Các phương pháp sắc kí

Sắc kí lọc gelGel Permeation Chromatography Size Exclusion Chromatography • Bản chất: Sự tách riêng biệt các phân tử protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và MW, khi hỗn hợp prote

CÁC PH ÁC PH ƯƠ ƯƠ NG PHÁP S C KÍ NG PHÁP S C KÍ Ắ Ắ

PROTEIN

Lê Th H ng Chuyên ê Th H ng Chuyên ị ồ ị ồ

D ươ ươ ng Minh Th nh ng Minh Th nh ạ ạ Nguy ễ ễ n Th Đan Thuỳ n Th Đan Thuỳ ị ị Nguy ễ ễ n Th Thu Trang n Th Thu Trang ị ị Nhóm thực hiện:

Khi đã có nguồn cung cấp protein, việc tiếp theo là tinh sạch và xác định tính chất của nó Quá trình trên được thực hiện theo sơ đồ:

SEC-Size exclusion Chro.

(Gel permeation Chro.) (Gel filtration Chro.)

• IEC-Ion exchange Chro.

• Affinity Chro – IAC

1 Sắc kí lọc gel

(Gel Permeation Chromatography Size Exclusion Chromatography)

• Bản chất: Sự tách riêng biệt các phân tử

protein dựa trên sự khác biệt về hình dạng và

MW, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo nền chất mang có kích thước lỗ qui định theo

cơ chế thẩm thấu.

 sự khuyếch tán chọn lọc

Column

• Φ= 10mm L= 500-1000mm

• Các hạt polymer có kích thước xác định

– Dextran: Sephadex G & Sephacryl S (Pharmacia)

– Polyacrylamide: Bio-Gel P (Bio-Rad)

– Agarose: Sepharose CL & Superose (Pharmacia) hay Biogel A (Bio-Rad) – Polyacrylamide-agarose: Ultrogel AcA (LKB Instruments)

– Ethylene glycol-methacrylate: Fractogel HW (Toyo Soda Company-TSK

………

• Dung môi được đưa vào cột với tốc độ 1 ml/phút, áp suất 50 - 200 bar

• Tăng qui mô  tăng Φ cột nhưng vẫn giữ small depth  tăng số cột

• Kết quả thường làm loãng  cô đặc

2 Sắc kí trao đổi iôn

(IEC -Ion Exchange Chromatography)

• Bản chất: dựa trên sự tương tác hấp dẫn ion thuận nghịch giữa protein và nền chất trao đổi ion ở giá trị pH qui định.

Anion Exchange Chromatography

(AEC)

• anion exchange resins are Q-resin, a

Quaternary amine; and DEAE resin,

- Buffer B = 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH= 8

• Protein khó tan/ pI cao

- Buffer A = 30 mM Ethanolamine, 8M urea,

pH=10.0

- Buffer B = 30 mM Ethanolamine, 8M urea,

1 M NaCl, pH=10.0

• Chạy dung dịch theo gradient với

nồng độ muối tăng dần đến 1M NaCl

Cation Exchange Chromatography

(CEC)

• cation exchange resins are S-resin &

CM resin

• primary step (high capacity)

• Ít phổ biến bằng AEC (P không gắn

resin ở pH sinh lí  chuẩn pI)

• Chạy dung dịch theo gradient với

nồng độ muối tăng dần đến 1M NaCl

Cải tiến

• Kết hợp chất mang lọc gel và TĐ ion

VD: DEAE sephadex & DEAE sephacel

• Hãng Merk:

 chất mang trao đổi ion nền Fractogel

 sản xuất công nghiệp.

 chất TĐ ion kiểu tua: tay nối mềm là mạch polymer (oligoacrylamide) chứa nhóm –OH  nền silicagel/ polymer hữu cơ có độ cứng cơ học cao hơn nhiều

3 Sắc kí kị nước

(Hydrophobic Chromatography)

• Bản chất: dựa trên tương tác giữa các nhóm chức có tính

kị nước nằm trên bề mặt phân tử protein (thường là các a.a có tính kị nước) và chất mang thường là mạch

hydrocarbon 8-18 nguyên tử C.

4 Sắc kí ái lực

(Affinity Chromatography)

• Bản chất: dựa trên khả năng gắn rất đặc hiệu của phân tử protein trên bề mặt hạt chất mang thông qua những tay nối ligand đặc hiệu.

Ứng dụng cột AC Sephadex G75 để tinh chế Concanavalin A từ hạt đậu rựa trồng ở VN

Nguyễn Vǎn Lợi - Đào Kim Chi- Nguyễn Thị Thanh Loan - Đỗ Ngọc Liên Trường đại học Dược Hà Nội-Trường đại học Khoa học tự nhiênI

Lectin:

• Protein ( chủ yếu glycoprotein)

• Động vật, thực vật, vi sinh vật &

người

• Nhiều đặc tính hoá sinh quan trọng :

- khả nǎng tương tác và nhận biết các loại

tế bào

- liên kết đặc hiệu của lectin với các

glycoprotein

 miễn dịch học, y dược: chẩn đoán

ung thư, chẩn đoán và phòng ngừa

bệnh suy giảm miễn dịch AIDS

• lectin thuộc các họ đậu (Fabaceae)

và họ dâu tằm (Moraceae) có nhiều

tiềm nǎng ứng dụng

• Tách chiết, tinh chế Concanavalin A

(Con A) từ hạt đậu rựa trồng ở Việt

Nam (Canavalia ensiformis)

5 Sắc kí lỏng cao áp

(HPLC- High Performance Liquid Chro.)

