Kỹ thuật PCR

=> Do đó, một đoạn primer gồm 20 nucleotide được thiết kế để bổ sung cho một vị trí cụ thể trong bộ gen có khả năng liên kết với một trình tự khác là rất thấp... Một đoạn primer gồm 20 n

KỸ THUẬT PCR

Nhóm 5

Lời nói đầu

PCR đã cách mạng hóa ngành sinh học nhờ khả năng lấy một lượng DNA cực nhỏ và khuếch đại nó thành số lượng có thể phân tích được Trước đây, cách duy nhất để khuếch đại DNA là sử dụng vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao hơn Quá trình tốn nhiều thời gian

này liên quan đến việc chuyển một đoạn DNA vào plasmid hoặc vectơ khác, biến đổi DNA

đã kết hợp thành tế bào vi khuẩn, phát triển số lượng lớn vi khuẩn và tinh sạch đoạn DNA từ

vi khuẩn một lần nữa

Giới thiệu

• 1983 Kerry Mullis đã phát minh ra PCR.

• 1993 K Mullis và Michael Smith đã đạt giải Nobel.

• Quá trình PCR lần đầu tiên được miêu tả bởi Kjell Kleppe và H Bobind Khorana.

Nguyên tắc phản ứng

• Dựa vào đặc tính và hoạt động của DNA

polymerase.

• Primer bắt cặp đặc hiệu vào hai đầu của trình tự

DNA được khuếch đại là forward primer và reverse primer.

31

Kerry Mullis Michael Smith

Đại diện đồ họa của những gì Kary Mullis mô tả là tầm nhìn đầu

tiên của ông về PCR

“Điều thú vị là hóa sinh phát triển cùng với máy tính Nếu máy tính không xuất hiện cùng lúc với việc khám phá ra cấu trúc của DNA, thì sẽ không có hóa sinh Bạn luôn cần máy tính để xử lý thông tin Không có nó, chúng tôi sẽ có những căn phòng và những căn phòng này có đầy những nhà sư viết ra những trình tự”

Thành phần phản ứng PCR

Tùy mục đích sử dụng sản phẩm khuếch đại, một phản ứng PCR, có thể tích từ 25 –

100 μL, gồm các L, gồm các thành phần như sau:

• DNA 0,1 – 1 μL, gồm các g

• Primer 1 (Forward primer), 0,1- 1μL, gồm các M

• Primer 2 (reverse primer), 0,1- 1μL, gồm các M

Chiều của primer (The orientation of primers): chiều primer được kéo dài trong tổng hợp DNA Mỗi primer gắn với một sợi khuôn

Primer xuôi (forward primer): gắn với sợi antisense (-) => tương tự một phần trình tự sợi (+) Primer ngược (reverse primer): gắn với sợi sense (+) => tương tự phần trình tự sợi (-)

http://www.bioinformatics.nl/

32

Primer

PCR đúng là một kỹ thuật tuyệt vời!

Nhưng nó có thể thất bại nếu primer không được thiết kế chính xác Các đoạn primer PCR phải đủ dài

để liên kết với DNA mục tiêu cụ thể và ưu tiên chúng phải liên kết với DNA mục tiêu hơn là chính chúng

Các chương trình máy tính đã được phát triển để hỗ trợ thiết kế pimer PCR và có sẵn thông qua nhiều nguồn khác nhau trên internet

Tính đặc hiệu của primer PCR là một trong những đặc điểm quan trọng nhất và phần lớn là do trình tự

của mỗi primer PCR Để đảm bảo chỉ gắn đặc hiệu với DNA đích, đoạn primer PCR cần phải có độ dài

vừa đủ Các đoạn primer PCR điển hình có chiều dài từ 18 đến 22 nucleotide Xác suất của một đoạn

primer liên kết với một trình tự ngẫu nhiên giảm khi độ dài của đoạn mồi tăng lên

Ta ví dụ trong một bài toán về xác suất

Đầu tiên, giả sử rằng mẫu DNA bộ gen có lượng G, A, T và C bằng nhau, thì xác suất của bất kỳ

nucleotide cụ thể nào là A là 0,25

Nói cách khác, tại bất kỳ vị trí nào trong bộ gen, có 1/4 khả năng đó sẽ là A Tương tự, bất kỳ vị trí nào trong DNA sẽ có 1/4 khả năng là C, T hoặc G

