Quá trình tái bản DNA

Theo CyberBridge, G0 là một giai đoạn giữa các pha đối với các tế bào không tái tạo, trong đó các tế bào sẽ không hoạt động cho đến khi cần có các tế bào mới.. Bởi vì tất cả các vật chất

BÀI 5: QUÁ TRÌNH TÁI BẢN DNA (DNA REPLICATION)

I Sự tái bản DNA trong chu kì tế bào:

- Khi nào DNA được tái bản trong chu kỳ tế bào?

+ DNA được sao chép trong giai đoạn interphase, giai đoạn của chu kỳ tế bào trước bốn giai đoạn nguyên phân: anaphase, prophase, prometaphase và telophase Theo CyberBridge, một trang web về khoa học sự sống do Đại học Harvard duy trì, sự sao chép DNA xảy ra trong giai đoạn S của interphase

https://i1.wp.com/cms.jackwestin.com/wp-content/uploads/2020/02/Cell-cycle-.jpg?

resize=922%2C796&ssl=1

+ Tế bào dành 90% thời gian của chúng trong khoảng thời gian giữa các pha, trong đó tế bào phát triển, sản xuất protein, sao chép DNA và chuẩn bị cho quá trình nguyên phân Cũng như phần còn lại của chu kỳ tế bào, các quá trình này xảy ra theo từng giai đoạn, không phải tất cả cùng một lúc Interphase được chia thành ba giai đoạn chính: G1, S và G2 Trong giai đoạn S của interphase, theo sau G1, tất cả các nhiễm sắc thể đều được sao chép Sau khi sao chép, mỗi tế bào bây giờ bao gồm hai cromatide chị em

+ Mặc dù số lượng DNA thực tế tăng gấp đôi, nhưng thể đơn bội, số lượng nhiễm sắc thể, vẫn không đổi Tế bào của con người vẫn lưỡng bội sau khi nhân đôi, có nghĩa là chúng duy trì số lượng 46 nhiễm sắc thể Nói cách khác, số lượng cromatide tăng gấp đôi trong quá trình sao chép Tuy nhiên, số lượng nhiễm sắc thể và tâm động vẫn không thay đổi

+ Sau khi sao chép, interphase tiếp tục vào giai đoạn G2 của nó, giai đoạn này tổng hợp protein Sau đó, tế bào vào phần còn lại của chu kỳ tế bào hoặc vào G0 Theo CyberBridge, G0 là một giai đoạn giữa các pha đối với các tế bào không tái tạo, trong đó các tế bào sẽ không hoạt động cho đến khi cần có các tế bào mới

- Tại sao tế bào tạo bản sao DNA của nó trước khi nguyên phân xảy ra?

+ Một tế bào tạo ra một bản sao DNA của nó trước khi nguyên phân xảy ra, do đó, có một

bộ DNA cho tế bào con sau khi quá trình nguyên phân đã xảy ra Vì mỗi tế bào cần một bộ DNA riêng nên phải có hai bộ DNA hiện diện trong một tế bào trước khi nó phân chia thành hai

+ Nguyên phân là quá trình phân chia tế bào để tạo ra một tế bào mới giống hệt tế bào ban đầu Các tế bào xôma, chẳng hạn như cơ, tóc và da, trải qua quá trình nguyên phân thường xuyên ở người và các sinh vật khác Đây là kiểu phân chia tế bào quan trọng cần thiết để tạo điều kiện sửa chữa các tế bào bị tổn thương, tăng trưởng và thay thế các tế bào cũ bằng các tế bào mới

+ Khi một tế bào mới được tạo ra, tế bào đó phải có cùng một thư viện thông tin di truyền

mà tất cả các tế bào khác trong cơ thể có quyền truy cập Bởi vì tất cả các vật chất trong tế bào mới phải đến từ tế bào đầu tiên, tế bào ban đầu phải tạo một bản sao DNA của nó trước khi hoàn thành quá trình nguyên phân Hai bộ DNA này chỉ tồn tại trong khoảng thời gian

tế bào phải trải qua quá trình nguyên phân, có thể từ 30 đến 90 phút trong một số tế bào nhất định của con người Khi quá trình phân chia tế bào hoàn tất, cả hai tế bào đều có một bản sao ADN giống hệt nhau

