Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất và tinh chế acid glycyrrhizic từ Cam thảo

Đã có một số công trình trong nước nghiên cứu chiết xuất, phân lập GA trong Cam thảo, tuy nhiên các biện pháp sử dụng đã cũ và sử dụng nhiều dung môi độc hại.. Cho đến nay, qua nhiều côn

Dù đã có nhiều cố gắng, song đề tài còn có thể có những thiếu sót Kính mong nhận được sự chia sẻ và nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô giáo

Tôi xin trân trọng cảm ơn

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Đỗ Ngọc Quỳnh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Cam thảo 2

1.1.1 Phân loại thực vật 2

1.1.2 Mô tả thực vật 2

1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng chung của Cam thảo 4

1.2 Tổng quan về Acid Glycyrrhizic 5

1.2.1 Tính chất vật lý của Acid Glycyrrhizic 5

1.2.2 Tác dụng sinh học của GA 6

1.3 Giới thiệu về kỹ thuật hấp phụ 9

1.3.1 Khái niệm 9

1.3.2 Cơ chế và các quá trình chuyển chất trong hấp phụ 9

1.3.3 Một số chất hấp phụ sử dụng trong công nghệ dược phẩm 10

1.3.3.1 Silica gel 10

1.3.3.2 Than hoạt tính 11

1.3.3.3 Nhựa hấp phụ macroporous 11

1.4 Một số nghiên cứu chiết xuất và phân lập GA 12

1.4.1 Chiết xuất GA 12

1.4.2 Nghiên cứu tinh chế và làm giàu GA 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 16

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 16

2.1.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 17

2.1.3.1 Hóa chất 17

2.1.3.2 Thiết bị 17

2.1.3.3 Dụng cụ 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp định lượng GA 18

2.3.1.1 Phương pháp định lượng GA bằng TLC - Scanning [31] 18

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng GA bằng TLC - Scanning 19

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện chiết xuất GA từ Cam thảo 20

2.3.3 Nghiên cứu lựa chọn nhựa macroporous làm giàu GA từ Cam thảo 21

2.3.3.1 Phương pháp xử lý hạt nhựa 21

2.3.3.2 Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous 21

2.3.4 Nghiên cứu quá trình hấp phụ của GA với nhựa macroporous đã lựa chọn 22

2.3.5 Nghiên cứu giải quá trình hấp phụ của GA với nhựa macroporous đã lựa chọn 23

2.3.5.1 Khảo sát lựa chọn dung môi giải hấp phụ 23

2.3.5.2 Phương pháp khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ……… 23

2.3.6 Xây dựng và đánh giá quy trình làm GA từ Cam thảo sử dụng nhựa macroporous 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Thẩm định phương pháp định lượng GA bằng TLC - Scanning 26

3.1.1 Độ đặc hiệu 26

3.1.2 Độ thích hợp hệ thống 28

3.1.3 Khoảng tuyến tính 28

3.1.4 Độ lặp lại 29

3.2 Nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết xuất GA từ Cam thảo 30

3.2.1 Khảo sát lựa chọn dung môi chiết 30

3.2.2 Khảo sát lựa chọn tỷ lệ dược liệu/dung môi chiết 31

3.2.3 Khảo sát lựa chọn số lần chiết 32

3.3 Kết quả xác định hàm lượng GA trong dược liệu 33

3.4 Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous làm giàu GA từ Cam thảo 34

3.5 Kết quả nghiên cứu quá trình hấp phụ của GA với nhựa macroporous đã lựa chọn ……….36

3.6 Kết quả nghiên cứu quá trình giải hấp phụ của GA với nhựa macroporous đã lựa chọn ……….36

3.6.1 Khảo sát lựa chọn dung môi giải hấp phụ 36

3.6.2 Khảo sát thể tích dung môi giải hấp phụ 38

3.7 Kết quả đánh giá quy trình làm giàu GA trong Cam thảo sử dụng nhựa macroporous 39

3.8 Bàn luận về quy trình làm giàu GA từ Cam thảo……… 41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Đề xuất 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(Thin layer Chromatography)

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

2 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Acid glycyrrhizic 6

5 Hình 3.1: Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp 26

6 Hình 3.2: Sắc ký đồ analog của mẫu chuẩn GA 26

7 Hình 3.3: Sắc ký đồ analog của mẫu thử dịch chiết Cam thảo 27

8 Hình 3.4: Chồng pic UV của mẫu thử và mẫu chuẩn 27

9 Hình 3.5: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng

10 Hình 3.6: Thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến quá trình

11 Hình 3.7: Kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết xuất 31

12 Hình 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi đến quá trình

15 Hình 3.11: Kết quả khảo sát pH dung môi rửa giải 37

16 Hình 3.12: Kết quả khảo sát thể tích rửa giải 38

17 Hình 3.13: Sơ đồ quy trình làm giàu GA từ Cam thảo 40

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1: Phân loại các loại nhựa macroporous 11

2 Bảng 2.1: Các đặc tính lý hóa của nhựa macroporous 16

4 Bảng 3.1: Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp 28

5 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ GA 28

6 Bảng 3.3: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 30

7 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết xuất 31

8 Bảng 3.5: Tỷ lệ dược liệu/dung môi ảnh hưởng đến nồng độ GA

trong dịch chiết

32

10 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH lên sự hấp phụ GA 35

11 Bảng 3.8: Kết quả xác định dung lượng hấp phụ GA của H103 36

12 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát pH dung môi rửa giải 38

13 Bảng 3.10: Kết quả đánh giá quy trình làm giàu GA từ Cam thảo 41

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cam thảo (Glycyrrhiza spp.) là một trong những loại dược liệu đã và đang