• Tốc độ phân tách cực tốt, thường chỉ vài phút/ mẫu.(excellent fractionation speeds, often just minutes per sample)

• Độ phân giải peak rất cao.(superior peak resolution)

• Mức độ tự động hoá cao.(high degree of automation,

including data analysis)

• So sánh với mẫu chuẩn cho phép xác định

chính xác MW của sản phẩm và các tạp chất.

• Sự thay đổi theo mẻ (batch-to-batch) cũng

được đánh giá qua việc so sánh sắc kí đồ.

Cột có Φ nhỏ 2-5mm, được nhồi bởi các hạt nhỏ 3-50μm cho phép thiết lập cân bằng nhanh giữa MP và SP.

Áp suất cao 300atm để đạt tốc độ dòng chảy vài ml/phút.

Lượng mẫu đưa vào: 20μg

Tr (thời gian lưu): đưa mẫu vào xuất hiện peak của mẫu trên sắc kí đồ.

• Normal phase:pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân

cực của dung môi pha động.

• RP-HPLC: dựa vào sự khác nhau về tính kị nước

trên bề mặt phân tử Pha tĩnh có độ phân cực thấp,

pha động có độ phân cực cao hơn.

- Pha tĩnh: Silica hay polymer, nối với phân tử kị

nước(hydrophobic arm) (thường là nhóm butyl, octyl

và octadecyl).

hữu cơ phân cực như acetonitrile

- Có thể phát hiện sự khác nhau ở 1 a.a

- Sự tương tác với pha tĩnh mang tính kị nước cao có thể làm biến tính P không hồi tính được, tạo peak giả trên sắc kí đồ.

Ion Exchange-HPLC: được tiến hành dựa trên

sự thay thế những ion trong mẫu với những ion trái dấu trong pha tĩnh Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột.

Sắc kí trên hydroxyapatite

• Cơ chế: tách phân tử protein trên nền hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)

Tinh sạch Murine IgG1 sử dụng UNOsphere™ S and

CHT™ Ceramic Hydroxyapatite Chromatography

Henry Lai, PhD, and Samuel G Franklin, PhD, Bio-Rad Laboratories, Inc., 2000 Alfred Nobel

IgGs

• SK truyền thống:

protein A chromatography step + IEC/ HIC steps (Jiskoot et al 1989, Godfrey et al

1993, Shadle et al 1995, Ford et al 2001)

• UNOsphere S chromatography and CHT ceramic hydroxyapatite chromatography

 đơn giản hơn và tránh tạp nhiễm

• UNOsphere S (crylamido and vinylic copolymers) là chất trao đổi cation mạnh  khả năng gắn kết protein cao & áp lực lên cột thấp  có thể thu hồi và tái sử dung resin

• Chất nền CHT ceramic hydroxyapatite: Ca2+ & PO4 3- với cấu trúc hình cầu và

ceramic  tính chọn lọc và độ phân giải cao

Small-Scale

analytical column (0.7 x 5 cm)

scale-up

preparative column (2.2 x 20 cm)

6 Sắc kí nền mở rộng

(EBC-Expanded Bed Chromatography)

Cột sắc kí truyền thống: chất nền được nhồi chặt

 cột bị tắt, giảm tốc độ dòng chảy  phải tăng áp suất nén, làm giảm hiệu suất tách và kéo dài QT tách thành nhiều công đoạn (nhất là khi tách protein trực tiếp từ dịch lên men)

EBC: hệ đệm được bơm từ dưới đáy nền chất mang

 giảm tối đa tắt cột, giảm thời gian thao tác & số công đoạn thực hiện (nhất là trong hệ SK tách protein ở qui mô sản xuất)

Hạt chất nền: thủy tinh xốp và perfluoropolymer 1.1-1.3 g/ml,

Φ= 100-300 μm Hạt to nằm bên dưới cột, hạt nhỏ hơn nằm phía trên tạo điều kiện tách dễ dàng hơn.

e) washing of the bed

and

f) elution and

regeneration

Sắc kí màng

(Membrane Chro.)

Bản chất:

• màng xốp vi lọc

• ligand  gắn vào mặt trong của lỗ xốp

Ligand: tính trao đổi ion/tính kị nước/ tính ái lực

• So với KT sắc kí trên chất nền  nhanh hơn ~ 10 lần

KT truyền thống  protein di chuyển theo đối lưu + khuyếch tán ra các lỗ xốp  chậm hơn

KT màng  protein chỉ di chuyển theo dòng đối lưu

 thuận lợi cho QT tách ở mức độ sản xuất

• Scalable High Performance

• Removal of contaminants such as

DNA, endotoxin, viruses and host cell proteins are typical applications

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN

ĐÃ THEO

DÕI

• Given below is a schematic representation of the typical steps

involved in processing human leukocyte interferon produced by

recombinant DNA techniques This will give you an idea of where exactly affinity chromatography is usually involved in the realm of bioprocessing