vi khuan bacillus cereus 1 docx

cereus Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ đ

Bacillus cereus

1 Giới tiệu về Bacillus cereus:

Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới bacteria,

ngành (phylum) firmicutes, lớp (Class) Bacilli, bộ (Order) Bacillales, họ (Family) Bacillaceaem,

chi (Genius) Bacillus, loài (Species) Cereus

Trong chi bacillus này ngoài loài cereus còn có một số loài như:

Bacillus subtilis Bacillus coagulans Bacillus thuringiensis Bacillus natto

Paenibacillus larvae Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha

bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955 từ những năm

1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và

báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều

1.1 Đặc điểm Bacillus cereus:

Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ Vi khuẩn không tạogiáp mô, không có khả năng di động

Hình 1: Bacillus cereus trên kính hiển vi Hình 2: khuẩn lạc Bacillus cereus

trên môi trường BA

1.2 Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mộc

Hiếu khí và kị khí tùy nghi

Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC

ph 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2

Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì

Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng

Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh

ộc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố

Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rauquả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêuchảy có thể nguy hiểm đến tính mạng

Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậucác loại Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt

độ cao và dịch dạ dày

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho

sự phát triển của vi khuẩn

Triệ u c hứng tr ú ng độc:

Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc

Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Bệnh

có thể kéo dài 24 giờ

Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt Bắt đầusau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ

Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80oC trước khi ăn

Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực kiểm nghiệm Tuynhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao

Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc

di truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồngvài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao Những phương pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công nghệ thực phẩm hiện đại

2 Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus

2.1 Giới thiệu chung về độc tố của B cereus

Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là

phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độcthực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa sốcác nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992) Tỷ lệ thấp

hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada (2.2%) Ở Anh và

xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995

B cereus là một thực vật hoại sinh trong đất rất phổ biến Nó được phân lập từ nhiều

nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, từ thịt, các và các sảnphẩm từ thịt cá cũng vậy Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm là từnăm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêuchảy tại bệnh viện ở Oslo, Norway Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt độphòng cho đến khi sử dụng Để khẳng định B cerus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đã pháttriển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106ml-1 và uống 200ml cocktail Sau 13h, ông cảmthấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h Hơn 20 năm sau,

một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng B cereus gây ra lại xuất hiện ở các công

nhân người Anh Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn(chưa đến 5h), điều này cho thấy rằng đây là một sự nhiễm độc Ngày nay, bệnh này liên quanđến triệu chứng gây nôn mửa do B cereus

Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó,

những ngộ độc khác do B.cereus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng

mắt Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau.Bệnh nôn mửa được mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây ra ngộ độc này là dochuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) đã hình thành trước ở trong thực phẩm (ví dụ như Gạo) Triệuchứng bao gồm sự buồn nôn, sự nôn mửa ra và đau dạ dày (bảng 1-1) Bệnh tiêu chảy được mô

tả với thời kỳ ủ bệnh từ 8 – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, đi tiêu ra nhiều nước và đau thắttrực tràng (bảng 1-2) Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột

trong thời kỳ sinh trưởng của B.cereus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử

của vi khuẩn Thông thường cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là 24h vàkhông phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêuchảy có thể xảy ra, nguyên nhân có lẻ là do các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi

các bào tử của B.cereus sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột.

Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B Cereus

Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm

Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg

Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 - 30oC)

Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở

Cấu trúc của độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]

Hoạt động sinh học trên người Gây nôn

Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào

Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không

Việc sản sinh ra độc tố như thế nào Chưa biết, nhưng có thể liên quan đến enzyme

(not known, but probably enzymatically)2.2 Cơ chế gây bệnh

2.2.1 Triệu chứng nôn mửa

Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa đã được thể hiện ởbảng 1-1 Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn vềtriệu chứng này Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide ba lần lặp lại củabốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1)

Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa doBacillus cereus sản sinh ra Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợpđộc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê ra trên 3loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian Sự phântích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI– MS của phương pháp kính quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptidecủa nó Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (13C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu vàL-Val, trong khi đó chỉ có 40% 13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide

Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu

chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy Phần lớn những ngộ độc do Bacillus cereus gây ra chỉmới phát hiện sau này Cereulide được biết đến với cấu trúc bậc 1, với 1 dodecadepsipeptidetuần hoàn, với 12 góc lập thể trung tâm Hóa học lập thể được chỉ ra từ sản phẩm thủy phân làcác dipeptide kiềm tính, D-O-Leu, D-Ala, L-O-Val và L-Val Đó là 1 ion Kali mạnh, nó liên kếtyếu với các ion Li+, ion Na+, ion Cs+, nhưng với ion Rb+ nó lại liên kết mạnh nhất, hơn bất kỳ ionkim loại kiềm nào Cereulide tạo cấu trúc bậc 2 từ NMR và sự tính toán cơ học các phân tử đượcbiểu thị ở hình 1 Độc tố này là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành các ty lạp thể có chứa ATP

và các enzyme lien quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào trong các mô khác nhau Chúng ta bắtđầu quan tâm đến con đường sinh tổng hợp của độc tố này cho các chương trình phòng chốngngộ độc thực phẩm trong tương lai Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp tương tự nhưdodecadepsipeptide, valinomycin Agata – một trong nhiều tác giả đã nghiên cứu quá trình pháttriển và sinh độc tố của bacillus cereus trong quá trình tổng hợp trung gian một cách đầy đủ từCADM (hỗn hợp các amino acid) và đường sucrose (đường mía) Người ta nhận thấy rằng,bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh ra cereulide cấu trúc bậc 1 và 3 amino acidVal, Leu và Thr là cần thiết Những nghiên cứu khác về quá trình sinh tổng hợp cereulide có lẻ

là cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu tìm ra phương pháp ngăn chặn những ngộ độc từ thựcphẩm Xét đoán từ cấu trúc của 1, tiền thân của D-Ala, L-O-Val và D-O-Leu sẽ lien quan đếncác amino acid như L-Ala, L-Val, và L-Leu

Figure 2.ESI-mass spectrum of cereulide-K+complex upper trace Natural isotope abundancelower trace,13C enriched cereulide

Trong thí nghiệm này, chúng tôi chú trọng đến sinh tổng hợp trung gian của 3 amino acid

là L-Val, L-Leu, và L-Ala (0.1g/L có đến 99% nguyên tử cacbon ở dạng 13C trong cacboxylic, tất

cả 15 amino acid còn lại (0.1g/L), K2HPO4 (5g/L) và MgSO4.7H2O (0.05g/L), được tiến hành ởnhiệt độ 300C và thời gian là 24h, giữ ở tốc độ lắc là 200 rpm, chúng tôi thu được 2mg cereulide

có cùng độc tính ở điều kiện này đã được đánh dấu để phục vụ cho phân tích các nghiên cứu tiếptheo 1H NMR của mẫu này là đồng nhất với quang phổ đáng tin cậy ngoại trừ chất đồng vị củacacbon 13C ESI mass (interpreting Electrospray Mass Spectra) của nó xuất hiện ở 7 đỉnh trungtâm với m/z là 1201.48 khá hơn mức bình thường M + K với m/z là 1191.55 (thể hiện ở hình 2),

vì vậy cứ trung bình 10 đơn vị mass thì cao hơn bởi vì sự kết hợp cao của 13Cs Chính vì sự liênhợp cao của 13Cs vào phân tử cereulide đã thúc đẩy chúng ta trong việc đo lường mức quang phổNMR 13C của ion K+ trong phức hợp CDCl3 để đạt được mức quang phổ như ở hình 3, với số liệuđáng kể 171.4 (L-O-Val), 172.2 (D-O-Leu), 175.7 (L-Val) và 176.2 (D-Ala) đã được chuyểnsang mối tương quan giữa C-H của nó Tương ứng với cường độ của 3 cacbon (C6, C9, C12) củaL-O-Val, D-O-Leu và L-Val là nhiều hơn hai lần C6 D-Ala

