chương ix miễn dịch học

Người ta cho rằng ở đó các mẫu kháng nguyên được gắn với một trong hai dạng protein bề mặt tế bào, đó là phức hợp hoà hợp tổ chức chính - Major Histocompatibility Complex MHC được gọi nh

Các mầm bệnh (Pathogen) trước hết vi phạm hàng rào vật lý là da và màng nhầy, ở đây, nó được phân biệt là vật xâm nhập từ bên ngoài và nó sẽ bị tiêu diệt Trong phạm vi chương này chúng ta

sẽ bàn về hệ thống miễn dịch và sự nhận diện các vật xâm nhập từ bên ngoài vào cũng như sự phân

biệt chúng với các thành phần bình thường của cơ thể, rồi tiêu diệt nó như thế nào Hệ thống miễn dịch

và hệ thống thần kinh của động vật có xương sống luôn luôn phát triển tương xứng với nhau

1 H ệ thống miễn dịch của cơ thể (các dạng đáp ứng miễn dịch)

Có 2 hệ thống miễn dịch, đó là hệ thống miễn dịch tế bào và hệ thống miễn dịch dịch thể

Mi ễn dịch tế bào (Cellular Immunity) là sự chống lại các tế bào đã bị thâm nhiễm Virus, ký

sinh trùng, các mô lạ thông qua tác động trung gian của các tế bào lymphocyte

Mi ễn dịch thể dịch (Humoral Immunity) Humor là thuật ngữ cổ của thể dịch (Fluid), nó có

hiệu ứng nhất trong việc chống lại sự thâm nhiễm của vi khuẩn và Virus, nó được tác động trung gian

bởi rất nhiều dẫn xuất chọn lọc của các protein có liên quan được hiểu là kháng thể hay là các globulin

miễn dịch (Immunoglobulin - Ig) Các kháng thể được tạo ra từ các tế bào B, ở động vật có vú, các tếbào này đã được chín (mature) ở trong tuỷ xương

1.1 H ệ thống miễn dịch tế bào (Cellular Immunity)

Đây là cách chống lại các tế bào, vật lạ xâm nhiễm vào cơ thể như vi rút, vi khuẩn thông qua

bản thân tế bào có khả năng gây miễn dịch đặc hiệu, nghĩa là tế bào kết hợp với những kháng nguyên

tương ứng được gắn trên một tế bào khác

Tính miễn dịch của động vật có xương sống là do những dạng xác định của tế bào máu chọn lọc

đó là các lymphocyte Chúng được sinh ra như tất cả các tế bào máu bắt nguồn từ các tế bào tiền thân thông thường (tế bào nguồn) ở tuỷ xương Tuy nhiên các tế bào lymphocyte khác hẳn với các tế bào

hồng cầu, nó có thể rời khỏi dòng máu đi vào khoảng không nội bào nơi có các tác nhân bên ngoài xâm nhập, đồng thời chúng có thể quay trở lại mạch huyết quản

Có 2 loại lymphocyte: lymphocyte T và lymphocyte B

1.1.1 Lymphocyte T

Lymphocyte T được sinh ra ở tuỷ xương, di chuyển về tuyến ức (thymus) và thành thục ở đây, sau đó vào máu, một ít vào hạch lâm ba Lymphocyte T thành thục chưa có khả năng miễn dịch, sau khi được kháng nguyên kích thích, nó được hoạt hoá trở thành tế bào lymphocyte T mẹ, đi vào lách

hoặc hạch lâm ba, ở đây chúng tăng sinh trở thành lymphocyte T có khả năng miễn dịch rất mạnh Về

chức năng, người ta chia lymphocyte T ra thành mấy loại sau:

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 283

T ế bào lymphocyte T hiệu ứng (effetor T, ký hiệu là Te hay còn gọi là lymphocyte giết- Killer

T (T k ): chúng có tác dụng trực tiếp tham gia miễn dịch tế bào, có khả năng phá huỷ, phân giải vật lạ, tếbào ung thư

T ế bào lymphocyte T hỗ trợ (Helper T Cell ký hiệu TH ): có tác dụng hiệp đồng với bạch cầu đơn nhân lớn, xúc tiến hoạt hoá tế bào lymphocyte B

T ế bào lymphocyte T ức chế (Suppesor T ký hiệu TS ): có vai trò ức chế và hoạt hoá tế bào lymphocyte B và các tế bào T khác, tham gia điều hoà miễn dịch

T ế bào lymphocyte T nhớ (Memory T ký hiệu Tm ): có đời sống dài, nên khi gặp kháng nguyên

mà nó đã tiếp xúc thì tăng sinh và đáp ứng miễn dịch mạnh

Lymphocyte T có quan hệ mật thiết với bạch cầu đơn nhân Bạch cầu đơn nhân thực bào kháng nguyên, phân giải kháng nguyên và tiết vào máu những mảnh phân tử miễn dịch, gây kích hoạt tế bào lymphocyte T Đôi lúc kháng nguyên (KN) kết hợp kháng thể (KT) ngay trên bề mặt tế bào đơn nhân

lớn, sau đó tiếp xúc với tế bào lymphocyte T, truyền thông tin miễn dịch cho tế bào lymphocyte T

Người ta đã phát hiện ở lymphocyte T hỗ trợ và lymphocyte T ức chế một số chất có tác dụng đối với lymphocyte như:

TSF(Thymus stimuleative factor): Yếu tố kích thích tế bào tuyến ức

TcGF(T cell growth factor): Yếu tố sinh trưởng tế bào T

Về sau người ta đặt tên cho những yếu tố này là interlukin-II (iL-2) Những chất này có tác dụng làm tăng sinh sản tế bào T, iL-2 có tác dụng hoạt hoá tế bào B, tế bào T

