Các phương pháp sắc kí

Các phương pháp sác kí trong môn Hóa học phân tích

Các phương pháp sắc kí

Sắc kí là gì?

Vấn đề: Hỗn hợp các chất: Vitamin B1, B2, B3, B6, B12 trong mẫu sữa bột à xác định hàm lượng từng chất xem có đáp ứng đúng yêu cầu và số lượng đưa

ra trên bao bì của sản phẩm?

Cách giải quyết:

l Tách riêng từng chất sau đó xác định hàm lượng các chất bằng cách đo mật thụ quang của các chất

l Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC): xác định đồng thời các chất.

Hệ máy HPLC

Sắc kí đồ của mẫu gồm B1, B2, B3, B6, B12

Sơ đồ khối của

chứa dung môi

Bơm tạo

áp suất cao

Bơm mẫu

Cột sắc kí

Nước thải

Xử lí và hiển thị tín hiệu

Quan trọng nhất: nơi xảy ra sự tách chất!

l Detector: UV-VIS.

Định nghĩa

l Sắc kí: quá trình tách chất dựa trên sự phân bố liên

tục của các cấu tử phân tích lên pha tĩnh và pha động.

l Pha tĩnh: pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu

các chất phân tích.

l Pha động: Pha di chuyển qua pha tĩnh.

l Do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Chất phân tích

F2F3

Quá trình tách sắc kí

Nếu ghép nối cột với detector: ghi lại tín hiệu theo thời gian, thu được sắc kí đồ̀̀

Các loại tương tác trong sắc kí (a) hấp phu trên bề mặt rắn; (b) tương tác phân bố; (c) tương tác trao đổi ion; (d) (size exclusion) sàng lọc kích thước

Các đại lượng đặc trưng cho sắc kí

Thời gian lưu

l Thời gian lưu (tR) : tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tơi khi pic đạt giá trị cực đại

l Thời gian trống (chết): tm

(đối với các cấu tử không bị lưu giữ trên cột)

l Thời gian lưu hiệu chỉnh : tR’ = tR -tm

l Thể tích lưu : VR = F.tR

F: tốc độ chảy của pha động

l Thể tích lưu hiệu chỉnh : VR’ = F.tR’

Tăng độ phân giải?

l Tăng khoảng cách giữa các pic sắc kí, tăng thời gian lưu thông qua k.

l Làm giảm độ rộng pic : tăng hiệu suất tách

l Retention factor: Hệ số lưu k

'

=

Bài tập

l 1) Tính hệ số lưu của acid butyric, biết

thời gian lưu của acid butyric trong sắc kí

đồ là 7.63 phút Thời gian trống của cột là 0.31 phút.

l

Tăng hiệu suất tách

l Thuyết đĩa lý thuyết

l Chiều cao đĩa lý thuyết

l Thuyết tốc độ, phương trình Van-Deemter

Thuyết đĩa lý thuyết

đó có cân bằng phân bố của chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh

l Hiệu suất cột được quyết định bởi số đĩa lý

thuyết : số đĩa lý thuyết càng lớn, hiệu suất tách càng lớn

l Công thức tính số đĩa lý thuyết (N):

l Chiều cao đĩa lý thuyết (H):

2

2 / 1

2

54.516

t

Độ rộng chân pic Độ rộng nửa pic

Thời gian lưu

N L

H = Chiều dài cột

Bài tập

l Tính số đĩa lý thuyêt (n) của cột sắc kí và chiều cao đĩa

lý thuyết (H) Biết thời gian lưu: tRA = 280s, tRB = 300s,

độ rộng pic: wA = 14s, wB = 15s Cột có chiều dài L = 3,2 m

Giải:

Đối với pic A:

Đối với pic B:

Chiều cao đĩa lý thuyết:

640014

28016

16

2 2

300 16

16

2 2

05

0 6400

320

cm N

L

Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter

l Thuyết tốc độ: Các yếu tố như đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột và các yếu tố tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh hưởng nhiều đến sự dãn rộng vùng chất phân tích hay độ rộng của pic thu được

l Chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do 3 thành phần H1, H2, H3:

l H = H1 + H2 +H3

Phương trình Van Deemter:

s Kd D

C = 2 /

m

p m

D

d C

Chiều dày pha

tĩnh

Hệ số khuếch tán trong pha tĩnh

Tìm chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu

l Cách 1: Xác định Hmin từ đường cong thực nghiệm

l Cách 2: Lấy đạo hàm của phương trình Van Deemter:

l Tại cực tiểu, H’= 0 hay

l

C u

C

B

ut.u =

C B A

Hmin = + 2

Bài tập

l Một cột sắc kí mao quản dài 30 m, chạy một chất chuẩn ở hai tốc độ pha động khác nhau, cho các số liệu sau:

Tốc độ (cm/s) Số đĩa lý thuyết0.5 150 000

1 120 000 Xác định vận tốc tối ưu, chiều cao đĩa lý thuyết và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó

Giải:

Tính chiều cao đĩa lý thuyết trong 2 thí nghiệm

Thí nghiệm 1: H1= 30000/150 000 = 0.02 cm

Thí nghiêm 2: H2 = 30 000/120 000 = 0.025 cm

l Viết phương trình Van Deemter cho 2 trường hợp:

l Với TN1 thay số H = 0.02cm; u=0.5 cm/s; A =0 (do đây

0 5

0

02

025

B

u t u 0.5 /

02.0

005

0

l Chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu:

l Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là:

cm C

B

150000 02

0

3000

=

=

n

Các cách để tăng độ phân giải

l Thay đổi cấu trúc cột

¡ Tăng chiều dài cột

¡ Giảm kích thước hạt nhồi

¡ Thay đổi pha tĩnh

¡ Giảm đường kính cột

l Tối ưu vận hành cột:

¡ Chỉnh tốc độ pha động tối ưu (ứng với H nhỏ nhất)

¡ Giảm nhiệt độ cột (với GC)

¡ Thay đổi thành phần pha động (với LC)

Phương pháp sắc kí khí

Hệ sắc kí khối phổ GC-MS

Sắc kí khí

l Pha động: khí trơ

l Pha tĩnh: rắn hoặc lỏng

l Bơm mẫu vào pha động là chất khí (khí́ mang).

l Khí + Mẫu chạy đến cột mao quản.

l Các chất trong mẫu được tách ra khỏi nhau dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng trong pha động và pha tĩnh.

l Sau khi đi ra khỏi cột chất phân tích chạy đến

detector à tạo tín hiệu.

Sơ đồ khối của hệ sắc kí khí

Khí

mang

Bơm mẫu

Cột săc kí

33 12/9/2013

CỘT TÁCH TRONG SẮC KÍ KHÍ

Cột nhồi vs Cột mao quản

Chọn pha tĩnh như thế nào?

l Chọn theo nguyên tắc: các chất tương tự nhau

sẽ hòa tan vào nhau.

l Chất phân cực: pha tĩnh phân cực

l Chất phân tích không phân cực: pha tĩnh

Th Thứ ứ ttự ự rrử ửa a giả giải trong GC i trong GC

n Phụ thu Phụ thuộ ộc c 2 2 y yếếu t u tố ố::

n Nhi Nhiệệt đ t độ ộ sôi sôi củ của ch a chấất tan: t tan: ch chấất t có có nhi nhiệệt đ t độ ộ sôi th sôi thấấp p à à

ra tr

ra trướ ướcc, , ch chấất t có có nhi nhiệệt đ t độ ộ sôi cao sôi cao à à ra sau ra sau.

n Tương Tương tá tác trong GC c trong GC: : tương tương tá tác phân b c phân bố ố gi giữ ữa ch a chấất tan t tan

trướ ướcc, , ch chấất t íít phân c t phân cự ực hơn ra sau c hơn ra sau.