được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền trên thế giới, đặc biệt là các nước

Châu Á và Nam Âu

Thành phần chính trong Cam thảo có lợi cho sức khỏe là acid glycyrrhizic (GA) và một nhóm các flavonoids Trong đó, GA là hoạt chất chính và được nghiên cứu nhiều nhất Ở nhiều quốc gia, GA được sử dụng như một tác nhân trị liệu chính để điều trị viêm gan siêu vi mãn tính và viêm da dị ứng [45] Nó cũng

là một trong những hợp chất tự nhiên hàng đầu cho các thử nghiệm lâm sàng về HIV mãn tính thể hoạt động [8] Đã có một số công trình trong nước nghiên cứu chiết xuất, phân lập GA trong Cam thảo, tuy nhiên các biện pháp sử dụng đã cũ

và sử dụng nhiều dung môi độc hại

Những năm gần đây, nhựa macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên Chúng có nhiều ưu điểm như: loại bỏ tạp chất, làm giàu hoạt chất, không sử dụng đến các dung môi hữu cơ độc hại, khả năng tái sử dụng và ổn định tốt, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp Tuy nhiên, việc sử dụng các nhựa macroporous trong quá trình tinh chế - biện pháp thay thế xanh cho các dung môi độc hại đang là một hướng đi tiềm năng mà ở Việt Nam chưa có công trình nào về Cam thảo được thực hiện

Nhằm phát triển hướng đi mới hiệu quả, kinh tế và thân thiện với môi

trường trong chiết xuất GA từ Cam thảo, đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hướng đến quá trình chiết xuất và tinh chế acid Glycyrrhizic từ Cam thảo”

được thực hiện với mục tiêu:

1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất GA từ Cam

thảo

2 Khảo sát một số loại nhựa để tinh chế và làm giàu GA từ dịch chiết Cam

thảo

Thuộc họ Cánh bướm Fabaceae (Papilionaceae)

Tên Cam thảo là vì Cam là ngọt, thảo là cỏ; cỏ có vị ngọt [4]

1.1.2 Mô tả thực vật

Cây Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis) là một cây sống lâu năm, thân có thể

cao tới 1m hay 1,5m Toàn thân cây có lông rất nhỏ Lá kép lông chim lẻ, lá chét 9-17, hình trứng, đầu nhọn, mép nguyên, dài 2-5,5cm, rộng 1,5-3cm Vào mùa

hạ và mùa thu nở hoa màu tím nhạt, hình cánh bướm dài 14-22cm (cây trồng ở Việt Nam sau 3 năm chưa thấy ra hoa) Quả giáp cong hình lưỡi liềm dài 3-4cm, rộng 6-8cm, màu nâu đen, mặt quả có nhiều lông, trong quả có 2-8 hạt nhỏ dẹt, đường kính, 5-2mm màu xám nâu, hoặc xanh đen nhạt, mặt bóng Tại Trung Quốc mùa hoa tháng 6-7, mùa quả tháng 7-9 [4]

Hình 1.1: Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra L [44]

3

Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra rất giống loài Cam thảo G uralensis,

nhưng khác ở chỗ lá chét thuôn dài hơn, dài 1,5-4cm, rộng 0,8-2,3mm, quả giáp thẳng hoặc hơi cong, dài 2-3cm, rộng 4-4,4mm, mặt quả gần như bóng hoặc có lông ngắn, số hạt ít hơn loài trên Mùa hoa tháng 6-8, mùa quả tháng 7-9.[4]

1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến

Chi Glycyrrhiza L trên thế giới có khoảng 12 loài, phân bố ở vùng ôn đới

ấm hoặc á nhiệt đới thuộc châu Á, châu Âu và bắc châu Phi Tuy nhiên, nơi phân bố tập trung của nhiều loài lại là vùng Trung Á, bao gồm Iran, Azecbaizan,

Kazakhstan, Ấn Độ, Nga, Trung Quốc và Mông Cổ [3]

Cam thảo bắc là cây ưa sáng, chịu được khô hạn và điều kiện thời tiết khắc nghiệt Tại vùng Trung Á, ban ngày có thể nóng trên 40◦C nhưng ban đêm hoặc

về mùa đông nhiệt độ xuống dưới 0◦C, nhưng cây vẫn sinh trưởng phát triển bình thường Cây sống được trên nhiều loại đất, từ các loại đất nhiều vôi, đất cát khô cằn của vùng sa mạc cho đến loại đất bùn nhão trong các đầm hồ bị can nước Do sống trong điều kiện khô cằn, nên bộ rễ của Cam thảo bắc rất phát

triển Hầu hết các cây Cam thảo lâu năm, rễ đều dài trên 1m [3]

Cây Cam thảo bắc trước đây không có ở nước ta Từ năm 1958 được du

nhập vào Việt Nam bằng những hạt giống của loài Glycyrrhiza uralensis do

Liên Xô cũ cung cấp [4] Được trồng thử ở các cơ sở nghiên cứu của Viện dược liệu (Văn Điển, Tam Đảo, Sa Pa và Hải Dương) [3]

Thường được trồng bằng các đoạn thân ngầm có 2 – 3 mầm vào mùa xuân Sau 3 -4 năm thì thu hoạch vào cuối thu Ba năm đầu có thể trồng xen các hoa màu khác Rễ và thân ngầm đào lên, rửa sạch đát cát, cắt bỏ rễ con, ủ đống làm cho màu trở nên vàng Rễ và thân ngầm thường được cắt thành đoạn dài 15 – 30cm, đường kính 5 – 20mm, bó thành từng bó Dược liệu mặt ngoài có lớp vỏ màu nâu, vết bẻ có xơ, màu vàng, dễ xé theo chiều dọc, hơi khé cổ [5]