1.1.2 Lymphocyte B

Lymphocyte Bđược sinh ra ở tuỷ xương, thành thục ở đây hoặc ở túi huyệt (Bursa Fabricius)

của gia cầm Chức năng chính của các lymphocyte B là sinh ra các kháng thể dưới sự kích thích của lymphocyte T

Có một số đại thực bào (tế bào dạng bạch tuộc ở lách và hạch lympho, tế bào Langerhans ở dưới

da, tế bào Kuffer ở gan) làm nhiệm vụ bẫy và tập trung KN Phần lớn các KN đều bị các đại thực bào

bắt và xử lý, sau khi xử lý các KN, đại thực bào có nhiệm vụ trình diện các KN cho lymphocyte T

Sự đáp ứng miễn dịch tế bào được hình thành do sự có mặt của các phân tử lạ, các protein và acid nucleic mà chúng ta hiểu là kháng nguyên (antigen)

Quá trình này xảy ra thông qua một sery phức tạp của các tương tác trung gian giữa các dạng tếbào T với các tế bào B gắn đặc hiệu một kháng nguyên (hình 9.1) Đáp ứng miễn dịch tế bào dẫn đến

sự huỷ hoại các tế bào "phạm tội" Nó được bắt đầu khi một đại thực bào(macrophage) (1a, 1b) xử lý

một kháng nguyên lạ, khi đã được tiêu hoá một phần đai thực bào phơi bày các mẫu kháng nguyên trên bề mặt của nó (3a, 3b) Người ta cho rằng ở đó các mẫu kháng nguyên được gắn với một trong hai

dạng protein bề mặt tế bào, đó là phức hợp hoà hợp tổ chức chính - Major Histocompatibility Complex (MHC) (được gọi như thế vì chúng được phiên mã từ một dẫy gen MHC) MHC rất đa dạng (có nhiều allele) Các cá thể phân biệt với nhau bởi protein MHC Vì thế MHC là các marker của các cá thể

Protein MHC l ớp I có mặt trên bề mặt của tất cả các tế bào có nhân của động vật có xương

sống Đại thực bào (Macrophage) có protein MHC lớp I được nhận biết bởi các Receptor của tế bào T (T Cell Receptor), các Receptor này có trên bề mặt của các tế bào

Hình 9.1 Các con đường Đáp ứng miễn dịch (Marrack và Kappler 1086)

T gây độc chưa chín (Immature Cytotoxic T Cell) Để gắn với Macrophage đã phơi bày kháng nguyên trên bề mặt, các Receptor này phải tạo được phức đặc biệt giữa kháng nguyên với Protein MHC lớp I (4a) Dĩ nhiên không có một phân tử đơn lẻ nào lại có thể làm được việc này Cũng bằng cách tương

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 285

tự, các Macrophage có mang trên mình những mảnh kháng nguyên tạo phức với Protein MHC lớp II

lại được gắn với các tế bào T giúp đỡ chưa chín (Immature Helper T cell - TH) có mang các Receptor cùng họ (Cognate Receptor) (4b) Chính vì hệ thống nhận biết phức tạp này trên bề mặt tế bào T đã tránh lãng phí cho hệ thống miễn dịch tế bào không tác động trên các đích không phải là tế bào (hình 9.1)

Các tế bào T gắn với phức Macrophage đã phơi bày kháng nguyên và Protein MHC sẽ tạo cảm ứng dây truyền, một quá trình được hiểu là sự lựa chọn dòng (Clonal selection) lần đầu tiên Niel Kaj Jerne, Macfarlane Burnet, Joshua Lederberg và David Talmadge đã mô tả vào những năm 1950 Kết

quả là chỉ những tế bào T nhận dạng đặc hiệu các kháng nguyên xâm nhập thì mới được sản xuất với

số lượng lớn Sự lựa chọn dòng xảy ra là do một macrophage khi gắn với một tế bào T sẽ giải phóng ra

một yếu tố có tên là Interleukin (5a, 5b) nó kích thích đặc hiệu các tế bào T làm tăng sinh và biệt hoá (6a, 6b) Quá trình này cũng được kích thích bởi một chất tự tiết (autostimulatory secretion) của tế bào

T gọi là Interleukin 2 (hình 9.1)

Chỉ có các tế bào T tạo ra được Receptor với Interleukin 2 thì mới gắn được với Macrophage (7a, 7b) vì vậy nó tránh được sự tăng sinh không hạn chế của tế bào T Tuy nhiên, một số lượng lớn các tế bào T độc tế bào đã chín (8a) thì các Receptor của chúng lại là đích đặc hiệu cho các tế bào túc

chủ phơi bày cả kháng nguyên lạ và cả protein MHC lớp I, điều này được xảy ra sau vài ngày khi kháng nguyên xâm nhập lần thứ nhất Các tế bào T gây độc tế bào hay còn gọi là các tế bào T giết (Killer T): Chúng gắn với các tế bào túc chủ mang kháng nguyên (9) và ở thời điểm tiếp xúc nó giải phóng ra một protein FO - KD gọi là Perforin nằm trên các tế bào đích (10) tạo nên các lỗ trên màng

đã trở nên yếu kém hơn vì trong những năm gần đây có sự trải rộng của AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrome: triệu chứng thiếu hụt miễn dịch mắc phải) mà tác nhân gây nên là HIV (Human Immunodeficiency Virus: Virus gây thiếu hụt miễn dịch cho người), Virus này đã tác động bằng cách

tấn công đặc hiệu vào Helper T Cell Hệ thống miễn dịch tế bào cũng gặp nhiều khó khăn với các thuốc hiện đại không có trong tự nhiên chẳng hạn thuốc tránh sự loại trừ mô và các tổ chức ghép từcác donor bên ngoài Những tổ chức ghép được nhận biết như một chất lạ vì chúng có protein MHC khác với Protein MHC của túc chủ Để khắc phục sự loại trừ mảnh ghép chỉ có cách là phát triển các thuốc kìm hãm miễn dịch (Immunosuppressant) như Cyclosporin A và FK506, những chất này chỉ kìm hãm đáp ứng miễn dịch nhưng không làm cho cơ thể mất sự bảo vệ trước các mầm bệnh khác