II Các mô hình tái bản

Dựa trên mô hình DNA của Watson và Crick, các giả thuyết về mô hình tái bản DNA gồm:

1 Cơ chế tái bản bán bảo toàn:

a) Cơ chế tái bản ở prokaryote:

- Đặc điểm cơ bản của sự tái bản đó là tái bản theo phương thức bán bảo toàn (semiconservative replication) Tái bản bán bảo toàn nghĩa là trong hai chuỗi của tất cả các phân tử DNA bao giờ cũng có:

+ Một chuỗi của DNA cũ (từ một trong hai chuỗi của DNA mẹ)

+ Một chuỗi của DNA mới (mới được tổng hợp)

- Mỗi một lần tái bản đều có sự tách rời của hai chuỗi của DNA mẹ, đồng thời mỗi chuỗi mẹ tiến hành sao chép để cho một chuỗi con, chuỗi này sau đó lại kết hợp với chuỗi mẹ

- Vị trí mở xoắn kép và tổng hợp DNA mới cùng một lúc trên DNA gọi là chạc ba tái bản (replication fork) do cấu trúc của vùng tái bản có hình chữ Y Sự tổng hợp DNA mới gắn liền với việc mở xoắn DNA cũ

b) Cơ chế tái bản ở eukaryote:

- Sự tái bản ở tế bào eukaryote phức tạp hơn so với ở tế bào prokaryote nhưng cơ chế của sự tái bản ở eukaryote cũng tương tự như ở prokaryote và tiến hành theo các nguyên tắc:

+ Hai hướng

+ Bổ sung, đối song song, theo chiều 5’ 3’

+ Không liên tục ở một trong hai chuỗi

+ Cần những RNA primer

- Tuy nhiên, có một số điểm khác như sau:

+ Trong khi ở prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu, thì sự tái bản ở eukaryote bắt đầu cùng một lúc ở nhiều điểm khởi đầu Điều này là cần thiết do DNA của eukaryote có chiều dài rất lớn

+ Vận tốc phát triển của chạc ba tái bản ở eukaryote (khoảng 50 nucleotide/s) chỉ bằng 1/10

so với ở E coli

2 Cơ chế tái bản bảo toàn (conservative):

Chỉ 1 phân tử tạo thành mang sợi khuôn kết hợp với nhau, các phân tử còn lại mang DNA hoàn toàn mới

3 Cơ chế tái bản phân tán (dispersive):

Các phân tử tạo thành mang 1 phần khuôn DNA và 1 phần DNA mới tổng hợp

~•~

Cơ chế phân tử của sự sao chép DNA:

Sao chép DNA phụ thuộc vào nhiều enzyme, để được thực hiện một cách hiệu quả DNA có bản chất là sợi kép và để được sao chép, cấu trúc này phải được giải nén Vị trí tháo gỡ ban đầu được gọi là điểm khởi đầu của quá trình sao chép Sau đó, các enzyme khác thêm các đoạn ADN mới vào sợi đã giải nén để tổng hợp hai phân tử ADN mới Điều này được gọi là sao chép bán bảo tồn và là cách sao chép DNA được chấp nhận nhiều nhất Các cơ chế sao chép DNA được đề xuất khác bao gồm sao chép DNA bảo thủ và sao chép DNA phân tán, nhưng những cơ chế này đã bị bác bỏ Cấu trúc hình chữ Y được tạo ra bởi quá trình tháo xoắn

và sao chép DNA được gọi là ngã bar sao chép

Hình 1: Phân tử DNA sợi kép ban đầu được tách thành hai sợi đơn, sau đó chúng đóng vai trò