Figure 3.13C NMR spectrum of cereulide-K+complex enriched at the 4 carboxyl or carboamide

atoms (Ã) Brucker AMX-600, 150 MHz for13C at 300 K

Figure 4.Decoupled NHs by irradiating a-protons

Tương tự với việc làm riêng các thí nghiệm đã đạt được với bức xạ β proton của 4 hợpphần amino hay oxy – acid Loại bỏ các kết quả đạt được với α proton của O-Val ở 4.61 ppm vớibức xạ β-H của nó ở 2.30 ppm để thay đổi từ bộ ba sang bộ kép (J=3.8 Hz cặp với 13C của O-Val) như đã thể hiện ở hình 5 Bức xạ β-H của L-Val ở 2.24 ppm đã làm thay đổi α proton củaVal ở 3.82 ppm từ bộ năm thành bộ ba (J=5 Hz) Cả hai kết quả trên đều chỉ ra được sự kết hợpcao cacbonyl cacbon của 13C tiền thân của các amino acid đối với L-O-Val và cả L-Val Chưa cókết quả chính xác nào về sự kết hợp của 13C, tuy nhiên trường hợp này lại đúng đối với Ala và O-Leu (hình 5) Sự chiếu xạ gốc metyl của Ala ở 1.47 ppm gây ra α-H của nó (4.27 ppm) giốngnhư sự pha trộn của bộ ba và bộ kép biểu kiến với J=4 và 5 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra)

có nghĩa là tỷ lệ sát nhập lại để tạo thành cacbonyl cacbon là không quá cao (không đạt đến100%) Sự chiếu xạ của β-Hs của O-Leu trong khoảng 1.84 ppm là không đạt kết quả bởi vì dảisóng tự nhiên của nó quá rộng Tuy nhiên, quang phổ NMR của 13C (hình 3) và những thínghiệm riêng lẻ (hình 4, 5) là những minh chứng gần như 100% của sự kết hợp 13C tiền aminoacid với 3 hợp phần (O-Leu, Val và O-Val) của cereulide

Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b protons.

Một phần trăm sự kết hợp của 13C là được xác định bởi phép đo phổ từ các sản phẩm thủyphân cereulide, vì vậy hai dipeptide thu được từ sự thủy phân bằng kiềm cereulide (1) với 0.1NKOH (hoặc 1N NH4OH) ở rt trong 30 phút Các sản phẩm thủy phân dipeptide là D-O-Leu-D-Ala và L-O-Val-L-Val, được phân tích bằng phương tiện ESI (electrospray ionization)- thướcMS/MS ở trên Q-TOF của phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK) Để làm đượcđiều này các chất đồng vị thừa và 13C kết hợp lại với nhau thành mẫu, pha loãng mẫu đó đến độhòa tan 10-100 pmol/μL trong 99,8% methanol: 0.2% acid formic trước khi bị electrospray ở5μL/phút

Ngày nay, L-Leu và L-Ala đã được chứng minh để xác định rõ là có được từ quá trìnhsinh tổng hợp cereulide, vì hai acid amin này là cần thiêt cho B cereus Một trong những khảnăng có thể được nghiên cứu là cả ba L-amino acid sẽ ít nhất một lần được biến đổi thành các α-keto acid và sau đó biến đổi thành D-O-Leu và L-O-Val hoặc là sự chuyển hóa amin để tạothành D-Ala Trong trường hợp này chỉ có acid pyruvic sẽ bị pha loãng bởi vì số gốc cao vì L-Ala là không cần thiết cho B cereus Nghiên cứu này có thể giải thích đến 95% sự kết hợp để tạothành D-O-Leu, L-O-Val, và L-Val khoảng (40%) sự kết hợp để tạo thành D-Ala

2.1.1 Triệu chứng tiêu chảy

Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quátrình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực

phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩmphục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận Điều này xảy ra khi, số lượngB.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruộtphải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng.Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn1% sơ với mức độ ban đầu Thời gian tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việcxuất hiện những triệu chứng của bệnh Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trongbảng 1-3 Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các độc tố đườngruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau

Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B cereus

Đặc tínhLiều gây nhiễm Thông thường là 105/g hoặc /ml

Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non

Loại độc tố Protein

Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h

Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h

Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn

Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người bị ảnh hưởng sau khi ăn thịt hầmvới khoai tây và rau Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105 Lần đầu tiên bùng phát (1992), 17 –