1.1.4 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của các loài Cam thảo bắc có 2 nhóm hoạt chất chính: acid glycyrrhizic 6-12% và các dẫn chất của nó; nhóm các hợp chất

❖ Nhóm các hợp chất flavonoid

Các flavonoid là nhóm các hoạt chất quan trọng thứ hai có trong Cam thảo với hàm lượng 3 – 4% Có 27 chất đã được biết, quan trọng nhất là hai chất liquiritin (hay liquiritirosid) và isoliquiritin (hay isoliquiritirosid)

Liquiritin được Shinoda và Ueda phân lập năm 1934 Chất này thuộc nhóm flavanon, có phần aglycon là liquiritigenin (=4’,7 dihydroxy – flavanon)

Isoliquiritin được Puri và Seshadri phân lập năm 1954 Chất này là đồng phân của liquiritin và thuộc nhóm chalcon, phần aglycon là isoluquiritigenin (=4,4’,6’ trihydroxy chalcon) Isoquiritigen ở môi trường acid thì đồng phân hóa thành liquiritigenin

Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác như: isoflavan (glabridin), isoflavon (glabron), isoflaven (glabren) [5]

1.1.5 Tác dụng chung của Cam thảo

Trước đây, Tây y chỉ coi Cam thảo như một vị thuốc phụ, có tác dụng hỗ trợ, làm cho đơn thuốc dễ uống Trái lại, Đông y cho rằng Cam thảo có khả năng chữa rất nhiều bệnh và dùng trong hầu hết các đơn thuốc [4] Cho đến nay, qua nhiều công trình nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trên lâm sàng, Cam thảo

đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lý có thể ứng dụng trong chữa bệnh [27]:

- Tác dụng chống viêm: do có tác dụng ức chức các chất trung gian hóa học

của quá trình viêm như PGE2, leukotrien B, [12]

- Tác dụng chống vi khuẩn, virus và kháng độc tố: Hai thành phần trong Cam

thảo, isoliquiritigenin và glycyrol, đã cho thấy tác dụng ức chế neuroaminidase -

5

một loại enzyme có cả trong virus cúm A và B Enzyme này có vai trò quan trọng trong sự tăng sinh virus [40]

- Tác dụng chống oxy hóa: Tác dụng này chủ yếu thể hiện trên quá trình phân

giải lipid và cholesterol thông qua quá trình giảm mức độ nhảy cảm của các phân tử lipid với quá trình oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do [11], [22]

- Tác dụng bảo vệ gan: ức chế sự phát triển của dòng tế bào lưu trữ chất béo

gây ra xơ gan bằng cách giảm sự tăng sinh và gây ra apoptosis (sự chết tế bào) [49]

- Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Cam thảo cho thấy tác dụng gây trấn

tĩnh, ức chế thần kinh trung ương, giảm vận động tự nhiên và hạ thân nhiệt [3]

- Tác dụng trên hệ tuần hoàn: Cam thảo đã được sử dụng để điều trị các rối

loạn tim mạch [3]

- Tác dụng trên hệ hô hấp: Cam thảo cho thấy tác dụng chống ho dai dẳng [29]

và tác dụng tốt trên bệnh hen suyễn và bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [28]

- Tác dụng trên hệ tiêu hóa: Dịch chiết của G glabra có thể ngăn chặn sự kết

dính của Helicobacter pylori với mô dạ dày của con người và tạo ra tác dụng chống loét trong các mô hình thí nghiệm trên động vật [35]

- Tác dụng trên hệ nội tiết: Dịch chiết của Cam thảo G.uralensis có thể tránh

được việc tăng cân và tích lũy chất béo ở những con chuột béo phì; tuy nhiên,

nó không gây ra tác dụng tăng sinh đối với tuyến vú và tử cung [43]

- Tác dụng trên da: Chiết xuất Cam thảo được chứng minh là có thể chống lại

sự quang hóa do UVB gây ra, và có tác dụng chống oxy hóa và gốc tự do tốt [6], [16]

1.2 Tổng quan về Acid Glycyrrhizic

1.2.1 Tính chất vật lý của Acid Glycyrrhizic

- Acid Glycyrrhizic có tên IUPAC:

6-[6-carboxy-2-[(11-carboxy-

4,4,6a,6b,8a,11,14b-heptamethyl-14-oxo-2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14a-

dodecahydro-1H-picen-3-yl)oxy]-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid

6

- GA là một saponin chiết được từ Cam thảo bắc, là một chất thuộc nhóm olean Dưới tác động của acid vô cơ, GA bị đẩy ra khỏi muối của nó Khi thủy phân bằng acid cho phần glycon là acid glycyrrhetic (còn gọi là acid glycyrrhetinic) và 2 phân tử acid glucuronic Acid glycyrrhetic có một nhóm

OH ở C-3 (nối với 2 phân tử glucuronic), một nhóm carbonyl ở C-11, một nối đôi ở C-12-13 và ở C-30 là nhóm carboxyl.[3], [4], [5]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Acid Glycyrrhizic

- Tính chất vật lý:

+ Bột màu trắng

+ Dễ tan trong nước nóng, cồn loãng, ít tan trong nước lạnh, nếu để nguội sẽ tạo thành gel, không tan trong ether và chloroform [5]

+ Nếu cho vào nước lắc thì tạo bọt

+ Độ ngọt gấp 60 lần saccharose, nhưng nếu phối hợp với mía, độ ngọt lại tăng lên và có thể gấp 100 lần [3]