1.2 H ệ thống miễn dịch thể dịch (Humoral Immunity)

Miễn dịch thể dịch là cách miễn dịch do các tế bào miễn dịch tiết kháng thể vào máu Những kháng thể này sẽ kết hợp với kháng nguyên tương ứng Đây là cách miễn dịch có hiệu ứng nhất trong

việc chống lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn, vi rút , nó được tác động trung gian bởi rất nhiều dẫn xuất

chọn lọc của các protein có liên quan được hiểu là các kháng thể hoặc các globulin miễn dịch (Immunoglobulin - Ig), các kháng thể này thường là do tế bào lymphocyte B sản sinh ra trước sự kích thích của helper T cell

Các tế bào B có cả Immunoglobulin cũng như protein MHC lớp II (4c) trên bề mặt của chúng

Nếu một tế bào B chạm trán với một kháng nguyên gắn vào một Immunoglobulin đặc biệt của nó thì

sẽ tạo một phức (12) và kháng nguyên được tiêu hoá một phần (13) để lộ các đoạn (fragment) trên bề

mặt của phức hợp với protein MHC lớp II (14) Các tế bào T giúp đỡ đã chín (8b) có mang các Receptor đặc hiệu với phức hợp này sẽ gắn vào tế bào B (15) và khi đáp ứng thì giải phóng các Interleukin kích thích sự tăng sinh và biệt hoá tế bào B (16) Sự phân chia tế bào còn tiếp tục cho đến

khi các tế bào B được kích thích bởi helper T Cell (17), các helper T Cell lại phụ thuộc vào sự có mặt liên tục của kháng nguyên (1b - 8b) (hình 9.1)

Hình 9.2.Đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp

H ầu hết hậu duệ của tế bào B là các tế bào plasma (18) các tế bào này chuyên hoá tiết

ra m ột lượng lớn kháng thể đặc hiệu kháng nguyên Kháng thể gắn với các kháng nguyên

(19), vì th ế có thể đánh dấu nó bằng sự phá huỷ theo kiểu Phagocytosis (được tiêu hoá bởi

b ạch cầu gọi là thực bào) hoặc theo kiểu hoạt hoá hệ thống bổ thể (một dẫy các protein tác động trung gian làm tan tế bào và gây các phản ứng viêm cục bộ)

Các tế bào B và T thường chỉ sống vài ngày trừ phi nó được kích thích bởi kháng nguyên thích

hợp Tuy nhiên, sự tăng sinh của tế bào B lại bị giới hạn bởi các tương tác của chúng với T ức chế (Ts)

- cũng là một hậu duệ của lympho T nhưng có chức năng đối nghịch với helper T Cell

Một nét rất đặc trưng của hệ miễn dịch là một sinh vật rất hiếm khi bị nhiễm 2 lần với cùng một

mầm bệnh giống nhau hoàn toàn, điều đó có nghĩa là sự phục hồi sau sự thâm nhiễm của một mầm

bệnh làm cho con vật miễn dịch với mầm bệnh đó Cái được gọi là đáp ứng miễn dịch thứ cấp này được tác động trung gian bởi các tế bào T nhớ sống lâu hơn (11) và các tế bào B sống lâu (20) khi

chạm trán lại với các kháng nguyên cùng họ, có thể 10 ngày sau thì nó tăng sinh rất nhanh và ồ ạt so

với các tế bào T và B còn "trinh" (những tế bào chưa hề chạm trán với kháng nguyên) (hình 9.1 và 9.2)

Đặc tính này của hệ miễn dịch đã được nhận ra ngay từ thời xa xưa Một nhà sử học người Hy

Lạp tên là Thucydides đã ghi chú trên 200 năm nay rằng: "Những người ốm khi được điều trị khỏi thì không bị mắc lại lần thứ 2 thứ bệnh đó"

1.3 H ệ thống Miễn dịch là hệ thống tự dung nạp

Hầu hết các đại phân tử sinh học đều có tính kháng nguyên Vì thế để tránh sự huỷ hoại hệ

thống miễn dịch, động vật phải phân biệt rõ giữa kháng nguyên của mình và kháng nguyên lạ Quá

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 287

trình này được lựa chọn một cách tuyệt đối Đối với động vật có xương sống có tới hàng mười ngàn các đại phân tử khác nhau mà mỗi đại phân tử lại có vô số các vị trí kháng nguyên khác biệt

Vậy cơ chế của sự tự dung nạp là gì ? Như ta đã biết hệ thống miễn dịch của động vật trở nên

hoạt hoá quanh thời điểm được đẻ ra Nếu một kháng nguyên lạ được cấy vào phôi trước lúc đẻ thì động vật không có khả năng tạo miễn dịch chống lại kháng nguyên đó Rõ ràng là hệ thống miễn dịch

đã loại đi những dòng tế bào B hoặc T đã nhận dạng được các kháng nguyên có mặt đúng thời điểm

mà hệ miễn dịch trở nên hoạt hoá (lựa chọn dòng) Tuy nhiên, lại có rất nhiều dòng mới của lymphocyte mà mỗi dòng lại có một bộ gần như độc quyền về các quyết định kháng nguyên được phát triển lên trong đời sống của động vật Như vậy tự dung nạp phải là một quá trình tiến triển Người ta

