV khỏi tác nhân gây hại Ngoài ra, vỉ trứng còn cho phép kiểm soát quá trình giải phóng VSV, đảm bảo tiềm năng ứng dụng trong các hệ thống cần phân phối vi sinh vật một cách chính xác và ổn định.
Carrageenan là polysaccharid của galactan – galactose, chứa 15-40% hàm lượng este-sulfat, cấu tạo từ các đơn vị xen kẽ của D-galactose Các đơn vị này gồm vòng 3-β-D-galactose (G), vòng 4-α-D-galactose (D), và vòng 4-3,6-anhydro-α-D-galactose (DA), được liên kết với nhau bằng liên kết α-1,3-glycosid và β-1,4-glycosid Đây là thành phần quan trọng trong nhiều ứng dụng công nghiệp và y học, nhờ vào cấu trúc đặc biệt của nó.
Dựa vào số lượng, vị trí các nhóm este sulfat và hàm lượng 3,6-anhydro galactose mà Carrageenan được chia thành sáu loại chính: lambda (λ), iota (ι), kappa
Các loại carrageenan như kappa (κ), iota (ι), và lambda (λ) đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thương mại Việc phân loại không phản ánh cấu trúc hóa học chung của nhóm mà chủ yếu thể hiện sự khác biệt về thành phần và mức độ sulfat hóa tại các vị trí khác nhau trong phân tử polyme Trong số các loại này, ba loại chính được quan tâm và ứng dụng phổ biến là lambda (λ), iota (ι), và kappa (κ) carrageenan, phù hợp cho các mục đích sử dụng đa dạng trong thực phẩm và công nghiệp chế biến.
Bảng 1.1: Tổng hợp tính chất của các loại Carrageenan λ-Carrageenan κ-Carrageenan ι-Carrageenan Nguồn gốc Tách chiết từ
Gigartina pistillata hoặc Chondrus crispus
Tách chiết chủ yếu từ
Kappaphycus alvarezii, Chondrus crispus, Gigartina skottsbergii
Tách chiết chủ yếu từ
Cấu trúc Monome: -(1,3)-β-D- galactopyranose-2- sulfate-(1,4)-α-D- galactopyranose-2,6- disulfate-(1,3)-
Monome: -(1,3)-β-D- galactopyranose-4- sulfate-(1,4)-3,6- anhydro-α-D- galactopyranose-(1,3)-
Monome: -(1,3)-β-D- galactopyranose-4- sulfate-(1,4)-3,6- anhydro-α-D- galactopyranose-2- sulfate-(1,3)- Độ tan Hòa tan hoàn toàn ở nhiệt độ thấp
Hòa tan hoàn toàn ở nhiệt độ cao
Hòa tan một phần ở nhiệt độ thấp Hòa tan hoàn toàn ở nhiệt độ cao
Không tạo gel, tạo dung dịch có độ nhớt cao
Tạo gel cứng, độ bền gel tăng lên khi có mặt của muối kali
Tạo gel dẻo và đàn hồi, độ bền gel tăng lên khi có mặt của muối Calci
Không Gel cứng Gel dẻo
Dung dịch nóng của κ-Carrageenan và ι-Carrageenan sẽ tạo gel khi nguội từ 40–60°C nhờ sự có mặt của các cation, giúp hình thành mạng lưới cấu trúc chắc chắn Nhờ khả năng tạo gel ở nồng độ thấp, Carrageenan có tiềm năng ứng dụng làm nguyên liệu bao gói probiotic Khi chuyển sang dạng gel, các mạch polysaccharid xoắn vòng như lò xo có thể liên kết với nhau tạo thành khung xương không gian ba chiều vững chắc, bên trong có khả năng bảo quản và chứa vi sinh vật (VSV).
Khả năng hình thành gel của carrageenan phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm nhiệt độ, nồng độ dung dịch carrageenan, ion kim loại và hàm lượng muối có trong dung dịch Các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình gel hóa của carrageenan, quyết định độ cứng và độ bền của sản phẩm cuối cùng Hiểu rõ các yếu tố này giúp tối ưu hóa quá trình xử lý và ứng dụng carrageenan trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Việc xác định các đặc tính của rong tách chiết, như loại rong, độ nhớt, cùng với quá trình hình thành và phân bố các gốc galactose trong mạch polyme, đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng Ngoài ra, công nghệ tách chiết cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả thu hồi và chất lượng của sản phẩm cuối cùng Do đó, lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp và kiểm soát các yếu tố liên quan là yếu tố then chốt để tối ưu hóa các đặc tính của rong tách.