là khuôn mẫu để tổng hợp hai sợi mới Những sợi mới này được gọi là sợi bổ sung bởi vì các cặp base nucleotide của chúng là “bổ sung” cho chuỗi mẫu ban đầu Do đó, adenine và cytosine trên một sợi sẽ luôn được ghép nối với thymine và guanine tương ứng trên sợi kia Kết quả của quá trình sao chép bán bảo toàn là hai phân tử DNA con có trình tự nucleotide giống hệt trình tự của phân tử mẹ và mỗi phân tử này có một mạch từ phân tử mẹ và một mạch mới được tổng hợp Thực tế là một mạch được bảo toàn từ phân tử mẹ chứ không phải cả hai,

đó là lý do tại sao mô hình sao chép DNA này được gọi là “bán bảo toàn”

Hình 2: Khi bắt đầu quá trình tự nhân đôi, ADN tháo xoắn, hai mạch ADN tách nhau dần dần

theo chiều dọc

Các nucleotide của mạch khuôn liên kết với nucleotide tự do trong môi trường theo nguyên tắc

bổ sung để dần hình thành mạch mới Hai mạch ADN mới được tổng hợp theo chiều ngược nhau

Khi quá trình tự nhân đôi kết thúc, 2 phân tử ADN con được tạo thành rồi đóng xoắn và sau này chúng được phân chia cho 2 tế bào con thông qua quá trình phân bào

Kết quả: Từ 1 phân tử DNA mẹ ban đầu hình thành nên 2 DNA con giống nhau và giống hệt DNA mẹ

(Phương thức sao chép này liên quan đến việc phân tách các chuỗi gốc, nghĩa là hai phân tử con sẽ có một chuỗi từ phân tử DNA mẹ Phương thức sao chép này đã được chứng minh là đúng bởi các nghiên cứu liên quan đến ly tâm và DNA huỳnh quang.)

Hình 3: Phương thức sao chép này liên quan đến việc phân phối DNA của cha mẹ vào DNA

mới được tổng hợp Các phân tử DNA con sẽ có khảm DNA mới và DNA mẹ

III Thí nghiệm Meselson-Stahl:

- Kiểu tái bản DNA được xác định bởi M Meselson và F W Stahl vào năm 1958

- Thí nghiệm phân biệt phân tử DNA ban đầu và DNA mới được tổng hợp dựa vào sự phát triển của E coli trong môi trường chứa 1 đồng vị nặng của ni-tơ N15 trước khi chuyển sang môi trường chứa N14 Mật độ DNA qua các thế hệ được phân tích bằng phương pháp ly tâm gradient tỷ trọng sử dụng CsCl

- Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý thuyết tái bản DNA theo

kiểu bán báo toàn (Hình 4.1) Các tác giả trên đã nuôi cấy E coli trong nhiều thế hệ trong một

môi trường chứa 15NH4Cl làm nguồn cung cấp nitrogen duy nhất Bằng cách này, DNA được tổng hợp có 15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng xạ thông thường 14N) Ở một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyển nuôi cấy vào một môi trường chứa 14NH4Cl Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họ phân tích DNA chiết xuất từ vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo gradient CsCl

+ Hình 4.1 Minh họa sự tái bản bán bảo toàn Sơ đồ trình bày sự hợp thành các sợi đôi DNA sau: 0, 1, và 2 vòng sao chép H: chuỗi nặng (15N), L: chuỗi nhẹ (14N)

- Kết quả thực nghiệm cho thấy:

+ Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N

+ Sau một thế hệ trong môi trường chứa 14N: những phân tử DNA gồm một chuỗi nặng 15N (chuỗi mẹ) và một chuỗi nhẹ 14N (mới được tổng hợp)

+ Sau hai thế hệ trong môi trường chứa 14N: có hai phân tử lai (gồm một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ) và hai phân tử đều gồm những chuỗi nhẹ không có chuỗi nặng

IV Quy trình tái bản DNA:

- Xảy ra ở giai đoạn interphase

- Thành phần tham gia:

+ Protein nhận biết và bám vào điểm khời đầu tái bản (ori) đễ hình thành phức hợp mở (ở E.coli là dnaA)

+ DNA gyrase: mở cuộn DNA siêu xoắn phía trước mỗi chạc tái bản

+ Helicase: tháo xoán các sợi DNA mạch kép, hình thành các vùng sợi đơn (ở E.coli là dnaB)

+ Primase: Tổng hợp các đoạn mồi RNA (ở E.coli là protein dnaG)

+ Protein SSB (single strand binding protein): bám vào vùng DNA sợi đơn do Helicase tách

ra, giữ tạm thời không cho DNA xoắn lại

+ DNA polymerase IlI: là enzyme chính tham gia quá trình tổng hợp DNA, có hoạt tính polymerase 5'-3' và hoạt tính exonuclease 3'-5'

+ Topoisomerase : là enzyme giúp DNA không còn siêu xoắn

- Quy trình:

+ Chuỗi xoắn kép DNA bao gồm 2 mạch bắt cặp bổ sung

+ Mỗi mạch có thể làm nền để tổng hợp nên mạch mới

+ Cách thức tái bản như vậy được gọi là mô hình bảo thủ một nửa (semiconservative) + Một mạch được tổng hợp liên tục, một mạch được tổng hợp không liên tục (các đoạn ngắn sau đó được nối lại) được gọi là sao chép bán liên tục

+ Cần mồi RNA primer

- Sự sao chép DNA:

+ Enzyme helicase sẽ tháo xoắn DNA

+ Các SSB protein bám vào DNA để gúp chúng tách ra:

- Enzyme Primase sẽ tạo ra RNA Primer ở 2 mạch để giúp DNA Polymerase bắt đầu.

- Một mạch được sao chép liên tục (leading trand) hướng vào ngã ba sao chép (replicating fork)

- Một mạch được sao chép không liên tục(lagging strand) tạo ra các đoạn 1-2kb Okazaki theo hướng ngược lại (hướng ra khỏi ngã ba sao chép)

- Điều này đảm bảo cả hai mạch được sao chép theo đúng chiều 5’-3’:

- Enzyme Exonuclease sẽ loại bỏ các RNA Primer này ở cả 2 đầu:

- 1 Enzyme polymerase khác sẽ tổng hợp các đoạn còn thiếu này.

- Enzyme DNA Ligase sẽ nối các đoạn okazaki lại

- Kết quả là tao ra 2 sợi DNA giống hệt nhau

- Tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semi-conservative): Môt sợi cũ làm khuôn, tổng hợp thêm 1 sợi mới

V DNA polymerase (ở EUK, VK, các protein tham gia quá trình tái bản):

1 DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase)

Đây là enzyme chủ yếu của sự tái bản, chịu trách nhiệm tổng hợp hai chuỗi DNA ở chạc tái bản

- Có nhiều loại DNA polymerase α, β, γ, δ, ε khác nhau về phân tử lượng và đặc tính hóa học

- Polymerase γ phân bố trong ti thể các polymerase còn lại ở trong nhân

- Có sự tham gia của nhiều protein chuyên biệt: các kháng nguyên trong nhân tế bào đang phân chia giúp hoạt hóa và cho phép polymerase δ, ε gắn ổn định với mạch khuôn; các yếu tố sao chép RFA, RFC hỗ trợ cho hoạt động của polymerase

- Các đặc tính của DNA pol:

 Gắn nucleotitde vào 3’OH vào mồi và 3’OH của sợi đang tăng trưởng

 Kéo dài chuỗi theo hướng 5’-3’ (dọc theo hướng 3’-5’ của sợi khuôn)

 DNA pol III kéo dài chuỗi DNA

 DNA polymerase I loại bỏ RNA mồi nhờ cắt đầu 5’®3’ và thay vào chỗ RNA mồi bằng DNA khác

 DNA polymerase II chưa rõ tác dụng, có lẽ nó tham gia vào quá trình sửa chữa (thay một đoạn DNA hỏng bằng một đoạn DNA bình thường) hoặc thay thế DNA polymerase I khi có khó khăn trong tổng hợp DNA

- Về tốc độ làm việc, các DNA polymerase rất khác nhau Trong một giây, DNA polymerase I gắn được 10 dNTP trong khi DNA polymerase II chỉ gắn được 0,5 dNTP và DNA polymerase III gắn tới 150 dNTP

 Hoạt động của DNA pol III sợi tiến chậm.

