Tổng quan về kỹ thuật PCR

Trang 2 • PCR Polymerase Chain Reaction là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube.. Kéo dài: 72 độ C – 30s – 3min+ Primer chạy dài tạo sản phẩm+ Ko quá 300 nu+ DNA polym

TỔNG QUAN

PCR

• PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube.

• K.Mullis phát minh năm 1985 => 8 năm sau đạt giải Nobel hóa

Replication – tái bản PCR

DNA DNA template / RNA Enzyme Ko cần nhưng bù lại cần nhiệt độ DNA polymerase DNA polymerase

Mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn

a Biến tính : 94 đô C – 15s – 1min

+ Dưới tác động của nhiệt độ 2 sợi của DNA tách nhau ra thành các sợi đơn

b Bắt cặp : 55 -65 độ C – 15s – 1min

+ Các primer bám vào:

F bám vào antisene

R bám vào sene + Phụ thuộc vào primer: đặc biêt G + C 40%

chiều dài 18 -> 22 nu

c Kéo dài: 72 độ C – 30s – 3min

+ Primer chạy dài tạo sản phẩm

+ Ko quá 300 nu

+ DNA polymerase chỉ hoạt động khi có primer

+ Kéo dài chiều 5’ – 3’

Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)

Nhằm tăng tính đặc hiệu sẽ sử dụng 2 primer để giới hạn đoạn gene PCR

REAL TIME PCR

qPCR

PCR q PCR

Định tính – xác định có đoạn gene hay

không nhiêu bản, bao hàm cả định tính tínhXác định số lương gen mục tiêu, bao

Chất phát huỳnh quang

Quan sát trên gel điện di trong buồng

chụp điên di Thu ảnh thông qua detectior thu nhận tính hiệu ánh sáng

Chất phát huỳnh quang – là chất khi nhận năng lượng ở một luồng ánh sáng tới thì sẽ tích lũy và phát ra năng lượng ở bước sống cao hơn

 Ethidium bromide – sáng gấp 25 lần

 SYBR green – sáng gấp 200 lần

• PCR có thể quan sát trực tiếp

• Cấu tạo: + Máy luân nhiệt PCR

+ Máy quang phổ huỳnh + Máy vi tính

• Mỗi chu kì gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời:

+ PCR - Nhân bản DNA

+ Đo độ phát huỳnh quang

• Cách nhận biết có tín hiệu

+Phẩm nhuộm -> Ghép với sợi DNA => tạo tín hiệu huỳnh quang

+Probe đặc hiệu –> gắn với trình tự đích => tạo tín hiệu huỳnh quang

Ưu điêm: Định lượng – Nhậy nhất – Đặc hiệu – Hiệu quả - Nhanh, qui trình đơn giản – Giảm nguy cơ ngọại nhiễm

GIẢI PHÁP REAL TIME PCR

•1 Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra

ứng bằng cách so sáng Ct mẫu với Ct của các chất đã biết trước nồng độ

sản phẩm khuếch đại

•4 Phân tích end – point, xác định dương tính hoặc âm tính

KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG

• Chu kỳ ngưỡng – Ct – Threshold Cycle (Ct): nơi mà tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền một cách tháy rõ, có tương quan chặt chẽ với số lượng DNA đích ban đầu

• Số lượng bản DNA đích ban

đầu càng nhiều thì thời điểm

Ct phát hiện tín hiệu sản phẩm

khuếch đại càng sớm

QUY TRÌNH VÀ THIẾT BỊ

TẠO TÍN HIỆU

HUỲNH QUANG

PHẨM NHUỘM - SYBR GREEN 1

• Nguyên tắc: chui vào liên kết đôi của DNA để phát tín hiệu huỳnh quang

• Lưu ý:

Bắt 490 nm phát ra 530 nm DNA càng nhiều thì đỉnh đồ thị càng cao

Đồ thị phát tỉ lệ thuận với tỉ lệ DNA xuất hiện trong mẫu

• Sác sản phẩm gây dương tính giả:

1 Đoạn sole

2 Dimer ( 2 primer xuối và ngược liên kết với nhau)

3 DNA ngoại lai

Do SYBR – Green bắt với mọi sợi đôi => kết quả bị sai lệch

=> khắc phục bằng nghiên cứu ra đoạn Probe ( đoạn dò )

TỔNG QUAN PROBE

• Ưu điểm:

+ Đặc hiệu + Phát sáng khi bổ sung với DNA đích + Không phát sáng khi tự do

• Phân loại

+Probe có thể tách rời : Molecular Beacon, FRET

+Probe phân cắt : TaqMan

+Probe gắn trực tiếp với primer : Ampliflour, Scorpion

PROBE

TÁCH RỜI

MOLECULAR BEACONS

• Cấu tạo:

+ Vòng mang trình tự bổ sung với DNA đích

+ Nhánh đôi với 2 đầu:

Fluorophore ( F – chất phát huỳnh quang)

+ Kéo dài : Dùng một loại enzyme có khả năng cắt liên kết hydro mà

ko cắt nu => đoạn dò bị tách ra và tái sử dụng trong chu kì mới

FRET Probes

PROBE

PHÂN CẮT

TAQMAN (liên quan tới enzyme Taq

polymerase)

• Bản chất: Là đoạn oligonucleotide, có trình tự bổ xung với DNA mục tiêu và nằm giữa 2 đoạn mồi quy định

• Cấu tạo:

+ Gồm một đầu Reporter (phát tính hiệu huỳnh quang) và đầu

Quencher (ức chế tín hiệu) -> ở trạng thái tự do ko phát huỳnh

quang chỉ phát khi tham gia phản ứng

+ Đoạn giữa có trình tự bổ xung với DNA mục tiêu

• Nguyên lí: khi đoạn probe bị cắt bởi bởi enzyme Taq => R và Q cách xa nhau => phát tín hiệu huỳnh quang

PROBE GẮN VỚI PRIMER

REAL-TIME PCR

• Cho biết gene nào đang hoạt động

• Định lượng mức độ biểu hiện

• Kết hợp cùng microarray:

+ Định lượng chính xác biểu hiện gen quan tâm+ Khảo sát mô hình biểu hiện các gene quan tâm thay đổi như nào liên quan tới điều kiện thí nghiệm

VỚI CHUẨN ĐOÁN VIÊM GAN SIÊU VI

VỚI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GENE

• Phát hiện và định lượng HBV or HCV => chỉ định điều trị đặc hiệu và theo dõi điều trị

VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM

Lý do dùng PCR

•Kiểm tra nhanh

+ Thời gian cho kết quả + Độ nhậy

+ Độ đặc hiệu + Giá thành

+ Đơn giản

PHÁT HIỆN GMO

LÝ DO KIỂM TRA

•CNSH phát triển => nhiều nguyên liệu là GMO

•Quan điểm xã hội: chưa quen

tự nhiên

Sinh vật biến đổi gene ( GMO – genetically modified organisms)

là sinh vật sống có bộ gen được chèn một hoặc nhiều đoạn DNA (DNA chèn) làm bộ gen sinh vật bị biến đổi, nhằm tăng các đặc tính ưu việt có chọn lọc

1

• 1

• Toàn bộ mọi công đoạn trong dây chuyền sản xuất thực phẩm hoặc thực phẩm thức ăn gia súc có GMO đêu phải khai báo

• Phải dán nhãn khi:

• + Là GMOs

• + Chứa GMOs ( vd: sản phẩm sữa chứa vi sinh)

• + Chế biến trực tiếp từ GMO

• Không dán nhãn nếu được sản xuất dưới sự giúp đỡ của GMO

• + Thịt, sữa từ động vật nuôi bằng GMO

• + Chất gia vị sản xuất bởi vi sinh GMO

• Dây truyền cơ bản: Công ty giống -> nông dân -> công nghiệp -> chế biến -> phân phối