1.3.3 Một số nghiên cứu về Carrageenan
Các nhà khoa học toàn cầu đã nghiên cứu sâu rộng về Carrageenan trong hơn ba thập kỷ qua, tập trung vào các đặc tính của nó như mức độ độc tính, mối liên hệ giữa cấu trúc và tính chất của hợp chất, cũng như tiềm năng mang lại lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng.
Các nghiên cứu về ứng dụng của Carrageenan và Alginat trong lĩnh vực phân phối thuốc đã được công bố, cho thấy tiềm năng của các hợp chất này trong công nghệ bảo quản và vận chuyển dược phẩm Ngoài ra, nhiều đề tài nghiên cứu đã tập trung vào khả năng phối hợp giữa Carrageenan – Alginat với khả năng bao gói vi sinh vật probiotic, mở ra cơ hội ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất các sản phẩm probiotic an toàn và hiệu quả hơn.
Năm 2008, nghiên cứu của Z Mohamadnia và cộng sự đã khám phá các liên kết ngang trong hạt hydrogel Carrageenan-Alginat, cho thấy sự liên kết hình thành khi mỗi polysaccharid kết hợp riêng lẻ với dung dịch muối phù hợp Alginat liên kết ngang với ion Ca²⁺ qua liên kết ion theo mô hình vỉ trứng, trong khi K⁺ hoạt động như một keo nội phân tử, tạo lực hút tĩnh điện với các nhóm este sulfat và nguyên tử oxy khan của κ-carrageenan Không có phản ứng hoá học hoặc liên kết chéo hình thành, quá trình bao gói được đảm bảo nhờ các liên kết đồng thời giữ chặt các thành phần lại với nhau.
Năm 2019, Fei Yu và nhóm cộng sự đã nghiên cứu tính chất cơ học, sự trương nở và khả năng hấp phụ của vi nang phối hợp Alginat và κ-carrageenan, nhằm hiểu rõ cơ chế hình thành mạng lưới của hệ thống này Họ xác định rằng mạng lưới hình thành chủ yếu dựa trên các liên kết giữa Alginat, với hàm lượng cao nhóm carboxyl có ái lực cao với cation hóa trị hai, và κ-carrageenan cùng Ca²⁺, tạo cầu nối nhờ lực hút tĩnh điện giữa gốc sulfat và Ca²⁺ Những phát hiện này góp phần nâng cao hiểu biết về tính chất của vi nang từ các thành phần thiên nhiên tự nhiên, qua đó mở ra tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực như vi thực phẩm và y học.
Hình 1.6: Minh họa liên kết tạo thành giữa Alginat – Carrageenan [32]
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
2.1.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
Các hóa chất sử dụng trong đề tài đạt tiêu chuẩn dược dụng, danh sách hóa chất đã sử dụng được liệt kê tại bảng dưới đây
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn chất lượng
Natri Alginat Ấn Độ TCCS
Cao thịt Merck – Đức TCCS
Cao nấm men Merck – Đức TCCS
KH2PO4 Trung Quốc TKHH
Natri clorid Trung Quốc TKHH
Triamoni citrat Trung Quốc TKHH
Natri acetat Trung Quốc TKHH
Natri citrat Trung Quốc TKHH
Thạch (Agar) Việt Nam TCCS
Tinh bột sắn Việt Nam TCCS
Calci clorid Trung Quốc TKHH
Kali clorid Trung Quốc TKHH
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc
Để đảm bảo chất lượng và độ chính xác trong phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng các thiết bị hàng đầu như cân kỹ thuật Đức Sartorius, tủ sấy Hàn Quốc Daihan, nồi hấp tiệt trùng Nhật Bản ALP, tủ cấy vô trùng Nhật Sanyo, máy khuấy từ Hàn Quốc Wisd và hệ thống đông khô Đức Christ alpha Ngoài ra, các thiết bị khác gồm máy ly tâm Đức Sartorius, tủ lạnh bảo quản Hàn Quốc LG, máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc KWF và tủ âm sâu -80°C Hàn Quốc LG đều đáp ứng tiêu chuẩn cao về công nghệ và độ bền Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm được lựa chọn kỹ lưỡng để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình thực hiện các nghiên cứu và phân tích.