đã hiểu rất rõ về cơ chế của quá trình này, nó xảy ra ở tuyến ức Chỉ những tế bào T “trinh” có mang các Receptor gắn với protein MHC nhưng không có ái lực với kháng nguyên của mình thì mới được

chọn lọc di truyền Như vậy, chỉ có một bộ phận rất nhỏ lymphocyte được tạo ra bởi tuyến ức là rời liên tục khỏi tổ chức đó Nhưng thỉnh thoảng hệ miễn dịch cũng mất dung nạp với một vài kháng nguyên của mình, kết quả là gây ra các bệnh tự miễn ví dụ bệnh nhược cơ trầm trọng (Myasthenia Gravis), một bệnh tự miễn trong đó cơ thể tạo ra các kháng thể chống lại các Receptor của Acetylcholin của cơ, xương (Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter) làm cho

co cơ), kết quả là làm cơ bị yếu ở thời kỳ phôi cũng như các giai đoạn tiếp theo của đời sống sinh vật

Cũng tương tự như vậy những người mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống (systemic lupus erythematosis)

là một bệnh viêm thường xảy ra ở thời kỳ phôi thai, cơ thể tạo ra các kháng thể chống lại nhiều thành

phần tế bào của chính mình, bao gồm các protein ribonucleate và DNA Một bệnh tự miễn thường gặp khác là bệnh khớp (hệ miễn dịch tấn công vào các chỗ khớp nối của mô liên kết), hay bệnh đái tháo đường phụ thuộc Insulin (Insulin-dependent diabetes mellitus) và bệnh đa sơ cứng (multiple sclerosis)

2 C ấu trúc và chức năng của kháng thể (Immunoglobulin)

Kháng thể do Kitasato tìm ra năm 1890 và ông đã định nghĩa KT là globulin miễn dịch (Immuno globulin ký hiệu là Ig ) Kháng thể là thành phần của sự bảo vệ thể dịch luôn luôn có trong huyết thanh của động vật và được tổng hợp nhiều khi gây miễn dịch nhân tạo cũng như khi có bệnh truyền nhiễm Bản chất của KT là một nhóm globulin làm nhiệm vụ thực hiện cơ chế " đáp ứng miễn

dịch "

C ấu trúc của kháng thể: Theo Gerald Edelman và Rodney Porter, hầu hết các Immunoglobulin

và các khối cấu trúc cơ bản của nó đều bao gồm 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng

Chuỗi nhẹ (Light chain) kí hiệu L có khoảng 214 acid amin Chuỗi nhẹ có 2 dạng là K (Kappa)

và λ (lamda), có khối lượng khoảng 23 KD

Chuỗi nặng ( Heavy chain) kí hiệu H có khoảng 446 acid amin, có khối lượng khoảng 75 KD Chuỗi nặng có 5 loại:

M (Muy) tương ứng có kháng thể IgM

G (Gamma) tương ứng có kháng thể IgG

Ở người có 5 lớp Immunoglobulin (Ig) được ký hiệu là IgA, IgD, IgE, IgG và IgM Chúng khác nhau bởi các dạng chuỗi nặng tương ứng là α, δ, ε, γ và μ (bảng 9.1) Có 2 dạng chuỗi nhẹ là κ và λ Các lớp IgD, IgE và IgG chỉ tồn tại ở dạng dimer (L - H)2 Còn IgM là pentamer (hình 9.4a), IgA có

thể là monomer, Dimer và Trimer của các dimer này (Hình 9.4b) Các Unit dạng dimer của các multimer được gắn với nhau bởi liên kết disulfide và gắn với một protein ∼ 20 - KD gọi là chuỗi J (Joining chain) IgM của tế bào B cũng có dạng Monomer gắn với màng Đó là vị trí gắn kháng nguyên của IgM monomer để tạo cho IgM đáp ứng miễn dịch thể dịch

Bảng 9 1 Phân loại các lớp Globulin miễn dịch của người

L ớp Chuỗi nặng Chuỗi nhẹ C ấu trúc dưới

đơn vị Kh phân t ối lượng ử

Năm 1959, Porter chỉ rõ rằng, IgG - lớp Ig phổ thông nhất khi bị phân cắt bởi papain ở phần bản

lề thì người ta được 2 đoạn Fab (Antigen binding Fragmet): đoạn gắn với kháng nguyên và một đoạn

Fc (Crystalizable Fragmet): đoạn kết tinh Đoạn Fc bao gồm các đoạn cuối C của hai chuỗi nặng (Hình 9.3a, 9.3b,) Fc có vai trò quan trọng, tuy không làm nhiệm vụ gắn kháng nguyên nhưng Fc có khả

năng gắn với tế bào khác và làm hoạt hoá tế bào nó gắn Đoạn Fc chứa các vị trí effector thực hiện

chức năng thực bào, tạo phức với bổ thể và hướng sự vận chuyển của các Ig tới các vị trí tác động của chúng Fc có receptor để gắn vào bổ thể, đồng thời Fc còn có vai trò làm nhiệm vụ thoái hoá (phân giải

Ig khi kết thúc nhiệm vụ)

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 289

Hình 9.3a C ấu trúc của phân tử Immunoglobulin (theo Dr Landry)

Hình 9.3b C ấu trúc của phân tử Immunoglobulin (theo Mike Clark, 1994).