Do đó, GCTA có xác suất (0.25) x(0.25) x(0.25)x(0.25) = 0.0039 được tìm thấy theo thứ tự này

Trong bộ gen của con người có 3,3 tỷ nucleotide, do đó trình tự GATC sẽ xảy ra 12.870.000 lần Ngược lại, một trình tự dài 20 nucleotide có xác suất là = 9.09x Khả năng trình tự 20 nucleotide sẽ xuất hiện ngẫu nhiên trong bộ gen thực sự là 3,3xx 9.09x=0,003, nhỏ hơn 1.

=> Do đó, một đoạn primer gồm 20 nucleotide được thiết kế để bổ sung cho một vị trí cụ thể trong bộ gen có khả năng liên kết với một trình tự khác là rất thấp.

Một đoạn primer gồm 20 nucleotide được thiết kế để bổ sung cho một vị trí cụ thể trong bộ gen có khả năng liên kết với một trình tự khác là rất thấp

Tất nhiên cái bài tập trên là một vài giả định

Đầu tiên, bộ gen của con người có rất nhiều trình tự DNA lặp đi lặp lại và việc thiết kế một đoạn primer

để liên kết với một đoạn lặp có nghĩa là nó cũng có thể liên kết với các đoạn lặp khác, ngay cả khi nó có chiều dài 20 nucleotide

Ngoài ra, xác suất mà tôi đã giả định rằng bộ gen sẽ có số lượng G, A, T và C bằng nhau Trên

thực tế, hầu hết các bộ gen sẽ bị sai lệch khi có nhiều cặp cơ sở A/T hơn cặp cơ sở G/C hoặc ngược lại

Ngoài chiều dài, trình tự pimer là một đặc điểm thiết kế quan trọng Trình tự phải bổ sung cho điểm đầu và điểm kết thúc của DNA đích Nhưng tổng số G, A, T và C trong đoạn primer và thứ tự cụ thể của các base này cũng ảnh hưởng đến hiệu quả PCR tổng thể.

 Trình tự của mỗi primer PCR là yếu tố chính quyết định nhiệt độ nóng chảy của primer hay Tm

 Tm đối với primer là nhiệt độ mà tại đó một nửa số primer được liên kết hydro với trình tự bổ sung trong DNA đích

và nửa còn lại không được gắn

 Tm khác với primer này với primer tiếp theo vì các cặp base A/T được giữ với nhau bằng hai liên kết hydro và các

cặp base G/C được giữ với nhau bằng ba liên kết hydro

 Càng nhiều G hoặc C trong primer thì càng có nhiều liên kết hydro và do đó, cần nhiều nhiệt hơn để tách primer ra

khỏi DNA đích của nó Nhưng tham số này là một phần của phương trình để tính Tm trễ

 Ngoài ra, nồng độ muối trong môi trường xung quanh đoạn primer và DNA đích, nồng độ của đoạn primer và DNA

đích, và tương tác giữa các base trong chính đoạn mồi, được gọi là hiệu ứng láng giềng gần nhất (nearest

neighbor effect ), tất cả đều làm thay đổi Tm của primer

 Lý do mà Tm nên được tính toán chính xác cho PCR là vì nhiệt độ ủ cho phản ứng thường được đặt thấp hơn

5oC so với Tm thấp nhất đối với mồi xuôi hoặc ngược

 Nếu nhiệt độ ủ được đặt quá cao, thì đoạn primer có thể không bám vào DNA đích và do đó, sẽ không khuếch

đại Mặt khác, nếu nhiệt độ ủ được đặt quá thấp, primer PCR có thể liên kết với các trình tự tương tự bên ngoài

DNA đích Khi quá thấp, primer PCR có thể khuếch đại DNA từ sai vùng, lỗi này được gọi là bắt mồi sai.