1.2.2 Tác dụng sinh học của GA

GA đã được báo cáo có nhiều đặc tính trị liệu như chống viêm, chống loét, chống dị ứng, chống oxy hóa, chống khối u, chống tiểu đường và bảo vệ gan, và được sử dụng để điều trị hội chứng tiền kinh nguyệt và nhiễm virus như phổ biến cảm lạnh, viêm gan virus, virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV)

và hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) [8] Cam thảo, nguồn tự

7

nhiên của GA, cũng là thành phần không thể thiếu của các loại thuốc truyền thống của Nhật Bản, và chiết xuất Cam thảo được sử dụng làm mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm, hương vị thuốc lá và các sản phẩm bánh kẹo [23] Chiết xuất từ

rễ của G.glabra cũng được biết là hoạt động như thuốc chống lipid máu và

chống tăng đường huyết [42] [34]

- Tác dụng trên chuyển hóa: Các nghiên cứu cho thấy GA giúp cải thiện các

hội chứng chuyển hóa bằng cách tác động lên các cơ chế liên quan Trong nghiên cứu của Chia và đồng nghiệp năm 2009 [48], GA đã làm giảm đáng kể lượng đường trong máu và HOMA-IR (mô hình đánh giá cân bằng nội môi - kháng insulin) ở chuột được cho 100mg/kg trong 24 giờ so với chuột không được điều trị với GA Hơn nữa, nghiên cứu của Eu và cộng sự [17] cũng cho thấy GA tạo ra sự giảm đáng kể lượng đường huyết lúc đói và nồng độ insulin huyết thanh trung bình ở chuột béo phì sau 28 ngày điều trị Dựa vào các tác dụng cải thiện các hội chứng bất lợi trên chuyển hóa đã được đề cập, đặc biệt là

là nồng độ insulin và lipid trong máu, GA được kì vọng rằng nó có thể giúp cải thiện mức độ nhạy cảm với insulin ở những bệnh nhân mắc hội chứng buồng trứng đa nang (PCOS) PCOS xảy ra khi có sự gián đoạn đối với chu kỳ kinh nguyệt bình thường ở nữ giới, dẫn đến chứng tăng huyết áp và có thể gây vô sinh [26] Khoảng 50% phụ nữ mắc PCOS bị thừa cân hoặc béo phì và biểu hiện kháng insulin và do đó, tăng insulin máu có thể là nguyên nhân chính dẫn đến chứng tăng huyết áp ở đối tượng này [20] Do đó, GA có thể có vai trò trong việc cải thiện tình trạng ở bệnh nhân PCOS

- Tác dụng trên các khối u và ung thư: Một đánh giá về tác dụng bảo vệ của

GA trong sự hình thành khối u dưới da do bức xạ UVB ở chuột không lông SKH-1 cho thấy GA làm giảm bớt sự hình thành khối u do bức xạ UVB Cơ chế này thông qua việc điều chỉnh giảm các biện pháp kiểm soát tăng sinh tế bào bao gồm dimer thymine, kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh , sự chết tế bào và yếu

tố phiên mã, cũng như các tác nhân gây viêm cyclooxygenase 2 (COX-2),

8

prostaglandin E2 (PGE2) và oxit nitric (NO), trong khi điều chỉnh tăng p53 và p21/Cip1 để bảo vệ DNA khỏi bị hư hại và thúc đẩy sửa chữa DNA [15]

- Tác dụng chống oxy hóa: Sự tích lũy quá mức của các gốc tự do có thể

gây ra sự mất cân bằng kéo dài giữa việc cung cấp oxy cho cơ tim và nhu cầu của cơ tim, dẫn đến xuất hiện của hội chứng mạch vành cấp tính (ACS) Isoproterenol là một trong những yếu tố phổ biến gây ra sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa trong cơ tim Trong nghiên cứu của Haleagrahara và cộng sự [21], GA đã được thử nghiệm thành công để thể hiện tác dụng tích cực chống lại bệnh nhồi máu cơ tim cấp do isoproterenol gây ra ở chuột

- Tác dụng trên vi khuẩn và virus: Các đặc tính chống virú của GA đã được

phát hiện từ những năm 1970 Trong những năm đầu, GA đã được chứng minh

là có tác dụng ức chế sự tăng trưởng và phát triển của virus vaccinia (VV), virus herpes simplex (HSV), virus bệnh Newcastle (NDV) và virus viêm màng não (VSV), nhưng không hiệu quả với virus bại liệt (PV) [38] GA sau đó đã được chứng minh là có tác dụng ức chế các bước nhân lên của virus giai đoạn muộn trên cả phôi trứng gà bị nhiễm cúm và NDV [39] GA cũng được Baba và Shigeta chứng minh là có hiệu quả chống lại virus varicella-zoster (VZV) trong ống nghiệm [7], cũng như có tác dụng ức chế sao chép SARS-coronavirus (SARS-CoV) trong ống nghiệm [25]

- Tác dụng chống viêm: GA đã được chứng minh là có tính chất chống viêm

trong nhiều nghiên cứu Gần đây, Bhattacharjee và cộng sự [9] tuyên bố rằng

GA đã ngăn chặn thành công tình trạng viêm trong nhiễm trùng Leishmania donovani bằng cách ức chế giải phóng COX-2 và PGE2 trong các đại thực bào

bị nhiễm L donovani Ngoài ra, GA cũng có thể ngăn chặn phản ứng viêm thông qua việc ức chế sản xuất cytokine gây viêm Kao et al [30] đã báo cáo rằng GA cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể bằng cách giảm sản xuất cytokine thông qua con đường phosphatidylinositol 3-kinase / Akt / glycogen synthase kinase-3-beta (PI3k / Akt / GSK3β) Bên cạnh đó, chiết xuất Cam thảo