Bảng 2.3: Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
Cốc có mỏ 100, 250, 500 ml Pipet pasteur Ống đong 50, 100, 500 ml Pipet chia vạch 5, 10 ml Ống nghiệm có nắp Lưới vớt hạt Ống ly tâm Đĩa petri đường kính 9 cm
Bình nón 100, 250 ml Micro pipet 100, 1000 𝜇𝑙
2.1.3 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.4: Thành phần của môi trường MRS lỏng
Triamoni citrat 2 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6.8 – 7.0
MT2 = MT1 + thạch 2% (20g/1000 ml môi trường)
2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.5: Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
STT Các dung dịch sử dụng Cách pha chế
1 Dung dịch Calci clorid 3% (kl/tt) Cân 3,00 g CaCl2 hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
2 Dung dịch Kali clorid 3% (kl/tt) Cân 3,00 g KCl hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
3 Dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt) Cân 2,00 g Natri citrat hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
Cân 0,90 g NaCl hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
Cân 10,00 g KI hòa tan trong 20 – 30 ml nước cất, bổ sung thêm 5,00 g I2, khuấy và đun nóng cho đến khi I2 hòa tan hoàn toàn, bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml
6 Dung dịch môi trường mô phỏng dịch dạ dày pH 1,2 (SGF)
Pha dung dịch NaCl 0,9% dùng dung dịch HCl 1M hoặc NaOH 1M điều chỉnh về pH 1,2
7 Dung dịch môi trường mô phỏng dịch ruột pH 6,8 (SIF) [7]
Cân 28,80 g Na2HPO4 và 11,45 g KH2PO4 hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 1000 ml, dùng dung dịch HCl 1M hoặc NaOH 1M điều chỉnh về pH 6,8.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp Alginat – Carrageenan và đánh giá hình thái vi nang
- Khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ KCl
- Khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ CaCl2
2.2.2 Bổ sung chất độn cải thiện thể chất và đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus của vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan
- Bước đầu bổ sung tinh bột vào vi nang probiotic phối hợp và đánh giá thể chất vi nang sau đông khô
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất vi nang phối hợp sau đông khô
- Đánh giá khả năng bao gói Lactobacillus acidophilus của vi nang phối hợp
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm
Tiệt khuẩn dụng cụ và chất lỏng bằng phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm đảm bảo tiêu diệt mọi vi sinh vật gây hại Chất lỏng được đựng trong ống nghiệm có nút kín hoặc bình nón đậy kín bằng nút bông không thấm nước để tránh nhiễm khuẩn Dụng cụ được đóng gói kín bằng giấy báo nhằm giữ vệ sinh và tránh nhiễm chéo Phương pháp tiệt khuẩn này sử dụng nồi hấp ở nhiệt độ 115°C trong vòng 20 phút để đảm bảo hiệu quả diệt khuẩn tối đa.
Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall
Tiệt khuẩn Tyndall (tiệt khuẩn gián đoạn) được sử dụng để hạn chế quá trình biến tính hoặc hồ hóa của tinh bột Quá trình này bao gồm đựng tinh bột trong bình nón, đậy kín bằng nút bông không thấm nước, rồi đun cách thủy ở nhiệt độ 80°C trong vòng 1 giờ Sau đó, bình được đưa vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Quy trình này lặp lại liên tục trong 3 ngày để đảm bảo hiệu quả tiệt khuẩn tối ưu.
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào [17]
Để chuẩn bị môi trường MRS lỏng theo công thức trong mục 2.1.3, cần cân đo chính xác các thành phần và hòa tan để tạo ra 100 ml dung dịch Tiếp theo, phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 10 ml môi trường để đảm bảo an toàn và vệ sinh Môi trường sau đó được đậy kín bằng nắp và tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong vòng 20 phút bằng nồi hấp tiệt khuẩn để loại bỏ vi khuẩn và nấm gây nhiễm Sau quá trình tiệt trùng, môi trường để nguội đến nhiệt độ khoảng 37-40°C trước khi sử dụng để đảm bảo môi trường phù hợp cho các hoạt động sinh học tiếp theo.