 Điều này sẽ xảy ra nếu chỉ một phần của đoạn primer PCR liên kết với vùng bổ sung bên ngoài DNA đích và do

nhiệt độ quá thấp, đoạn primer được ủ một phần đủ ổn định để DNA polymerase bắt đầu tổng hợp DNA của các trình tự DNA sai Ngoài việc thiết lập nhiệt độ ủ chính xác, cả hai primer PCR phải có Tm tương đối bằng nhau, nghĩa là cách nhau trong khoảng 5C, nếu không, một primer sẽ liên kết với DNA đích ở nhiệt độ ủ đã đặt và mồi kia có thể không ủ.

Cấu trúc Primer-Dimers và Hairpin PCR Primer

• Trình tự giữa hai primer cũng có thể gây ra vấn đề. Nếu các đoạn primer thuận và ngược có các bazơ 

bổ sung, đặc biệt là ở đầu 3’ của một trong hai đoạn primer, thì hai đoạn primer sẽ ưu tiên gắn với nhau hơn là DNA đích, được gọi là primer-dimer

• Một vấn đề khác phụ thuộc vào trình tự mồi PCR bổ sung được gọi là kẹp tóc. Điều này xảy ra khi hai 

đoạn DNA trên một đoạn primer bổ sung cho nhau, làm cho đoạn primer cuộn lại và gắn vào chính nó chứ không phải DNA đích

Nucleoside phosphoramidite

2.DNA khuôn mẫu (DNA template): cần duy trì

hàm lượng vừa đủ trong phản ứng; tinh sạch,

không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS,

heparin…).

3.Nồng độ MgCl2 MgCl2 cần thiết cho hoạt động

của Taq polymerase; hàm lượng quá cao sẽ tạo

nhiều sản phẩm kí sinh , hàm lượng quá thấp sẽ

làm giảm hiệu quả của enzyme.

Thành phần phản ứng PCR

40

4.dNTP Thành phần 4 loại dNTP phải được cân bằng để hoạt động sao chép của

polymerase diễn ra chính xác.

5.Enzyme polymerase chịu nhiệt Ngoài Taq polymerase, hiện nay có nhiều loại

polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ các giống vi khuẩn chịu nhiệt khác nhau: Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), UITma DNA polymerase (Thermotoga maritima)

Thành phần phản ứng PCR

41

Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima

Ảnh chụp SEM Thermus Aquus

Pfu polymerase từ Pyrococcus furiosus được

sử dụng khi mong muốn tăng độ chính xác vì

nó có khả năng hiệu đính—không giống như Taq polymerase.

Tli polymerase được phân lập từ Thermococcus litoralis cũng có 30 đến 50 hoạt động hiệu đính exonuclease để tạo ra các bản sao chính xác

 Dung dịch chứa cặp axit yếu/bazơ yếu liên hợp có khả năng chống lại sự thay đổi 

độ pH khi thêm axit mạnh hoặc bazơ mạnh.

Buffer

Phản ứng PCR cơ bản

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì nối tiếp (25 – 35 chu kì), mỗi chu kì

gồm 3 bước như sau:

 Biến tính (denaturation)

 Gắn primer (primer annealing)

 Kéo dài (extension)

Các chu kì của phản ứng PCR

Các chu kì của phản ứng PCR

• Phát triển nhanh nhờ sự phát hiện Taq DNA

polymerase và tự động hóa quá trình PCR

Tuy thiếu hoạt tính sửa sai, Taq DNA

polymerase vẫn được sử dụng rộng rãi.

• Từ lượng DNA ban đầu tương đương 0,1 pg

(10-13g) của trình tự mục tiêu 300 bp có thể

thu được khoảng 1 μg sản g sản phẩm khuếch đại

bằng PCR.

• Độ chính xác của sản phẩm khuếch đại có thể

được kiểm tra lại bằng cách tạo dòng, giải

trình tự và so sánh với nhiều trình tự khác

được khuếch đại một cách độc lập.

• Sản phẩm PCR có thể được nhìn thấy bởi sự

phát quang của EtBr sau khi điện di.