9

có chứa GA cho thấy hiệu quả trong việc làm giảm ban đỏ, phù và ngứa trong viêm da dị ứng Với kết quả đầy hứa hẹn này, Cam thảo đã được yêu cầu điều trị viêm da dị ứng [41]

1.3 Giới thiệu về kỹ thuật hấp phụ

1.3.1 Khái niệm

Hấp phụ là là quá trình hút các chất trên bề mặt các vật liệu xốp nhờ các lựa bề mặt Các vật liệu xốp được gọi là chất hấp phụ, chất bị hút gọi là chất bị hấp phụ

Ngược với sự hấp phụ, sự đi ra của chất bị hấp phụ khỏi lớp bề mặt được gọi là sự giải hấp phụ Khi sự hấp phụ đạt tới trạng thái cân bằng thì tốc độ hấp phụ băng tốc độ giải hấp phụ

Sự hấp phụ có thể xảy ra giữa các pha: rắn và rắn, rắn và lỏng, hoặc rắn

và khí

Kỹ thuật hấp phụ có rất nhiều ứng dụng trong công nghệ dược phẩm như: lọc vi khuẩn, tổng hợp hóa dược, sử dụng trong mặt nạ phòng độc, sắc ký lỏng – rắn, và đặc biệt là tinh chế hoạt chất hoặc các chế phẩm từ dược liệu [2]

1.3.2 Cơ chế và các quá trình chuyển chất trong hấp phụ

Quá trình hấp phụ được phân thành hai loại tùy theo bản chất của lực tương tác giữa chất bị hấp phụ và chất hấp phụ: hấp phụ vật lí và hấp phụ hóa học

➢ Hấp phụ vật lý: Xảy ra do lực hút giữa các phân tử, lực hút Vanderwaals (có tương tác yếu) Là quá trình thuận nghịch, chiều ngược của sự hấp phụ là sự giải hấp phụ Hấp phụ vật lí kèm theo hiệu ứng nhiệt nhỏ, các chất

đã bị hấp phụ dễ bị giải hấp phụ

➢ Hấp phụ hóa học: Xảy ra do lực liên kết hóa học, có tương tác mạnh Trong hấp phụ hóa học, các phân tử của chất bị hấp phụ liên kết với chất hấp phụ bởi các lực hóa học bền vững tạo thành những hợp chất hóa học bề mặt mới Hấp phụ hóa học có hiệu ứng nhiệt lớn Chất bị hấp phụ khó bị giải hấp phụ

10

Các quá trình chuyển chất trong hấp phụ được xem như gồm ba giai đoạn: + Giai đoạn 1: Khuếch tán từ môi trường lỏng đến bề mặt hạt hấp phụ Giai đoạn này phụ thuộc vào tính chất vật lý và thủy động lực của chất lỏng + Giai đoạn 2: Khuếch tán theo các mao quản trên bề mặt

+ Giai đoạn 3: Tương tác hấp phụ

Hai giai đoạn sau của quá trình chuyển chất trong hấp phụ phụ thuộc vào các tính chất và cấu trúc của chất hấp phụ [2]

1.3.3 Một số chất hấp phụ sử dụng trong công nghệ dược phẩm

Các chất hấp phụ cần thỏa mãn các yêu cầu cơ bản sau: có bề mặt riêng lớn; có các mao quản đủ lớn để các phân tử chất bị hấp phụ đến được bề mặt nhưng cần đủ nhỏ để loại các phân tử tạp chất và có tính chọn lọc; có thể hoàn nguyên dễ dàng; bền năng lực hấp phụ; đủ bền để chịu được rung động và va đập [2]

Dựa vào bản chất của chất hấp phụ thì các chất hấp phụ được sử dụng trong ngành công nghệ dược phẩm được chia ra làm 3 loại chính:

+ Chất hấp phụ chứa oxy: silicagel, zeolits

+ Chất hấp phụ chứa cacbon: than hoạt, graphite

+ Chất hấp phụ là các polymer: nhựa hấp phụ

1.3.3.1 Silica gel

Silica gel là chất hấp phụ ưa nước, hấp phụ tốt nước và nhiều chất có cực

do có bề mặt riêng lớn, từ 200 – 800 m2/g Loại chất hấp phụ này thường được

sử dụng trong sắc ký cột để tách các hợp chất tinh khiết từ dược liệu hoặc tổng hợp hóa học và tinh chế làm giàu hoạt chất Ngoài ra nhờ đặc tính hút ẩm và khí, hạn chế sự biến đổi các thành phần hóa học, biến tính hoạt chất thì silica gel còn được sử dụng như một chất bảo quản trong ngành công nghệ dược phẩm Hiện nay, silica gel được sử dụng rộng rãi do có nhiều ưu điểm: bền, không độc, bảo quản và vận chuyển dễ dàng; giá thành thấp, hiệu quả kinh tế cao và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực; không ảnh hưởng tới sản phẩm mà nó tiếp xúc và dễ tái sử dụng; bền cơ học ở nhiệt độ cao [2]

11

1.3.3.2 Than hoạt tính

Than hoạt tính được chế tạo từ các nguyên liệu giàu cacbon như than bùn, than đá, thực vật, xương động vật Cấu trúc xốp và độ hoạt động của than phụ thuộc vào loại nguyên liệu và chế độ hoạt hoá nên than có nhiều loại với phạm

vi hoạt động khác nhau Than dùng trong hấp phụ khí thường là loại có nhiều mao quản nhỏ, hấp phụ dung dịch cần giàu mao quản trung bình Than hoạt tính thường được dùng ở hai dạng: dạng bột – thường dùng với quy mô nhỏ, đem trộn vào dung dịch cần hấp phụ sau đó lọc bỏ than đã hấp phụ; dạng viên – thuận lợi cho việc hoàn nguyên than và tái sử dụng nên thường dùng cho các hệ thống có quy mô lớn [2]