Cấy VSV vào ống môi trường trên với nồng độ 10% (kl/tt), ủ ống nghiệm chứa giống trong tủ ấm 5% CO2 ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng để chuẩn bị môi trường nhân giống Sau đó, phân chia môi trường vào các bình nón sạch, mỗi bình chứa 90 ml MRS lỏng, và đậy kín bằng nút bông không thấm nước để đảm bảo vô trùng Bình nón chứa môi trường được tiệt khuẩn nhiệt ẩm ở 121°C trong 20 phút bằng nồi hấp tiệt khuẩn Cuối cùng, để môi trường nguội đến nhiệt độ 37-40°C trước khi sử dụng để đảm bảo an toàn vệ sinh và hiệu quả nuôi cấy.
Cấy nhân giống 1 ống giống hoạt hóa vào 1 bình môi trường trên, ủ bình nhân giống trong tủ ấm 5% CO2 ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ
Thu sinh khối tế bào
Sau 24 giờ ủ, hỗn dịch nhân giống được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để tách sinh khối tế bào Phần dịch trong được loại bỏ để thu lại tế bào tập trung, đảm bảo vệ sinh trong điều kiện vô trùng Quá trình này diễn ra hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng để duy trì môi trường sạch sẽ và tránh nhiễm khuẩn.
2.3.3 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ tạo vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan
Để tạo vi nang phối hợp từ Alginat và Carrageenan không chứa vi sinh vật, tiến hành đo nước cất vào các bình nón và cân phân phối các loại phân tử này theo các nồng độ khảo sát (khối lượng/thể tích) Sau đó, đậy kín bình nón bằng nút bông không thấm nước và tiệt trùng mẫu bằng phương pháp nhiệt ẩm trong nồi hấp ở 115°C trong 20 phút để đảm bảo vô trùng và chuẩn bị cho quá trình tạo vi nang hiệu quả.
Vi nang được hình thành bằng cách nhỏ hỗn dịch qua pipet Pasteur có kích thước khoảng 2 mm vào dung dịch calci clorid 3% Sau đó, vi nang được ngâm trong dung dịch này đến khi gel hóa hoàn toàn, đảm bảo cố định trong vòng 1 giờ Cuối cùng, vi nang được vớt ra và rửa lại bằng dung dịch natri clorid 0,9% để hoàn tất quá trình chuẩn bị.
Tạo vi nang phối hợp Alginat, Carrageenan và Tinh bột chứa Lactobacillus acidophilus
Phân tán sinh khối vi sinh vật sau khi ly tâm vào dung dịch phối hợp Alginat và Carrageenan đã được hấp tiệt khuẩn, tạo ra một phương pháp chuẩn để xử lý sinh khối Quá trình này đảm bảo phân tán đều sinh khối vào dung dịch, với tỷ lệ 50 ml dung dịch phối hợp tương ứng với lượng sinh khối thu được, góp phần nâng cao hiệu quả bảo quản và ứng dụng trong các nghiên cứu sinh học.
Tiến hành bổ sung 1% tinh bột đã tiệt khuẩn Tyndall vào 100 ml dịch nuôi cấy, đảm bảo nồng độ chính xác để duy trì điều kiện nuôi cấy tối ưu Sau đó, hòa trộn đều hỗn dịch bằng cách khuấy liên tục trong 15 phút trên máy khuấy từ để đảm bảo sự đồng nhất của mẫu.
Tiến hành nhỏ giọt tạo vi nang tương tự vi nang phối hợp không chứa VSV Các thao tác được thực hiện hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng
Tiền đông là quá trình bảo quản vi nang bằng cách đựng trong đĩa petri đã được làm sạch và tiệt trùng, sau đó đông lạnh ở nhiệt độ -80°C trong 24 giờ để đảm bảo vi nang đông rắn hoàn toàn Tiếp theo, các mẫu sau tiền đông sẽ được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô ở nhiệt độ -50°C với áp suất 0,100 mbar trong vòng 24 giờ, giúp bảo quản lâu dài và giữ nguyên chất lượng của mẫu.
Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 2 – 8 o C
2.3.5 Phương pháp định tính tinh bột [6]
Dựa trên phản ứng định tính màu đặc trưng của tinh bột gặp thuốc thử Lugol, dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh tím khi có tinh bột, và mất màu khi đun nóng rồi xuất hiện lại sau khi nguội Để xác định sự hiện diện của tinh bột trong dịch SIF hoặc SGF sau quá trình ủ với vi nang đã đông khô, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Lugol vào ống nghiệm chứa 10 ml dịch ủ Nếu dung dịch chuyển màu xanh tím, điều đó chứng tỏ tinh bột đã được giải phóng từ vi nang trong quá trình ủ; ngược lại, nếu dung dịch có màu vàng, tinh bột không bị thất thoát khỏi vi nang.