Trong phân tử Ig phần chuỗi nhẹ (L) lại chia làm 2 phần: phần biến đổi (Variable) kí hiệu là

VL và phần cố định (Constant) kí hiệu là CL Ở chuỗi nặng cũng được chia thành 2 phần: phần biến đổi (Variable) kí hiệu là VH và phần cố định (Constant) kí hiệu là CH Phần biến đổi nằm trong đoạn Fab, nó có thể biến đổi cho phù hợp tương ứng với KN mà nó cần tác dụng (hình 9.3a, 9.3b, 9.4a, 9.4b)

Ch ức năng của kháng thể: Những lớp Ig tiết khác nhau có các chức năng sinh lý khác nhau

IgM có nhiều trong máu, có hiệu ứng nhất đối với việc chống lại sự xâm nhập của các vi sinh

vật Đó là một Ig được tiết ra đầu tiên trong đáp ứng với một kháng nguyên; nó được tạo ra sau 2 đến 3 ngày khi cơ thể chạm trán lần đầu tiên với kháng nguyên

IgG là Ig phổ thông nhất, nó được phân phối đồng đều trong máu và trong các dịch kẽ Chỉ có kháng thể này mới qua được nhau thai (qua Receptor mediated endocytosis) vì thế nó cung cấp tính

miễn dịch cho phôi IgG được tạo ra sau 2 đến 3 ngày khi IgM xuất hiện lần đầu tiên

Hình 9.4a C ấu trúc của Ig M

Hình 9.4b C ấu trúc của IgA

IgA có nhiều trong đường tiêu hoá và trong các chất tiết như nước bọt, mồ hôi, nước mắt IgA

chống lại sự xâm nhập của các Pathogen bằng cách gắn với các vị trí kháng nguyên của chúng do vậy khoá chặt các quá trình gắn với bề mặt ngoại biên IgA cũng là một kháng thể chủ yếu của sữa và sữa đầu Vì thế nó giúp cho trẻ sơ sinh chống lại các pathogen xâm nhập bằng đường ruột

Tr ường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội – Giỏo trỡnh Hoỏ Sinh động vật ……… 291

IgE thường cú mặt trong mỏu với nồng độ thấp, nú cú tỏc dụng chống lại ký sinh trựng và cú liờn quan đến cỏc phản ứng dị ứng

IgD cũng cú mặt trong mỏu với liều lượng thấp, chức năng của Ig này chưa rừ

Các vùng cố định và các vùng có thể biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể

Để xác định đặc tính của một phân tử, điều cần thiết là phải có được các phân tử tinh khiết Đòi hỏi này là một trở ngại lớn đối với các nhà miễn dịch học Khi một con vật tiếp xúc với một kháng nguyên đặc biệt nó hình thành vô số dòng tế bào plasma, mỗi dòng tổng hợp một Ig gắn kháng nguyên khác nhau chút ít Vì thế kháng thể là không đồng nhất Tuy nhiên, trở ngại này đ được đẩy lui vào

đầu những năm 1960 khi phát hiện ra những cơ thể có multi myeloma - một tế bào plasma ung thư, nó tổng hợp một lượng lớn các mẫu đơn của Ig có tên là Myeloma protein Một số myeloma tạo ra một lượng thừa các chuỗi nhẹ, khi nó được tiết vào trong nước tiểu thì gọi là protein Bence - Johnes (sau khi Henry Bence Johnes phát hiện lần đầu tiên vào năm 1847)

Các đuôi aminoacid của một vài protein Bence Johnes có chứa 214 gốc, người ta phát hiện ra rằng sự khác nhau về đuôi (trình tự) giữa các chuỗi nhẹ là ở những nửa cuối N của chúng Vùng có thể biến đổi của chuỗi nhẹ có các gốc trải từ 1 đến 108, được gọi là vùng biến đổi (Variable) ký hiệu là VL Còn vùng cố định bao gồm các gốc từ 109 đến 214 được gọi là vùng cố định (Constant) ký hiệu là CL (Hình 9.3a, 3b,) Cũng tương tự như vậy, khi so sánh với chuỗi nặng myeloma có 446 gốc thì thấy tất cả các trình tự đều khác nhau từ gốc 1 đến 125 Vì vậy chuỗi nặng cũng có vùng biến đổi VH và vùng

vị đồng dạng (homology) của một phân tử Immunoglobulin, mỗi đơn vị được cuộn lại trong một vùng

độc lập Như vậy rõ ràng là các gen của chuỗi nhẹ và các gen của chuỗi nặng đ được tiến hoá qua sự nhân đôi của một gen gốc m hoá cho một protein ∼ 110 gốc Ở cỏc vựng biến đổi VL và VH phần lớn cỏc amino acid biến đổi ở 3 trỡnh tự biến đổi cao (hypervariable)

Elvin Kabat phỏn đoỏn rằng cỏc trỡnh tự biến đổi cao cú liờn quan với vị trớ gắn khỏng nguyờn

của Immunoglobulin và cỏc acid amin của chỳng xỏc định đớch gắn đặc hiệu của nú

Giải phỏp của Kabat đó được cỏc thớ nghiệm đỏnh dấu ỏi lực ủng hộ Cỏc phõn tử nhỏ hơn 5 KD

ớt thể hiện đớch khỏng nguyờn, nhưng khi một nhúm hữu cơ nhỏ cú tờn là hapten chẳng hạn như nhúm

2, 4 dinitrophenyl (DNP), nhúm này liờn kết đồng hoỏ trị với một protein vận chuyển (carrier) chẳng

hạn như albumin huyết thanh bũ (do phản ứng của Fluorodinitrobenzene với gốc Lys của nú) và sau

đú được tiờm vào một con vật thỡ con vật này sẽ sản xuất ra cỏc khỏng thể gắn với hapten với sự cú

mặt của Carrier Nếu một chất tương tự DNP chẳng hạn như p-nitrophenyldiazonium thỡ nú gắn với khỏng thể khỏng DNP nhúm diazonium tớnh phản ứng cao của hapten sẽ hỡnh thành liờn kết diazo với

His, Lys và Tyr chuỗi bên trong vùng lân cận của vị trí gắn DNP của kháng thể

(DNP - hapten)

Hầu hết các chuỗi bên dẫn xuất như thực tế là các thành viên của trình tự biến đổi nhiều của kháng thể Điều đó chứng tỏ rằng các vị trí gắn kháng nguyên liên quan với các gốc biến đổi nhiều Đoạn biến đổi của Ig vì thế được gọi là vùng xác định bổ cứu (complementary determining regions- CDR)