24 người bị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân phải nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầunặng ở 3 bệnh nhân này khá muộn (>24h) Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995khi mà 152 trong số 252 người Na-uy bị ảnh hưởng trong suốt thời gian tham gia giải vô địch vềtrượt tuyết Các đối thủ trẻ tuổi (16 – 19 tuổi) bị nhiễm triệu chứng này sau hơn 24 giờ ủ bệnh và

họ bị đau từ 1 đến vài ngày

Bào tử của B cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt

để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô củangười) Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hìnhthành tế bào B cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố,nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùngngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gâybệnh một cách trầm trọng Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâuhơn như đã quan sát

Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm từ B.cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận Cả dạng đơn

và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy Có hai

sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm B.cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọnglượng khoảng từ 40 – 100 kDa Một số hiểu biết hiện tại về độc tố đường ruột của B cereusđược thể hiện ở bảng 1-3

Bảng 1-3 Properties of Enterotoxin Isolated from Bacillus cereus

Enterotoxin/Reference Molecular Weight Biogogical Test Used DNA Sequenced

Three component 38.0 kDa Positive on: rabit loop tests, No

39.5 kDa vascular permeability tests,

vascular permeability tests,and mouse lethality tests

One toxin component 40 kDa Positive on: Vero cell test No

and one non-toxin 48 kDa and Ca-co2 (human intestinal

vascular permeability testsand mouse lethality testsNhững nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố chỉ có một hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan

Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừacác độc tố sinh ra từ B.cereus trong tương lai gần Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp pháthiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào.

3 Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào thời gian chokết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống

và phương pháp phân tích nhanh

Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gâybệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides,B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thửnghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khửnitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001%lysozyme, được trình bày trong bảng sau:

-Các đặc tính của Bacillus nhóm I

a + :90 - 100% các chủng dương tính ; b +/- : 50% các chủng dương tính; c - : 90 – 100% : các chủng âm tính; d - : Hầu hết các chủng âm tính.

Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb MannitolBromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môitrường này Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN

Yolk-Qui trình phân tích:

25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/ 1phút

để có độ pha loãng 10-1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp

Đ ịnh lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phát hiện bằng môi trường chọn lọc:

Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC:

MYP: do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạcB.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạothành

MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng

Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng địnhB.cereus

Các phản ứng khẳng định:

Nhuộm Gram:

Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinhdưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộmbằng vật kính 100X nhúng trong dầu

Các bước nhuộm Gram:

Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí tương ứnvới vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn -> chuyển một ít sinh khốikhuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng -> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dungdịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô ->đưa phiến kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi(tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa)

Tương tự cho hai chủng vsv đối chứng trong cùng một phiến kính khác: E.coli làm chủngđối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+).

Có hai phương pháp nhuộm Gram:

Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên 20giây ->dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài giọt KI/I2 lên vệt bôi/ để yên1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vàigiây -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dưbằng giấy lọc

Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng ddcrystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút -> khử màu bằng cáchxịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd safranin/2phút

Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+)

có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli) B.cereus là trựckhuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không códạng bào tử nang

Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinhdưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau

Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth ->

ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màumôi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí)

Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth ->

ủ 35oC/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu cam xuất hiện trong 10phút(chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)

Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử

Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid Ống Bcho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tínhvới nitrite.

Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ

glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid Để khôiphục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các loài vi sinh vật, sau

đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khácnhau Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic,acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2 Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhómkhông sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter).Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi vàmôi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase Ngược lạiacetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngoài raacetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệmVP

Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceace dựatrên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl Sự oxihóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol Diacetyl kết hợp vớinhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ Trong thuốcthử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine

C

ác b ư ớ c tiế n h à nh:

Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môitrường MR-VP), có pH 6.9 Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinhkhối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần

đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC / 24-48h hoặcđến 10 ngày Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Có 3 loại thuốcthử VP là:

Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B

là 40% KOH hoặc NaOH

Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH

Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH

Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đónhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường Lắc nhẹ ống 1 phút để oxihóa acetoin Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h.

Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -)

bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặtmôi trường

Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine ->

ủ 35oC/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy)

Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường Nutrient

Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme -> ủ ở

35oC/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và không chứa lysozyme -> những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không

Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không

C ác thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I :

Thử nghiệm tính di động:

Phương pháp 1: Dùng que cấy vòng cấy thẳng dịch 24h nuôi vào giữa môi trườngkiểm tra di động -> ủ 30oC/ 18-24h -> kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc, dọc theo đừơng cấy Kếquả: loài di động mọc khuýêch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy, loài không di độngmọc trong và dọc theo đường cấy

Phương pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạchnghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏnước vô trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểmtra sự di động.

Hầu hết các chủng B,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoideskhông di động

Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa

Nutrient agar -> ủ ở 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạo cấutrúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides(cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy)

Bacillus cereus (không có cấu trúc rễ giả)

Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)

Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy -> ủ ở

35oC/24h -> B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hòan tòan (β) 2-4 mm xung quanhvùng phát triển B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu β B.anthracis thường không làmtan máu sau 24h

Sự tạo độc tố protein dạng tinh thế: cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêng

nutrient agar -> ủ 30oC/ 24h -> để yên ở nhiệt độ phòng /2-3ngày -> nhuộm bằng phẩm màufuchsin -> quan sát dưới kính hiển vi

Tinh thể độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy, phát hiện đượcbằng kỹ thuật nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương đượcnhuộm màu tối, nhỏ hơn bào tử) Do đó nếu không quan sát được bào tử tự do cần để thêm vàingày rồi kiểm tra lại B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không tinh thể độc

Số tế bào B.cereus/1g thực phẩm = 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 5200000 (nhân 10 vì có 0.1

ml mẫu được trải dĩa)

3.2 Các phương pháp phân tích nhanh:

Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia phương pháp nàythành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên-kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit

3.2.1 Phương pháp miễn dịch:

Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên

bề mặt của tế bào vi sinh vật Dựa trên nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thànhphương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật

3.2.2 Phương pháp Elisa

3.2.2.1 Giới Thiệu Chung Về Elisa

Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) được tạm dịch là phương pháp phân tíchhấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, là phương pháp phân tích trong đó sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện kháng nguyên (thường là Protein)

Phương pháp Elisa được phát triển từ kĩ thuật RIA (Radio Immuno Assay) vào những năm

1960, bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Kĩ thuật này nhận biết kháng nguyên dựa trên sự đánh dấu phóng xạ kháng thể

Phương pháp phân tích Elisa được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học, dược học hay thực phẩm dựa trên liên kết kháng thể và kháng nguyên như: chuẩn đoán bệnh ung thư, HIV, các bệnh do vi sinh vật khác hay trong xét nghiệm nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm

Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ nhạy cao, phát hiện được liên kết kháng kháng nguyên ở mức độ nhất nhỏ, thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm hóa sinh, vi sinh truyền thống.

thể-Ở đây, khái niệm kháng thể hay kháng nguyên là có tính tương đối vì trong nhiều trường hợp kháng thể này có thể lại là kháng nguyên đối với kháng thể khác

Các enzyme sử dụng trong đánh dấu thường là: peroxidase, beta-galactoxidase, alkaline phosphatase

Hình 3.1 : Các giếng và pipettes trong phân tích Elisa

3.2.2.2 Các phương pháp phân tích Elisa

Phương pháp Elisa trực tiếp (Direct Elisa)

Trong trường hợp này, kháng nguyên nằm trộn lẫn trong dung dịch đệm sẽ được cho vào đáy giếng Kháng nguyên sẽ liên kết cố định vào bề mặt của đáy giếng Ủ một thời gian ngắn, sau đó tiến hành rửa trôi Những kháng nguyên nào không liên kết sẽ được đưa ra ngoài

Thêm dung dịch chứa kháng thể có gắn enzyme vào giếng, kháng thể sẽ liên kết với kháng nguyên tạo phức hợp gắn chặt vào giếng Ủ một thời gian để phức hợp ổn định, sau đó tiến hành rửa trôi Những kháng thể nào không liên kết với kháng nguyên sẽ được rửa trôi

Thêm dung dịch cơ chất có hệ đệm vào giếng Nếu có sự tồn tại của phức hợp kháng thể_E_kháng nguyên thì cơ chất dưới tác dung của E sẽ tạo màu cho dung dịch Dựa vào sự xuất hiện màu và cường độ màu trong dung dịch sẽ định tính và định lượng được kháng nguyên