2.3.6 Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng VSV [12]
Trong quá trình khảo sát, cân một lượng vi nang xác định rồi chuyển vào bình nón chứa dung dịch Natri citrat 2% đã tiệt khuẩn nhiệt ẩm Quá trình khuấy dilakukan với tốc độ phù hợp để đảm bảo phân tán đều vi nang trong dung dịch Các bước này giúp xác định chính xác lượng vi nang và đảm bảo điều kiện vệ sinh nhằm duy trì tính hiệu quả của quá trình xử lý Thực hiện đúng quy trình này là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ chính xác và an toàn của kết quả trong khảo sát và phân tích.
Hút chính xác 0,5ml dịch phá hạt và pha loãng để nuôi cấy Tiến hành đếm khuẩn lạc Sau khi thực hiện quá trình khuấy đều ở tốc độ 400-500 vòng/phút cho đến khi dung dịch rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất Phân tích kết quả dựa trên số lượng vi sinh vật sống còn lại theo phương pháp 2.3.7, đảm bảo độ chính xác trong xác định số lượng Vi khuẩn hoặc vi sinh vật còn sót lại.
2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [7]
Để chuẩn bị thạch MRS lỏng theo công thức trong mục 2.1.3, cần cân đo và đong chính xác các thành phần trong công thức môi trường Sau đó, hòa tan các thành phần tan trong nước và chuyển dung dịch vào bình nón phù hợp Tiếp theo, bổ sung thạch agar với nồng độ 2% (kl/tt) để đảm bảo độ dẻo của môi trường Cuối cùng, đậy kín bình bằng nút bông không thấm nước và tiến hành tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm để đảm bảo vệ sinh và hiệu quả nuôi cấy.
Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa chính xác 4,5 ml dung dịch nước cất Đậy kín nút ống nghiệm và tiến hành hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 115°C trong vòng 20 phút trong nồi hấp Sau đó, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37 – 40°C để đảm bảo an toàn và phù hợp cho quá trình tiếp theo.
Pha loãng xác định số lượng VSV
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
Khảo sát quá trình tạo vi nang phối hợp Alginat – Carrageenan và đánh giá hình thái vi nang
Alginat đã được chứng minh có khả năng tạo vi nang probiotic nhờ liên kết giữa nhóm -COO - của các đơn vị polyguluronat với ion Ca2+, hình thành mô hình “vỉ trứng” bao bọc vi sinh vật Ngược lại, κ-Carrageenan tạo gel cứng khi gặp ion K+, với các mạch polysaccharide xoắn vòng như lò xo, tạo thành khung xương không gian ba chiều vững chắc, chứng minh tiềm năng trong việc bao gói vi sinh vật Đề tài đã tiến hành khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp giữa Alginat và κ-Carrageenan bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ với đồng thời sử dụng ion Ca2+ và K+ để đánh giá các đặc tính hình thái, thể chất và khả năng bao gói của các vi nang tạo thành.
3.1.1 Khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ KCl
Nghiên cứu đánh giá khả năng tạo vi nang phối hợp giữa Alginat và Carrageenan kết hợp với dung dịch KCl thông qua phương pháp nhỏ giọt đông tụ Các thay đổi về tỷ lệ phối hợp của hai nguyên liệu được thực hiện nhằm khảo sát các đặc tính thể chất của vi nang, từ đó tối ưu hóa cấu trúc và chức năng của hệ nano vi nang.
Chúng tôi tiến hành tạo hai mẫu vi nang chứng C1 và C2 để kiểm tra khả năng tạo vi nang độc lập của Alginat và Carrageenan khi sử dụng dung dịch KCl 3% Các mẫu chứng này được cố định với nồng độ 2,5% (kl/tt), nhằm đảm bảo độ chính xác và khả năng phân tích của quá trình tạo vi nang Quá trình này giúp đánh giá hiệu quả của các chất hoạt động trong điều kiện thử nghiệm cụ thể, góp phần nâng cao chất lượng và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.