Hình 9.5 Kháng th ể hoá trị 2 có thể liên kết chéo với KN đa hoá trị để tạo thành mạng lưới

Các Immunoglobulin đều gập lại

Cấu trúc của Immunoglobulin đã được David Davie, Allan Edmondson, Robert Huber, Roberto Polfak và nhiều tác giả khác xác định và mở rộng bằng phương pháp xác định cấu trúc tia X- của các đoạn Fab và Fc IgG là một phân tử có 2 phần tương đồng hoá học, các đơn vị tương đồng của nó tạo thành các vùng (domain) tách biệt Mỗi một vùng gắn chặt với một vùng của chuỗi polypeptide khác

để cho toàn bộ phân tử được coi như là được cấu tạo bởi 6 module hình cầu, 2 module tạo nên chữ Y (vùng Fc) và 2 tạo cánh tay X2 (vùng Fab - Hình 9.3a,9.3b)

Các đơn vị Immunoglobulin đồng dạng đều có đặc tính gấp lại giống nhau (Immunoglobulin fold) Một tổ hợp bao gồm một tấm β đối song song 3 và 4 sợi liên kết với nhau bởi liên kết disulfide

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 293

Vùng V khác với Vùng C chủ yếu bởi vòng polypeptide thêm vào nằm dọc theo tấm β 3 sợi của vùng

V

Nhờ các nghiên cứu về hoá học sinh lý và cấu trúc tia X đã cho thấy các Immunoglobulin có tính mềm dẻo cao ở giữa các đoạn Một sự kiện đặc biệt gọi là vùng "bản lề" trong protein, đoạn polypeptide này nối với vùng Fab và Fc của nó (Hình 9.3a, 3b), tuy nhiên, những vùng này giống cái dây xích hơn là một cái bản lề (trong đó 2 góc của bản lề là ∼ 65° và ∼ 115°) đã được xác định một cách chắc chắn

Một tổ hợp bao gồm một tấm β đối song song 3 và 4 sợi liên kết với nhau bởi liên kết disulfide Vùng V khác với Vùng C chủ yếu bởi vòng polypeptide thêm vào nằm dọc theo tấm β 3 sợi của vùng

V

Vì cấu trúc cơ bản của Immunoglobulin phải phù hợp được với nhiều kháng nguyên vì thế tính

mềm dẻo của nó đã làm thuận lợi cho việc gắn kháng nguyên bằng cách cho phép một sự thích ứng

giữa các kháng nguyên và vị trí gắn của nó Nửa phân tử có Carbohydrate của Immunoglobulin chêm

giữa các đơn vị đồng dạng CH1 và CH2 làm nhiệm vụ điều hoà sự tương tác giữa các vùng Fab và Fc

tế bào này (hình 9.6) Các kháng thể đơn dòng có thể thu được với số lượng không hạn chế và đặc

hiệu cho hầu hết các kháng nguyên bằng cách trộn lẫn các tế bào myeloma với các lymphocyte đã được gây miễn, tức là tạo một dòng tế bào lai Các tế bào lai này sẽ tổng hợp đươc Ig của lymphocyte nhưng lại có tính trường tồn của các tế bào myeloma

Kháng thể đơn dòng là một công cụ không thể thiếu đươc trong y, sinh học Chúng cũng có

thể dùng để thực nghiệm và phân lập một lượng cực kỳ nhỏ của hầu hết các chất sinh học đặc

hiệu, chẳng hạn như chúng ta có thể làm được các xét nghiệm Routine máu về sự có mặt của HIV

để đảm bảo an toàn trong việc truyền máu

4 V ị trí gắn kháng nguyên của kháng thể

Cấu trúc tia X của một vài phức hợp protein Myeloma - hapten đã chỉ ra rằng vị trí gắn kháng nguyên của Ig được định vị ở đỉnh mỗi vùng Fab trong một khe nằm giữa các đơn vị VL và VH (Hình 9.3a, 9.3b, 9.7)

Hình 9.7 V ị trí gắn với kháng nguyên của kháng thể

Hình dạng và kích thước của khe này phụ thuộc vào trình tự aminoacid của các đơn vị VL và

VH và các bức thành được tạo nên từ 6 đoạn biến đổi nhiều (CDR,) Chẳng có gì phải ngạc nhiên là các phức hợp kháng thể - hapten cũng tương tự như các phức hợp enzyme - cơ chất Cả 2 dạng này đều bao gồm các tương tác Valderval, liên kết kỵ nước, liên kết hydrogen và tương tác ion Thật vậy, các phức hợp kháng thể - hapten và phức hợp enzyme - cơ chất đều có các thang tương tự về hằng sốphân ly từ 10-4đến 10-10

M, nó tương đương với năng lượng gắn từ 25 đến 65 KJ.mol-1

Các phức hợp kháng thể - hapten là những mô hình không hoàn thiện của phức hợp kháng thể - kháng nguyên bởi vì hapten chỉ lấp đầy một phần các vị trí gắn kháng nguyên tương ứng Tuy nhiên

những kháng thể đơn dòng có thể giúp cho việc xác định cấu trúc tia X của kháng nguyên protein

trong phức với các dẫn xuất Fab của các kháng thể đơn dòng kháng lại các kháng nguyên này Chẳng

hạn, như cấu trúc tia X của 3 phức hợp lysozyme lòng trắng trứng gà (Hen egg white - HEW) với các

dẫn xuất Fab của các kháng thể đơn dòng anti - HEW lysozyme đã được xác nhận Mỗi Fab đều gắn