Sự khuếch đại gen

42

Thang chuẩn DNA

Kết quả điện di 5 μg sản L sản phẩm PCR của gen pflp (457 bp) với primer đặc hiệu

B

43

B

Primer thoái hóa (degenerate primer) là một hỗn hợp

các primer có trình tự tương tự nhau chỉ sai khác ở 1

hay vài vị trí

Ứng dụng: khi primer được thiết kế dựa trên trình tự

amino acid; tìm kiếm các thành viên của họ gen đã

biết hay tìm kiếm các trình tự tương đồng giữa các

loài

• Tối ưu hóa điều kiện PCR đặc biệt quan trọng

khi mồi thoái hóa được sử dụng Áp dụng

hot-start PCR, thêm DNA polymerase sau bước biến

tính của chu kì đầu tiên, ngay nhiệt độ của bước

• Một vấn đề PCR có thể xảy ra là khi đoạn primer PCR gắn với các trình tự bên ngoài DNA đích

Trong một số trường hợp, việc gắn primer sai có thể khuếch đại DNA không phải mục tiêu, nhưng kích thước của bộ khuếch đại PCR này hiếm khi có cùng kích thước với DNA mục tiêu thực sự Thông thường, tăng nhiệt độ ủ có thể giải quyết vấn đề, nhưng trong một số trường hợp, điều này là không đủ

Ngăn chặn những sai lầm

• PCR hot start là một biến thể của PCR thông thường làm giảm sự khuếch đại không đặc hiệu ở các

bước nhiệt độ thấp hơn của chu kỳ PCR, đặc biệt là trong quá trình thiết lập ban đầu

• Ý tưởng chính là ngăn chặn hoạt động của Taq polymerase ở nhiệt độ thấp

• Phương pháp vật lý chỉ đơn giản là giữ các thuốc thử cách xa nhau cho đến khi được kích hoạt

bằng nhiệt, nhưng cách này hơi cồng kềnh khi thực hiện số lượng lớn phản ứng PCR cùng một lúc

• Các phương pháp khác ức chế DNA polymerase bằng kháng thể hoặc ngăn chặn các protein được

giải phóng ở nhiệt độ cao Kháng thể hoặc protein chặn gắn vào vị trí hoạt động của Taq polymerase để nó không thể tổng hợp DNA Vì các protein và kháng thể không ổn định ở nhiệt độ

cao, nên bước biến tính ban đầu của chu kỳ đầu tiên sẽ phá hủy các protein hoặc kháng thể ngăn chặn, giải phóng Taq polymerase có đầy đủ chức năng

• => Cho nên việc sử dụng các DNA polymerase chịu nhiệt hot start rất hữu ích để ngăn chặn việc gắn

nhầm đoạn primer vì nó không thể tổng hợp DNA cho đến khi nó được nung nóng đến nhiệt độ cao

• DNA polymerase chỉ nhận ra 6 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ của mỗi đoạn primer, và do đó, không thực sự

sử dụng 5’ nucleotide của đoạn primer để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA Đầu 5’ đảm bảo rằng đoạn primer gắn với DNA đích với tính đặc hiệu và ổn định, nhưng đầu 5’ không nhất thiết phải gắn vào DNA đích Điều này cho phép các nhà nghiên cứu thiết kế các đoạn primer PCR dài hơn có đầu 5’ không gắn vào đích, được gọi là các đoạn primer PCR có đuôi

• Miễn là primer có đủ base để phù hợp với vị trí mục tiêu của nó, thì việc bổ sung thêm base vào cuối sẽ không ảnh hưởng đến phản ứng PCR Bộ khuếch đại PCR cuối cùng sẽ có trình tự đuôi bổ sung được thêm vào phần cuối của DNA đích vì các đầu đoạn primer được sao chép cùng với DNA đích trong chu kỳ khuếch đại thứ hai và hơn thế nữa

Chuỗi đuôi có thể chứa nhiều mục đích sử dụng khác nhau

• Ví dụ, DNA đuôi có thể chứa trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn, trình tự này sau đó có thể

được sử dụng để tạo ra phần nhô ra hữu ích cho việc nhân bản hoặc kết nối với một đoạn DNA khác

• Trình tự này cũng có thể chứa một trình tự bổ sung cho một đoạn DNA khác

• Các đầu mút này có thể được nhận ra bởi các enzyme cần thiết cho sự tái tổ hợp tương đồng,

điều này sẽ cho phép bộ khuếch đại PCR tích hợp vào bộ gen hoặc vectơ nhân bản khác

• Việc sử dụng sửa đổi PCR này thực sự chỉ bị giới hạn bởi độ dài của đoạn mồi PCR có thể được

tổng hợp theo kích thước ,nhưng vẫn cung cấp một sửa đổi rất hữu ích để phân tích sâu hơn về bộ khuếch đại PCR

Các dạng primer thoái hoá

Thiết bị PCR (Thermocycler)

Các ứng dụng của kỹ thuật PCR

47

• Sản xuất mẫu dò ( Probe ) Sản xuất nhanh mẫu dò bằng phương

pháp PCR với các nucleotide đánh dấu.