1.3.3.3 Nhựa hấp phụ macroporous

Nhựa hấp phụ là các polymer liên kết chéo, không ion hóa, được tổng hợp nhân tạo như styren, divinyl, benzen,…bản chất là các hạt rắn, trên bề mặt có nhiều lỗ xốp và không cho ánh sáng đi qua Các lỗ xốp tương đối rộng (đường kính lỗ xốp > 50Å) [33] có thể cho phân tử lớn đi qua, hấp phụ nhờ lực liên kết tĩnh điện, liên kết hydro hoặc tạo phức Các hạt nhựa có kích thước từ 0,3 - 1,2

mm, cứng, trơ, diện tích bề mặt lớn và có thể dễ dàng xử lý trước khi sử dụng Khi được hoạt hóa bởi nước, các hạt sẽ trương nở, kích thước hạt tăng đáng kể

so với hạt ban đầu [10]

Xét theo độ phân cực, nhựa macroporous chia làm 4 loại [33]

Ba ̉ ng 1.1 Phân loại nhựa macroporous Loại hạt

Kích thước hạt (mm)

Diên tích bề mặt (m 2 /g) Ví dụ

Không phân

D1400, D101, D4020 Phân cực yếu Polystyren 0,3-1,0 500-650 AB-8

Phân cực

trung bình

Polystyren, Styren-divinyl benzen

12

Khả năng hấp phụ chọn lọc của nhựa macroporous phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bản chất polyme, đường kính lỗ xốp, diện tích bề mặt riêng, độ phân cực, các nhóm chức đặc trưng; khối lượng phân tử, kích thước và độ phân cực của chất tan và các điều kiện tiến hành (nồng độ, pH dịch chiết, nhiệt độ hấp phụ, dung môi,…) [33]

Nhựa macroporous được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, các ứng dụng ban đầu có thể kể đến như tinh chế đường, hấp phụ khí, xử lý nước thải Trong lĩnh vực chiết xuất và tinh chế các hoạt chất tự nhiên, nhựa macroporous được ứng dụng để tinh chế, phân lập các hoạt chất tinh khiết, làm giàu hoạt chất trong các cao dược liệu Đặc biệt với nhiều ưu điểm như: cấu trúc

đa dạng, giá thành rẻ, khả năng lặp lại và ổn định tốt, phần lớn đều sử dụng các dung môi “xanh” như nước và ethanol, có thể tái sử dụng, phù hợp với nhiều nhóm hoạt chất, chi phí vận hành rẻ, loại nhựa này phù hợp khi triển khai ở quy

mô lớn

Nhiều nhóm chất tự nhiên đã được tinh chế và làm giàu nhờ ứng dụng nhựa hấp phụ macroporous cho độ tinh khiết cao (từ 10 đến 90% tùy thuộc vào mức độ phức tạp của các thành phần trong dịch chiết) với hiệu suất thu hồi cao (>70%) như flavonoid/polyphenol, glycosid, saponin, taxol/toxoid, carotenoid, serotonin và các alcol béo [33]

1.4 Một số nghiên cứu chiết xuất và phân lập GA

1.4.1 Chiết xuất GA

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về chiết xuất GA từ Cam thảo được thực hiện trong và ngoài nước bằng rất nhiều các phương pháp khác nhau:

- Phương pháp ngâm với dung môi: Đây là phương pháp phổ biến và có ý

nghĩa thực tế nhất hiện nay Dựa vào tính chất vật lý của GA là một chất phân cực, dễ tan trong nước nóng, cồn loãng, do đó các dung môi này thường được sử dụng để chiết xuất GA Ngoài ra, trong các công trình nghiên cứu của mình, nhóm nghiên cứu của Tian cũng đã khảo sát khả năng chiết GA của các dung môi hữu cơ khác (methanol, dichloromethan, chloroform, n-hexan) và kết luận

13

rằng methanol là dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất Tuy nhiên xét về độ an toàn do dư lượng MeOH trong sản phẩm, thì việc sử dụng EtOH nên được ưu tiên trong các sản phẩm thương mại [45], [46]

- Phương pháp ngâm với hỗ trợ siêu âm: Sóng siêu âm lan truyền trong

môi trường lỏng gây nên những dao động mạnh của các phân tử, làm xuất hiện nhất thời các bóng khí trong lòng chất lỏng (bóng khí xuất hiện khi nhiệt độ dung môi dưới điểm sôi của nó) Quá trình bóng khí hình thành và xẹp đi gây ra một số tác dụng: tạo ra các sóng va đập và lực cắt xé mạnh, tăng nhiệt độ, tạo các tia dung môi nhỏ va đập vào bề mặt pha rắn Kết quả là siêu âm làm phá vỡ một phần màng tế bào dược liệu, tăng khả năng thấm của thành tế bào, giảm kích thước tiểu phân, phát sinh các kênh khuếch tán trong dược liệu và tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp chiết Nghiên cứu của Charpe năm 2012, đã cho thấy rằng phương pháp chiết siêu âm không những cho hiệu suất chiết cao hơn

mà còn giảm thời gian chiết so với các phương pháp khác [14]

- Phương pháp ngâm với hỗ trợ vi sóng: Dưới tác dụng của vi sóng, nhiệt

độ hỗn hợp chiết tăng nhanh Nhiệt độ tăng làm tăng tính thấm, tăng khả năng hòa tan và tăng tốc độ khuếch tán của dung môi Hơi ẩm trong tế bào dược liệu bốc hơi và tạo áp lực mạnh lên thành tế bào, gây phá vỡ tế bào và thúc đẩy giải phóng hoạt chất do vậy tiết kiệm đáng kể thời gian và dung môi chiết xuất [37] Tuy nhiên, cũng như phương pháp ngâm với hỗ trợ siêu âm, phương pháp này gặp khó khăn ở khả năng nâng quy mô mẻ chiết và đòi hỏi trang thiết bị chuyên dụng

- Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn: Phương pháp này

được Wang và cộng sự của ông nghiên cứu, trong đó các thiết bị sử dụng bao gồm nhiều đơn vị chiết nối với nhau bởi một ống dẫn, mỗi đơn vị chiết gồm bình chiết, bình đựng dung môi và một bơm Các đơn vị chiết được vận hành trong một chu trình khép kín, dung môi được bơm từ các van ở đáy bình vào bên trong, hòa trộn với bột dược liệu và chảy ra khỏi bình vào van ở phía trên và quay trở về bơm Kết quả của nghiên cứu cho thấy so với các phương pháp khác

14

thì phương pháp chiết xuất ngược dòng mang lại hiệu suất cao nhất, tiết kiệm đáng kể thời gian, năng lượng và lượng dung môi tiêu thụ [47]

- Phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn: Sử dụng dung môi siêu tới

hạn trong chiết xuất giúp bảo vệ các tính chất đặc trưng của hoạt chất do nhiệt

độ chiết thấp và hạn chế sự tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa, thân thiện với môi trường [24], [32] Tuy nhiên phương pháp này cũng cần thiết bị chuyên dụng và đắt tiền nên ít có ý nghĩa thực tiễn

1.4.2 Nghiên cứu tinh chế và làm giàu GA

Bên cạnh GA, trong Cam thảo còn có một vài nhóm hoạt chất như các flavonoid, các dẫn xuất triterpenoid do đó việc tinh chế và làm giàu GA cũng là một lĩnh vực được quan tâm Một số phương pháp tinh chế và làm giàu GA gồm:

- Phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng sử dụng dung môi hữu cơ: Phương

pháp này sử dụng tính chất về độ tan và sự phân bố chọn lọc của GA trong các dung môi để loại bỏ các tạp chất Đây là phương pháp được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu với ưu điểm là thao tác tiến hành đơn giản Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là sử dụng lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại, quy trình gồm nhiều bước, khó nâng quy mô, hiệu suất thu hồi và/hoặc hàm lượng GA thu được không cao [18], [36]

- Phương pháp sử dụng các chất hấp phụ chọn lọc: Đây là phương pháp

được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây, nhiều chất hấp phụ chọn lọc GA được nghiên cứu như: Fu và cộng sự đã nghiên cứu hấp phụ GA và flavonoid trong Cam thảo trên nhựa XDA-1, nhưng trọng tâm chính công việc của họ là loại bỏ GA để có được một sản phẩm Cam thảo deglycyrrhiziated [19]; Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Charpe đã thực hiện nghiên cứu khảo sát trên

5 loại nhựa hấp phụ khác nhau Indion 810, Indion 850, Indion 860, Duolite A161, Duolite A368 để xây dựng quy trình làm giàu GA bằng nhựa hấp phụ [13]

16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu Cam thảo khô được mua của

Công ty CP trà thảo dược Trường Xuân

2.1.2 Chất chuẩn và hóa chất

➢ Chất chuẩn:

- Acid Glycyrrhizic chuẩn:

Hàm lượng 99,72% (Trung Quốc), lô Lot# - 12967, từ Mafco Worldwide LLC

➢ Các chất hấp phụ:

- Nhựa macroporous: D101, HPD826, H103, và X5 được cung cấp bởi Công

ty Anhui Sanxing Resin Technology Co., Ltd (Trung Quốc)

Ba ̉ ng 2.1 Các đặc tính lý hóa của nhựa macroporous

Nhựa

macroporous

Diện tích bề mặt (m 2 /g)

Kích thước lỗ xốp (nm)

Kích thước hạt (mm)

17

2.1.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

2.1.3.1 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất sử dụng

✓ Máy cất quay IKA Scientific (Thụy Sỹ)

✓ Cân phân tích Mettler Toledo AB204S ( Thụy Sỹ)

✓ Cân kĩ thuật

✓ Tủ sấy Memmert (Đức)

✓ Tủ hốt, máy lắc, bể điều nhiệt

✓ Hệ thống lọc hút chân không Buchner

✓ Máy siêu âm Daihan scientific ( Hàn Quốc)

2.2 Nội dung nghiên cứu

✓ Nghiên cứu thẩm định phương pháp định lượng GA trong Cam thảo

✓ Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất GA: nồng

độ EtOH; tỷ lệ dược liệu/dung môi; số lần chiết

✓ Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous cho quá trình làm giàu GA trong các nhựa sau: nhựa D101, nhựa HPD826, nhựa H103, nhựa X5 dựa vào yếu tố pH dịch chiết

✓ Khảo sát quá trình hấp phụ trên nhựa macroporous được lựa chọn qua các thông số: dung lượng hấp phụ của hạt với GA

✓ Khảo sát quá trình giải hấp phụ trên nhựa macroporous: nồng độ dung môi giải hấp phụ; thể tích dung môi giải hấp phụ hoạt chất

✓ Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất và làm giàu GA từ Cam thảo quy mô phòng thí nghiệm (25 g/ mẻ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng GA

2.3.1.1 Phương pháp định lượng GA bằng TLC - Scanning [31]

- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân 10,00 mg acid Glycyrrhizic hòa tan bằng EtOH tuyệt đối rồi thêm EtOH tuyệt đối cho đủ 10mL trong bình định mức thu được dung dịch chuẩn acid Glycyrrhizic có nồng độ 1 mg/mL