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 295

khá độc lập và hình dáng bất thường, một đường có chiều dài ∼ 700 A trên bề mặt lysozyme, các chuỗi bên nhô ra của một phân tử nó rất khớp với chỗ lõm xuống của rãnh Trong mỗi phức hợp này,

tất cả 6 Fab CDR đều tham gia gắn lysozyme Những phức hợp này rất giống các phức hợp protein - protein đã biết, nó được gắn với nhau do có sự bổ cứu cao và vì thế nó ngăn trở dung môi khỏi bị tác động bởi tương tác Valderval, các cầu nuối và các liên kết hychogen Trong một số tương tác này, bộ

xương lysozyme và các chuỗi bên vẫn duy trì sự phân biệt cấu trúc, mặt khác cũng có những thay đổi

cấu trúc địa phương (sự so sánh này không thể mở rộng tới lysozyme gắn Fab bởi vì vẫn chưa kết tinh được chúng)

Tính đặc hiệu cao của kháng thể anti-lysozyme đối với các vị trí kháng nguyên đã được chứng minh bởi hiệu ứng của sự thay đổi aminoacid đơn trên bề mặt tiếp xúc của lysozyme Hằng số phân ly

của Immunoglobulin kháng lysozyme HEW có tên là D1.3 với lysozyme HEW là 2,2 x 10-8

M Nhưng

hằng số phân ly của kháng thể đơn dòng này với lysozyme lòng trắng trứng lại gần với hằng số phân

ly của kháng thể đơn dòng với gà gô, chim cút và gà tây là > 10-5

M Trong những lysozyme này thì Gln 121 nhô ra khỏi bề mặt lysozyme HEW và trong vị trí gắn kháng nguyên của Fab nó được thay

bằng His

Vậy đặc tính đặc biệt của epitope (vị trí kháng nguyên) nơi mà kháng thể gắn vào là gì? Tất cảcác epitope lysozyme ở trên đầu gồm 14 đến 16 gốc bề mặt từ 2 hay nhiều đoạn peptide Một số gốc này biểu lộ tính di động cao, nhưng các gốc khác thì không Vì thế người ta chỉ thấy 3 phức hợp kháng

thể - lysozyme phủ quanh một nửa bề mặt lysozyme, điều đó chứng tỏ bề mặt tiếp cận đầy đủ của một protein là sự tiềm tàng tính kháng nguyên

Đoạn Fab đáp ứng gắn kháng nguyên như thế nào? Câu trả lời đã được xác định nhờ nghiên cứu tia X của Ian Wilson, nó phụ thuộc vào Fab và kháng nguyên đòi hỏi Khi so sánh cấu trúc tia X của

một Fab từ một kháng thể đơn dòng kháng trực tiếp 1 đoạn gồm 36 gốc của Influenza hemagglutinin riêng rẽ và phức hợp một đoạn 9 gốc của kháng nguyên thì thấy Fab gắn với ái lực cao Điều đó vạch

rõ rằng khi gắn với kháng nguyên đã làm cho Fab trải qua một quá trình sắp xếp lại cấu trúc chính -

chủ yếu thông qua sự dịch chuyền cấu trúc của CDR3 chuỗi nặng Như vậy, nếu không có sự thay đổi

cấu trúc thì Fab sẽ không có khả năng gắn với kháng nguyên này ít nhất là ở cấu trúc mà nó được thừa

nhận trong phức hợp này Mặt khác, trong một nghiên cứu tia X của Wilson trên một Fab kháng lại

trực tiếp đoạn Myohemerythrin 19 gốc (một Fe không hem chứa protein gắn oxygen của một ấu trùng

biển) cả ở dạng đơn lẻ lẫn dạng phức hợp với kháng nguyên thì thấy Fab chỉ trải qua sự chỉnh lý cấu trúc ở một vài chuỗi chính và chuỗi bên khi gắn kháng nguyên

Trong cả 2 phức hợp đang tiến triển này, cấu trúc của Fab gắn kháng nguyên khác hẳn với cấu trúc protein ở dạng nguyên thể Điều này làm nổi lên tính tò mò nhưng vẫn chưa trả lời được là một kháng thể có thể gắn với peptide và với cả protein hay là dẫn xuất của peptide này như thế nào? Nếu

trả lời được câu hỏi này sẽ xác định được những hiệu quả quan trọng trong việc tạo ra các vaccine cơ

sở peptide

5 S ự phát sinh tính đa dạng của kháng thể

Hệ thống miễn dịch có khả năng tạo ra kháng thể kháng lại hầu hết các kháng nguyên xâm nhập,

nó có thể sản xuất dường như không hạn chế các vị trí gắn kháng nguyên khác nhau Vậy cái gì là nguồn gốc của tính đa dạng này? Một điều chắc chắn là biểu lộ gen Immunoglobulin cũng như sự biểu

hiện gen trong các chuỗi H và L rất tách biệt của các protein đã được mã hoá bởi một gen nguyên bào

mầm Nếu điều này là sự thật thì các gen này có thể phải mã hoá hàng tỷ các kháng thể khác nhau Động vật có xương sống có khả năng tạo ra rất nhiều các gen này Chẳng hạn như, cần phải có 103

gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ để mã hoá 103

x 103 = 106 Immunoglobulin khác nhau Tuy nhiên, các nghiên

cứu lai tạo sử dụng các sợi DNA đồng vị phiên mã mRNA của Immunoglobulin đã chỉ rõ rằng genome phôi chuột chỉ chứa một vài gen Immunoglobulin, điều đó khó giải thích cho mức độ đa dạng của kháng thể đã quan sát thấy trong chuột Cuối cùng thì cái gọi là giả thuyết mầm này cũng bị gạt bỏ

Hiện nay có 2 mô hình về nguồn gốc tính đa dạng của kháng thể được coi là công nhận, đó là:

5 1 Gi ả thuyết tái tổ hợp sinh dưỡng (Somatic)