• Khuếch đại RNA thông qua kỹ thuật RT-PCR

• Định lượng bằng phương pháp PCR thông qua việc so sánh lượng

sản phẩm tạo ra với nồng độ đã biết của trình tự đối chứng được khuếch đại trong cùng phản ứng PCR.

Ứng dụng của kỹ thuật PCR

• Sự ngoại nhiễm

• Các sai sót do Taq

polymerase gây ra

• Hiệu quả phản ứng phụ thuộc

vào kích thước của trình tự cần

TaKaRa LA Taq TM  enzyme khuếch đại các đoạn DNA  

Reverse Transcriptase PCR

• Enzyme phiên mã ngược là một loại enzyme được tìm thấy trong retrovirus  chuyển đổi bộ gen RNA

mang trong hạt retrovirus thành DNA có thể tích hợp vào bộ gen của vật chủ. Đây là điều làm cho các 

bệnh như HIV trở nên khó khăn. Bộ gen của HIV trở nên tích hợp vào bộ gen của bệnh nhân và có thể tạo ra các hạt vi rút bất cứ lúc nào.

• Mặc  dù  là  một  enzyme  không  tốt  cho  người  nhiễm  HIV,  nhưng  enzym  phiên  mã  ngược  lại  là  một 

enzyme rất hữu ích cho nghiên cứu sinh học phân tử

• Phiên mã ngược tạo ra một chuỗi DNA bổ sung (complementary DNA ) dựa trên trình tự RNA

• Nhà nghiên cứu sử dụng enzyme phiên mã ngược để chuyển RNA thành DNA vì nó cho phép các mẫu RNA được khuếch đại theo cách tương tự như DNA

• Giống như các polymerase DNA khác, enzyme phiên mã ngược không thể tổng hợp DNA nếu không có đoạn primer DNA Đoạn primer DNA ngắn cung cấp điểm khởi đầu mà tại đó enzyme phiên mã ngược bắt đầu tạo bản sao DNA

• Kết quả DNA:RNA bị biến tính trong giai đoạn PCR của phản ứng này Sau đó, DNA sợi đơn được sử dụng làm khuôn để tổng hợp DNA sợi kép, được gọi là DNA bổ sung (cDNA), được khuếch đại

• Quy trình kết hợp này được gọi là PCR phiên mã ngược (RT-PCR)

• RT-PCR có thể chuyển đổi một mRNA cụ thể thành cDNA hoặc chuyển đổi toàn bộ mẫu mRNA

thành cDNA tùy thuộc vào đoạn primer được sử dụng trong phản ứng

• Trong một phản ứng RT-PCR cụ thể, nhà nghiên cứu thiết kế các đoạn primer có trình tự bổ sung

cho một vùng mRNA mục tiêu duy nhất Đoạn primer sẽ được sử dụng bởi cả enzyme phiên mã ngược và DNA polymerase ổn định nhiệt trong quá trình phản ứng, và mẫu cuối cùng sẽ có cDNA được tạo ra chỉ cho mRNA mục tiêu cụ thể

• Điều này được sử dụng cho các trình tự ngắn vì khó có được các bản sao cDNA có độ dài

đầy đủ, đặc biệt là từ mRNA chỉ hiện diện với số lượng rất thấp hoặc dài bất thường

Enzyme phiên mã ngược thường không đến được phần cuối của khuôn mẫu RNA dài do bị cản

trở bởi cấu trúc bậc hai của RNA, do đó đầu 5’ thường không đầy đủ Để có được một cDNA có

chiều dài đầy đủ đôi khi có thể cần nhiều bộ primer