- Chuẩn bị mẫu thử: Dịch chiết dược liệu

19

- Điều kiện dung môi sắc ký:

Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 GF254

Pha động:

n-Butanol : Acid acetic băng : nước cất = 7 : 1 : 2

- Đưa lần lượt mẫu thử và mẫu chuẩn lên trên bản mỏng Sau khi khai triển , bản mỏng được làm khô trong không khí điều kiện phòng, sau đó phát hiện vết trên bản mỏng ở bước sóng 254nm Tiếp đó Scanner đo quang và thu được các diện tích pic

❖ Tính toán kết quả:

Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ GA của các mẫu chuẩn Xác định nồng độ GA tương ứng trong mẫu thử tính theo phương trình hồi quy

Phương trình đường chuẩn: S = A*C + B với hệ số tương quan R2

Trong đó S: Diện tích pic; C: Nồng độ GA (mg/mL);

Trong đó: C: nồng độ GA mẫu thử; V: thể tích dịch chiết;

m: khối lượng dược liệu hoặc cao dược liệu

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng GA bằng HPTLC

* Độ đặc hiệu: Đưa lần lượt dung dịch mẫu trắng (dung môi pha mẫu), mẫu

chuẩn GA, mẫu thử lên bản mỏng, soi và chụp ảnh bản mỏng tại bước sóng 254

nm, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf Phương pháp TLC-scanning được coi là có tính đặc hiệu khi sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện vết có Rf tương ứng với vết của mẫu chuẩn, Rf của chất phân tích trong mẫu thử phải tương đương với Rf của chất phân tích trong sắc ký

20

đồ mẫu chuẩn RSD của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ của mẫu thử không quá 5% [1]

* Độ thích hợp hệ thống: Đưa 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ chất phân tích

nằm trong khoảng tuyến tính Triển khai TLC-scanning, tính RSD diện tích pic,

Rf RSD của Rf và diện tích pic không quá 5%[1]

* Khoảng tuyến tính: Tiến hành đưa lên bản mỏng lần lượt các thể tích của

dung dịch chuẩn với nồng độ thích hợp Tiến hành sắc ký với dãy dung dịch chuẩn trên Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất cần phân tích.Tính hệ số tương quan tuyến tính Dựa vào hệ số tương

quan R của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính

Yêu cầu: hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu: 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤

R2 ≤ 1

* Độ lặp lại: Chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình xử lý, chạy mẫu trên hệ thống

TLC-scanning định lượng GA, tính RSD diện tích pic, Rf RSD của Rf và diện

tích pic không được quá 5%[1]

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện chiết xuất GA từ Cam thảo

Mẫu Cam thảo được sấy khô trong tủ sấy tĩnh ở 50oC đến hàm ẩm dưới 5%, xay nhỏ và bảo quản trong túi PE kín ở điều kiện phòng thí nghiệm

Chiết xuất Cam thảo bằng phương pháp ngâm nóng với những ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian chiết xuất (1 giờ) [45]

Dung môi chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, số lần chiết là thông số quan trọng được khảo sát trong quá trình chiết xuất vì ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, thời gian và năng lượng sử dụng trong quá trình chiết xuất

Quá trình chiết xuất được tiến hành như sau: Cân X g bột Cam thảo, tiến hành chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngâm nóng với các điều kiện như sau:

+ Dung môi là EtOH với nồng độ thích hợp

+ Tỷ lệ khối lượng dược liệu với thể tích dung môi thích hợp

21

+ Số lần chiết thích hợp để chiết được tối đa hoạt chất

+ Thời gian chiết mỗi lần là 1 giờ

+ Lắc bình chiết với tốc độ 100 vòng/phút

Sau mỗi lần chiết lọc hút chân không qua phễu Buchner, gộp hết dịch chiết ở các phân đoạn, rồi cô quay chân không để thu hồi dung môi cho đến khi đạt tỷ lệ khối lượng dược liệu so với thể tích mong muốn, đảm bảo dịch trong trước khi tiến hành hấp phụ

Đánh giá: Định tính, định lượng GA trong các dịch chiết ở các điều kiện

khác nhau để lựa chọn được các điều kiện tốt nhất cho quá trình chiết xuất

2.3.3 Nghiên cứu lựa chọn nhựa macroporous làm giàu GA từ Cam thảo

2.3.3.1 Phương pháp xử lý hạt nhựa

Mục đích: Xử lý hạt nhựa nhằm làm cho hạt nhựa trương nở, loại bỏ các monomer và porogen trong các lỗ xốp sau quá trình tổng hợp từ đó làm tăng dung lượng hấp phụ

Tiến hành:

+ Ngâm hạt với dung dịch NaOH 4% trong 5 giờ

+ Ngâm hạt với dung dịch HCl 4% trong 5 giờ, rửa bằng nước cất đến pH trung tính

+ Sau đó ngâm hạt trong EtOH 96% trong 24 giờ rồi rửa sạch với nước cất trước khi sử dụng

2.3.3.2 Khảo sát lựa chọn nhựa macroporous

Do hoạt chất GA là một acid yếu, nên pH của dịch chiết có thể ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ hoạt chất của các hạt nhựa, do đó sự ảnh hưởng của pH dịch chiết cũng được khảo sát trong thí nghiệm này

- Chuẩn bị dịch chiết: Dịch chiết được xử lý như mục 2.3.2 Sau đó được thay đổi pH về các pH khác nhau bằng dung dịch HCl 5% và NaOH 5% Lấy các bình nón, mỗi bình hút lượng dịch chiết tương đương với 1g dược liệu (lắc đều trước khi hút để đảm bảo độ đồng nhất)