Để nghiên cứu khả năng tạo vi nang chứa hai nguyên liệu chính là Alginat và Carrageenan, chúng tôi đã tiến hành phối hợp hai nguyên liệu này với tổng nồng độ cố định là 2,5% (kết weight) Các mẫu vi nang được chế tạo theo các tỷ lệ khác nhau của Alginat và Carrageenan gồm: 1:4, 2:3, 3:2, và 4:1, giúp đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu đến đặc tính của vi nang Các mẫu vi nang này lần lượt được ký hiệu là CA-K1, CA-K2, CA-K3, và CA-K4, đảm bảo tính hệ thống trong quá trình phân tích Phương pháp nghiên cứu này nhằm tối ưu hóa tỷ lệ nguyên liệu để nâng cao chất lượng và tính ổn định của vi nang dựa trên thành phần tự nhiên an toàn.
Bảng 3.1: Tỷ lệ phối hợp nồng độ Carrageenan và Alginat với KCl tạo vi nang Các mẫu vi nang C1 CA-K1 CA-K2 CA-K3 CA-K4 C2
Chuẩn bị dung dịch phối hợp Alginat và Carrageenan theo tỷ lệ đã xác định theo phương pháp trong mục 2.3.3 đảm bảo thành phần đúng như thiết kế Đồng thời, chuẩn bị dung dịch KCl 3% để phục vụ quá trình tạo mẫu vi nang Quá trình tạo các mẫu vi nang CA-K1, CA-K2, CA-K3 và CA-K4 được thực hiện bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ, theo hướng dẫn chi tiết trong mục 2.3.3 để đảm bảo chất lượng và độ đồng đều của các vi nang.
Các mẫu vi nang được ngâm trong dung dịch KCl nồng độ 3% trong thời gian 1 giờ Rửa mẫu bằng dung dịch NaCl 0,9%
Thông số đánh giá: Hình thái vi nang tươi
Hình ảnh các mẫu vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan với dung dịch KCl được thể hiện ở hình 3.1 a Mẫu CA-K1 tươi b Mẫu CA-K2 tươi c Mẫu CA-K3 tươi
Hình 3.1: Hình ảnh vi nang CA-K1; CA-K2; CA-K3 tươi dưới camera thường Nhận xét:
Mẫu chứng C1 nhỏ giọt trong dung dịch KCl 3% không tạo ra vi nang, cho thấy tính ổn định của mẫu trong điều kiện này Trong khi đó, mẫu chứng C2 và mẫu CA-K4 không thể tạo vi nang do dung dịch đông đặc ngay ở nhiệt độ khảo sát, khiến phương pháp nhỏ giọt đông tụ không thể thực hiện Như vậy, các đặc điểm của mẫu chứng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tạo vi nang trong các điều kiện thử nghiệm khác nhau.
Các mẫu CA-K1, CA-K2, và CA-K3 đã được khảo sát để tạo vi nang, mang đến các hình dạng khác nhau Vi nang mẫu CA-K1 có kích thước không đồng đều, không hình cầu, bị kéo đuôi, có thể chất mềm; trong khi đó, mẫu CA-K2 tạo ra vi nang cầu dẹt, kích thước không đồng đều, cũng có thể chất mềm Ngược lại, mẫu CA-K3 cho ra các vi nang cầu đều, kích thước đồng đều, và có thể chất chắc chắn, phù hợp cho các ứng dụng yêu cầu độ bền cao.
Kết quả hình thái hạt cho thấy, mẫu chứng C1 chỉ chứa Alginat không tạo vi nang trong dung dịch KCl 3%, nhưng khi thêm Carrageenan, vi nang bắt đầu hình thành và trở nên cầu dần khi nồng độ Carrageenan tăng, đạt trạng thái tốt nhất ở nồng độ 1,5% Điều này được lý giải do Carrageenan tạo gel cứng dưới tác dụng của ion K+, với các mạch polysaccharid xoắn vòng như lò xo liên kết với nhau thành khung không gian ba chiều vững chắc, hỗ trợ hình thành hạt Trong khi đó, Alginat liên kết ngang bằng liên kết cộng hóa trị liên phân tử với một số cation để tạo thành cấu trúc ổn định.
Trong quá trình nghiên cứu, các ion như Ca²⁺, Ba²⁺ được xác định có vai trò trong việc tạo điều kiện hình thành hydrogel, tuy nhiên chưa ghi nhận liên kết rõ ràng giữa Alginat và ion K⁺ Kết quả phân tích cho thấy, vi nang được hình thành chủ yếu là của Carrageenan, và việc phối hợp Alginat với Carrageenan trong dung dịch KCl 3% chưa đạt được mục tiêu đề ra.