 Mô hình Korgberg: Sợi khuôn tạo 1 vòng bao quanh DNA pol III

Ở EU quá trình tái bản DNA cơ bản giống ở PRO nhưng cũng có một số đặc trưng riêng

 Trên một số phân tử DNA khuôn quá trình tái bản xảy ra đồng thời ở nhiều điểm

 Vận tốc tái bản chậm hơn Pro:

+ Pro: v= 500 Nu/s

+ EU: v= 50 Nu/s

 Một số enzyme khác ngoài Pro:

+DNA polymerase α

+DNA polymerase β

+DNA polymerase 

+DNA polymerase 

1 DNA polymerase I của E Coli

Do Kornberg phát hiện năm 1955 DNA polymerase I của E coli mang chuỗi polypeptide

có khối lượng phân tử là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt Nhiệm vụ chính của DNA polymerase I là xúc tác cho quá trình lắp ráp các dNTP từng cái một vào đầu 3’ tự do của đoạn mồi đang gắn trên DNA khuôn mẫu Kết quả là sợi DNA mới sẽ dài dần về phía đầu 3’

Enzyme này dịch chuyển điểm đứt (nick) của DNA, nick là điểm đứt trên một sợi của DNA sợi đôi Chức năng chính của enzyme là sửa sai dọc theo phân tử DNA Nếu gặp chỗ sai sót, nó sẽ đi ngược lại để cắt bỏ sau đó mới tổng hợp DNA DNA polymerase I của E coli mang chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử (M) là 109.000 Da với ba hoạt tính riêng biệt:

- Hoạt tính polymerase 5’→3’ DNA polymerase I của E coli xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’→3’ bằng cách bổ sung các gốc nucleotide vào đầu tận cùng 3’- OH được tạo ra khi một sợi của phân tử DNA sợi đôi bị đứt

- Hoạt tính exonuclease 3’→5’ DNA polymerase I của E coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi

sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai

- Hoạt tính exonuclease 5’→3’ DNA polymerase I của E coli có thể chuyển chỗ các nucleotide từ phía 5’ của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3’ tạo ra chuyển động của điểm đứt dọc theo DNA

– Xử lý thủy phân nhẹ cho ra 2 polypeptide

• Phần Klenow

• Phần nhỏ hơn

- Ứng dụng chính:

+ Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt

+ Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA

+ Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide

2 Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E coli

Có 2 chức năng: Polymerase và hoạt tính 3’-5’ exonuclease giúp nó có khả năng đọc ngược (proofreading)

– Nếu pol I thêm nt sai, sự bắt cặp giữa các base không đúng

– Pol I dừng lại, exonuclease loại bỏ nt không bắt cặp

– Cho phép quá trình sao chép tiếp tục

– Làm tăng tính trung thực của quá trình sao chép

5’→3’ exonuclease

Hoạt tính này cho phép pol I cắt tại một đầu của chuỗi DNA đang hình thành:

• Loại bỏ và thay thế một chuỗi khi nó đi qua

• Là chức năng cơ bản khi:

– Loại bỏ primer

– Sửa chữa cho đứt (nick)

Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3’ của DNA

sợi đôi Do DNA polymerase I có ba hoạt tính, nhưng hoạt

tính exonuclease 5’→3’ ít sử dụng nên Klenow đã dùng

protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó Vì vậy, khối lượng

phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da (được gọi là đoạn

lớn của DNA polymerase I)