Giả thuyết này do William Dreyer và Claude Bennett đề xướng năm 1965 trên cơ sở cho rằng tính đa dạng của kháng thể phát sinh bởi tái tổ hợp di truyền giữa một vài đoạn gen có liên quan mã hóa cho vùng biến đổi của Immunoglobulin Quá trình này xảy ra thông qua quá trình tái tổ hợp bên trong nhiễm sắc thể trong thời kỳ biệt hoá tế bào B để cho mỗi dòng tế bào biểu lộ chỉ một nhưng độc quyền một Immunoglobulin

5 2 Gi ả thuyết đột biến sinh dưỡng

Giả thuyết này cho rằng tính đa dạng của kháng thể là do tốc độ đột biến cao của gen Immunoglobulin trong lúc biệt hoá tế bào B

Chúng ta sẽ xem xét dưới đây cả 2 cơ chế tạo nên tính đa dạng của kháng thể

5.3 Các gen chu ỗi nhẹ K được tập hợp từ 3 bộ các mẫu gen

Các công trình nghiên cứu trình tự DNA của Leroy Hood, Philip Leder và Susumu Tonegawa

đã chỉ rõ rằng các chuỗi nhẹ κ được mã hoá bởi 4 exon (Hình 9.7)

Đoạn dẫn hay đoạn LK mã hoá một peptide kỵ nước có 17-20 gốc Peptide này được tổng hợp

để đi vào mạng lưới nội chất rồi sau đó cắt khỏi mạng lưới này

Đoạn VK mã hoá 95 gốc đầu tiên của vùng biến đổi gồm 108 gốc của chuỗi K

Chu ỗi nối (Joining) hay đoạn JK (đừng lẫn lộn với chuỗi J của IgA và IgM), mã hoá 13 gốc còn lại của vùng biến đổi

Đoạn CK mã hoá vùng cố định của chuỗi K

Sự sắp xếp của các extron này trong các mô của phôi người (chưa tạo được kháng thể) khác rất nhiều với họ gen đã gặp trước đây Các đoạn LK và VK tách biệt nhau bởi một intron

Tuy nhiên, họ gen chuỗi K cũng bao gồm một dẫy 150 các đơn vị LK - VK∼ 400-bp, tách biệt nhau bởi một cái chêm ∼ 7 kb Các trình tự của đôi exon này như sau theo thứ tự thấp dần: 5 đoạn JKởtrung gian ∼ 300 bp, một cái chêm 2,4kb và một đoạn CKđơn lẻ

Sự lắp ráp của mRNA chuỗi K là một quá trình phức tạp bao gồm cả tái tổ hợp sinh dưỡng và cả

nối gen chọn lọc Đối với chuột, bước đầu tiên của quá trình này đã xảy ra ở một tổ tiên của mỗi dòng

tế bào B, đó là quá trình tái tổ hợp bên trong nhiễm sắc thể để nối đơn vị LK - VK với đoạn JK và loại

bỏ các trình tự chen vào Sau đó ở các thế hệ sau này, các gen đã biến đổi hoàn toàn được phiên mã và

gấp lại một cách chọn lọc, nhờ vậy mà nối đơn vị LK - VK - JK với đoạn CK Các đoạn LK và VK cũng

gấp lại với nhau trong giai đoạn này tạo nên một mRNA mã hoá cho một trong số các thành phần của

Hình 9.7 S ự tổ chức và sắp xếp lại họ gen

K ở chuột

Tr ường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 297

chuỗi nhẹ (Hình 9.7)

Các trình tự bảo tồn cao ở đầu 3' của mỗi đoạn VK và ở đầu 5' của mỗi đoạn JKđã chứng tỏ các

vị trí tái tổ hợp sinh dưỡng đã được chọn lọc như thế nào Đoạn VKđược tiếp theo sau bởi một trình tựheptamer CACAGTG, một cái chêm 12 ± 1 Nucleotide và một nonamer giàu AT bổ cứu Những trình

tự này gắn với nhau dưới ảnh hưởng của một hệ enzyme tái tổ hợp để hình thành một cấu trúc vòng và ống tác động như một tín hiệu tái tổ hợp (Hình 9.8)

5.4 S ự mềm dẻo của tái tổ hợp tạo nên tính đa dạng của kháng thể

Khi nối một trong số 150 đoạn VK với một trong số 5 đoạn JK có thể tạo ra chỉ 150 x 5 = 750 chuỗi K, con số này ít hơn rất nhiều so với số liệu quan sát được Tuy nhiên, những nghiên cứu đã

vạch rõ nó bao gồm nhiều sự kiện xẩy ra ở những đoạn Vk và Jk giống nhau Vị trí tái tổ hợp V/J không được xác định một cách chính xác, hai đoạn gen này có thể nối ở các điểm bắt chéo khác nhau Sau nữa là các amino acid được định rõ bởi các mã nằm ở vùng lân cận vị trí tái tổ hợp V/J này phụthuộc vào phần trình tự của đoạn VK và JK

dòng mầm

Như vậy, các amino acid được định rõ bởi các mã xung quanh chỗ nối tái tổ hợp tạo nên vùng

biến đổi nhiều của chuỗi nhẹ ở lân cận gốc 96 (CDR3, hình 9.9) Phải thừa nhận rằng tính mềm dẻo tái

tổ hợp này đã làm tăng tính đa dạng của chuỗi K lên 10 lần Con số mong đợi về các chuỗi K khác nhau có thể lên tới 150 x 5 x 10 = 7500

Sự nối không chính xác của V/J thường gây nên sự mất ngẫu nhiên một vài nucleotide ở cuối đoạn VK và JK Cuối cùng, trên 2/3 sản phẩm tái tổ hợp bị đọc lệch pha (out of phase reading) vì thế

tạo nên một gen mã hoá một protein vô nghĩa Những protein này sẽ không được biểu hiện Một tế bào trong đó một sự kiện tái tổ hợp không tạo nên sản phẩm đã xảy ra thì sẽ nỗ lực sắp xếp lại gen K xa