Mặc dù Carrageenan có khả năng tạo vi nang khi kết hợp với dung dịch KCl, nhưng không thể hình thành vi nang phối hợp giữa Alginat và Carrageenan qua phương pháp nhỏ giọt đông tụ với dung dịch KCl 3% Do đó, nghiên cứu vẫn đang tiếp tục khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp bằng dung dịch đông tụ CaCl2 để tìm ra phương pháp tối ưu hơn.
3.1.2 Khảo sát khả năng tạo vi nang phối hợp sử dụng dung dịch đông tụ CaCl 2
Nghiên cứu tập trung vào khả năng tạo vi nang phối hợp giữa Alginate và Carrageenan bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ với dung dịch CaCl2 Các tỷ lệ phối hợp giữa hai nguyên liệu được điều chỉnh để khảo sát ảnh hưởng đến đặc tính thể chất của vi nang Kết quả giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất vi nang có tính ứng dụng cao trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm.
Chúng tôi đã tiến hành sản xuất các mẫu vi nang chứa nguyên liệu Alginat và Carrageenan với tổng nồng độ cố định 2,5% (kl/tt) Các mẫu vi nang được pha trộn theo tỷ lệ lần lượt là 1:4, 2:3, 3:2, và 4:1, và được ký hiệu lần lượt là CA-C1, CA-C2, CA-C3, CA-C4 Quá trình này giúp nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Alginat và Carrageenan đến đặc tính của vi nang, góp phần nâng cao hiệu quả trong ứng dụng thực phẩm và dược phẩm.
Bảng 3.2: Tỷ lệ phối hợp nồng độ Carrageenan và Alginat với CaCl 2 tạo vi nang
Các mẫu vi nang CA-C1 CA-C2 CA-C3 CA-C4
Chuẩn bị dung dịch phối hợp Alginat và Carrageenan theo tỷ lệ đã xác định theo phương pháp tại mục 2.3.3 để đảm bảo hiệu quả tối ưu trong quá trình tạo mẫu vi nang Tiếp theo, chuẩn bị dung dịch CaCl2 3% để tiến hành quá trình đông tụ các mẫu vi nang CA-C1, CA-C2, CA-C3 và CA-C4 Quá trình tạo mẫu thực hiện bằng phương pháp nhỏ giọt đông tụ, theo hướng dẫn tại mục 2.3.3, giúp hình thành các viên nang có cấu trúc chắc chắn và đồng đều.
Các mẫu vi nang được ngâm trong dung dịch CaCl2 nồng độ 3% trong thời gian
1 giờ Rửa mẫu bằng dung dịch NaCl 0,9% Vi nang tạo thành được đông khô theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4
Thông số đánh giá: Các mẫu vi nang được đánh giá một số thông số sau:
Hình thái vi nang trước và sau đông khô
Thời gian rã và khả năng giữ cấu trúc của môi trường dịch tiêu hóa được mô phỏng dựa trên các mẫu vi nang sau khi tiến hành sấy khô Các thông số cố định trong quá trình khảo sát giúp đánh giá chính xác khả năng phân hủy và ổn định của từng mẫu vi nang trong điều kiện môi trường tiêu hóa Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc kiểm soát các yếu tố này là chìa khóa để cải thiện hiệu quả của hệ thống vi nang trong việc vận chuyển và giải phóng hoạt chất Việc phân tích khả năng giữ cấu trúc đảm bảo tính bền vững của các vi nang khi tiếp xúc với môi trường tiêu hóa, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và chuyển giao thuốc.
- Thể tích dịch khảo sát: 20 ml
- Tốc độ lắc: 75 vòng/phút
- Thời gian trong dịch dạ dày mô phỏng (SGF): 1 giờ
- Thời gian trong dịch ruột mô phỏng (SIF): 2 giờ
Kết quả hình thái vi nang
Hình ảnh các mẫu vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan với dung dịch CaCl2 được thể hiện ở hình 3.2
Trong quá trình phối hợp hai nguyên liệu, sự thay đổi tỷ lệ giữa κ-Carrageenan và Alginat ảnh hưởng đến tính chất của dung dịch sau tiệt khuẩn Khi tăng dần nồng độ κ-Carrageenan và giảm dần nồng độ Alginat, các dung dịch CA-C1, CA-C2, CA-C3, CA-C4 cho thấy sự tăng dần về độ đặc và độ sánh, phản ánh sự ảnh hưởng rõ rệt của tỉ lệ phối hợp đến đặc tính thể chất của dung dịch.