•• Pha Pha tĩ tĩnh phân c nh phân cự ựcc: : ch chấất t íít phân c t phân cự ực hơn ra tr c hơn ra trướ ướcc, , ch

chấất phân c t phân cự ực hơn ra sau c hơn ra sau

n Ví dụ: : D Dự ự đ đoá oán th n thứ ứ ttự ự rrử ửa a giả giải khi i khi tá tách ch

Điều khiển nhiệt độ – chương trình nhiệt độ

l Rất quan trọng đối với sắc kí khí

l Côt được đặt trong lò có thể thay đổi và điều khiển nhiệt độ

l Chế độ đẳng nhiệt: nhiệt độ không đổi và thấp hơn một chút so với nhiệt độ sôi của cấu tử tan

l Chế độ chương trình nhiệt độ: trong trường hợp các cấu tử có nhiệt độ sôi quá khác nhau Ban đầu đặt

nhiệt độ không đổi với cấu tử có nhiệt độ sôi thấp sau

đó tăng nhiệt độ lên gần nhiệt đô sôi của cấu tử có

nhiệt độ sôi cao.

Các loại detector

l Detector độ dẫn nhiệt (TCD)

l Detector ion hóa ngọn lửa (FID)

l Detector bẫy điện tử (ECD)

l Khối phổ (MS)

l Detector quang hóa ngọn lửa, detector hồng ngoại chuyển hóa Fourier (FT-IR),…

Nhược điểm: giới hạn phát hiện

thấp

l Ưu điểm:

l Vừa định tính vừa định lượng

l Giới hạn phát hiện thấp

Ứng dụng của GC

l Phân tích môi trường:

Khí nhà kính (CO2, CH4, NOx ); thuốc trừ sâu;

trihalomethan trong nước

l Phân tích lâm sàng:

Các loại thuốc, alcohol trong máu

l Thực phẩm:

Các hợp chất bay hơi trong gia vị và mùi hương; vết hữu

cơ trong rượu wiski, monomer trong sơn

l Công nghiệp hóa dầu:

Độ tinh khiết của dung môi, thành phần của xăng,

Đánh giá phương pháp GC

l Phân tích được hàm lượng nhỏ các chất, lượng mẫu nhỏ

cỡ µL

l Độ đúng: tùy thuộc vào mẫu, dao động từ 1-25%.

l Độ chính xác: phụ thuộc vào quá trình lấy mẫu, xử lí mẫu

và thiết bị đo Độ lệch chuẩn của thiết bị thường từ 1-5%.

l Độ nhạy: tùy thuộc vào từng loại detector.

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

52 12/9/2013

Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản sau :

Degasse Pump

Bơm mẫu (bằng tay hoặc tự động)

Cột sắc ký (Pha tĩnh) (có thể dùng bộ điều nhiệt)

Detector (nhận tín hiệu)

Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử

lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.

In dữ liệu

Cột HPLC

Loại 1:

Ống thép không rỉ, đường kính 2.1 - 4.6 mm; chiều dài:

30-300 mm.

Bên trong nhồi hạt silica xốp, đường kính 3-10 µm

Hiệu suất tách: 40 000 - 60 000 đĩa lý thuyết/m

Loại 2: Cột mao quản

Silica nung chảy, đường kính trong: 44-200 µm; chiều dài: 50-250 mm.

Bên trong nhồi hạt silica xốp, đường kính hạt 3-5 µm.

Hiệu suất tách: 250 000 đĩa lý thuyết

(Tại sao hiệu suất tách của cột mao quản lại cao hơn nhiều? Tại sao cột HPLC lại ngắn hơn nhiều so với cột GC?)

¡Sử dụng cột bảo vệ đặt trước cột phân tích.

¡Cột bảo vệ: tương tự cột phân tích nhưng ngắn hơn

và rẻ tiền hơn

Sắc kí pha thường và sắc kí pha đảo

l Tùy thuộc vào gốc R pha tĩnh có thể có các tính chất khác nhau.

l Nếu R chứa nhóm chức phân cực (cyano, amino,

diol, ) à pha tĩnh là phân cực, pha động không phân

cực hoặc ít phân cực: sắc kí pha thường.

l Nếu R không phân cực (n-octyl C8 hoặc n-octyldecyl C18) à pha tĩnh không phân cực, pha động phân

cực: sắc kí pha đảo.

l Sắc kí pha đảo được sử dụng phổ biến hơn nhiều so với sắc kí pha thường.

Thứ tự rửa giải trong HPLC

l Thứ tự rửa giải trong HPLC được quyết định bởi độ

phân cực của chất tan

l Sắc kí pha thường: pha tĩnh phân cực: chất có độ phân cực nhỏ sẽ ra trước, chất có độ phân cực lớn sẽ ra sau

l Sắc kí pha đảo: pha tĩnh ít phân cực: chất có độ phân cực lớn sẽ ra trước, chất có độ phân cực sẽ ra sau

l Vai trò của pha động là như thế nào???

Pha động trong HPLC

l Pha động: các dung môi không phân cực như benzen, n-hexan, các dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril,…

l Với cùng một cột sắc kí, thời gian lưu của chất tan có

thể được thay đổi bằng cách thay đổi tính chất của pha động

l Sắc kí pha thường: thời gian lưu dài hơn khi pha động ít phân cực hơn

l Sắc kí pha đảo: thời gian lưu dài hơn khi pha động phân cực hơn

l Độ phân cực của dung môi: được đánh giá bằng hệ số phân cực (trong các bảng hệ số phân cực)

Tăng độ phân giải

1) Sử dụng các phản ứng hóa học: thay đổi pH, phản ứng tạo phức,

Ví dụ: với hỗn hợp các axit-bazơ yếu, bằng cách thay

đổi pH, thay đổi dạng tồn tại từ trung hòa sang ion à

thay đổi độ phân cực à tách được các chất

2) Thay đổi dung môi

Ví dụ: để tách acid benzoic ra khỏi hydroxybenzoic acid,

sử dụng dung môi là acetonitril thay cho tetrahydrofuran,

vì trong dung môi acetonitril benzoic acid bị rửa giải

nhanh hơn là p-hydroxybenzoic acid, trong khi trong

tetrahydrofuran, thời gian lưu của 2 chất này là gần bằng nhau

Bơm trong HPLC

l Muốn pha động chuyển động: cần có hệ thống bơm với

áp suất cao (bơm cao áp)

l Trước khi bơm dung môi vào cột: cần loại bỏ các bọt khí

có trong dung môi bằng thổi khí trơ qua dung môi; loại các hạt bụi nhờ hệ thống lọc

l Bơm cao áp: nén qua màng và nén bằng pittong

l Sử dụng một hoặc nhiều bơm: thay đổi thành phần pha động bằng cách thay đổi tốc độ bơm

Bơm mẫu

l Không bơm trực tiếp vào pha động, phải sử dụng vòng bơm mẫu

l Vòng bơm mẫu: thường

có 6 cửa, có vòng mẫu dung tích khác nhau từ 5 – 50 µL

- Van ở vị trí load: mẫu được đưa vào qua siranh hoặc bơm mẫu tự động

- Xoay 600, van ở vị trí bơm: bơm đẩy dung môi qua vòng mẫu, mang theo mẫu vào đầu cột

l Detector điện hóa: độ dẫn, điện lượng, đo

dòng,…

hạn phát hiện: 1 – 10 pg.

l Detector hệ số khúc xạ (refractive index): có thể

áp dụng với mọi chất nhưng giới hạn phát hiện cao: 100 ng – 1 µ g.

Detector UV-VIS.

Detector điện hóa

Detector đo dòng

- Áp dụng tốt với những chất có khả năng oxi hóa hoặc khử

- Giới hạn phát hiện: 10 pg - 1 ng

Các loại sắc kí lỏng khác

l Sắc kí trao đổi ion: pha tĩnh là nhựa trao đổi ion, phù hợp để xác định các anion và cation.

l Sắc kí rây phân tử: pha tĩnh là hạt silica xốp

hoặc polimer xốp, tách chất dựa trên sự khác nhau về kích thước hạt, chủ yếu để xác định các phân tử lớn và phân tử sinh học.

l Sắc kí điện di mao quản: tách chất dựa trên đô linh động điện khác nhau của chất dưới tác

dụng của điện trường