Dioxin và các phương pháp phân tích dioxin

Bài trình bày tính chất của dioxin và các phương pháp phân tích dioxin khá rõ ràng, bài hay và rất bổ ích cho các bạn học phân tích.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ĐHQG TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

TIỂU LUẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

Chủ đề:

DIOXIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DIOXIN

Người thực hiện: Nguyễn Văn Tú

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 11/2013

2

MỤC LỤC

PHẦN 1 4

TỔNG QUAN VỀ DIOXIN 4

I NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ DIOXIN 4

II NGUỒN PHÁT SINH DIOXIN 4

III TÁC HẠI CỦA DIOXIN TỚI CON NGƯỜI VÀ MÔI TRƯỜNG 5

IV VẤN ĐỀ Ô NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 7

V CÁC QUY ĐỊNH VỀ NGƯỠNG DIOXIN CHO PHÉP Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 7

PHẦN 2 8

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DIOXIN 8

I PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ PHÂN GIẢI CAO/PHỔ KHỐI LƯỢNG PHÂN GIẢI THẤP (HRGC/LRMS) - Method 8280B (US.EPA)8 8

1 Phạm vi ứng dụng 8

2 Tóm tắt phương pháp 9

3 Thiết bị và những dụng cụ cần thiết 11

3.1 Hệ thống sắc ký khí/phổ khối lượng 11

4 Thuốc thử và chất chuẩn 13

4.1 Hóa chất làm thuốc thử: 13

4.2 Thuốc thử cho cột sắc ký 14

4.3 Dung dịch hiệu chỉnh (bảng 2.3) 14

4.4 Dung dịch nội chuẩn (bảng 2.4) 15

4.5 Dung dịch khôi phục chuẩn (bảng 2.4) 15

4.6 Dung dịch xác nhận hiệu chỉnh (bảng 2.5) 15

4.7 Chất chuẩn làm sạch 16

4.8 Chuẩn đánh dấu mẫu (bảng 2.6) 16

4.9 Hỗn hợp xác định hiển thị (bảng 2.7) 17

4.10 Dung dịch kiểm tra cột 17

5 Quy trình phân tích 18

5.1 Tổng quan chung về sử dụng thiết bị Soxhlet-Dean-Stark (SDS) 18

5.2 Chiết mẫu chất thải hóa học (bao gồm dầu nhiên liêu ẩm/bùn dầu và cặn dầu) 19

5.3 Chiết mẫu tro bụi 19

3

5.4 Chiết mẫu đất/trầm tích 20

5.5 Chiết mẫu nước 20

5.6 Quy trình cô đặc macro (dùng cho tất cả các mẫu) 22

5.7 Quy trình làm sạch axit-bazơ 23

5.8 Quy trình cô đặc vi mô (cho tất cả các mẫu tiến hành) 24

5.9 Quy trình sắc ký cột Silica gel và oxit nhôm 24

5.10 Quy trình sắc ký cột cacbon 25

5.11 Cô đặc lần cuối 25

5.12 Điều kiện vận hành sắc ký 25

5.13 Hiệu chỉnh GC/MS 26

5.14 Phép phân tích GC/MS mẫu 32

5.15 Tính toán 35

II PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ ĐỘ PHÂN GIẢI CAO/PHỔ KHỐI LƯỢNG PHÂN GIẢI CAO (HRGC/HRMS) - Method 8290A (US.EPA)9 38

1 Phạm vi ứng dụng 38

2 Tổng quát phương pháp phân tích 39

3 Quy trình 41

3.1 Thêm chất nội chuẩn 41

3.2 Sự chiết và làm sạch mẫu cá và mẫu bột giấy 41

3.3 Chiết và làm sạch mẫu mô chất béo người 42

3.4 Chiết và làm sạch mẫu chất thải 43

3.5 Làm sạch phần chiết 45

3.6 Các điều kiện sắc ký/phổ khối lượng và các thông số thu thập dữ liệu 47

3.7 Hiệu chỉnh 49

3.8 Phân tích 54

3.9 Tính toán 56

PHẦN 3 60

KẾT LUẬN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

4

PHẦN 1

TỔNG QUAN VỀ DIOXIN

I NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ DIOXIN

Dioxin là tên gọi chung của một nhóm hàng trăm các hợp chất hóa học tồn tại bền vững trong môi trường cũng như trong cơ thể con người và các sinh vật khác Tùy theo số nguyên tử Cl và vị trí không gian của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân PCDD (poly-chloro-dibenzo-dioxines) và 135 đồng phân PCDF (poly-chloro-dibenzo-furanes) với độc tính khác nhau Dioxine còn bao gồm nhóm các PCB (poly-chloro-biphenyles), là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 chất hóa học trong đó có 29 chất đặc biệt nguy hiểm Trong số các hợp chất dioxin, dẫn xuât TCDD là nhóm độc nhất1

Dioxin là sản phẩm phụ của nhiều quá trình sản xuất chất hóa học công nghiệp liên quan đến clo như các hệ thống đốt chất thải, sản xuất hóa chất và thuốc trừ sâu và dây truyền tẩy trắng trong sản xuất giấy

Hình 1.1 Cấu trúc chung của dibenzo-p-dioxin và dibenzofuran

Dioxin và furan là các hóa chất độc nhất được biết đến hiện nay trong khoa học Trong bản báo cáo sơ thảo của Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US.EPA) năm 1994 đã miêu tả dioxin như là một mối tác nhân đe doạ nguy hiểm đối với sức khoẻ cộng đồng Cũng theo EPA, dường như không có mức độ phơi nhiễm dioxin nào được coi là an toàn

Ngoài chiến tranh Việt Nam, dioxin trong chất độc màu da cam gây nên thảm hoạ sinh thái ở Seveso (Ý), và Times Beach (Missouri), Love Canal (New York)

II NGUỒN PHÁT SINH DIOXIN

Dioxin là sản phẩm phụ của nhiều quá trình sản xuất chất hóa học công nghiệp liên quan đến clo như các hệ thống đốt chất thải, sản xuất hóa chất và thuốc trừ sâu và dây truyền tẩy trắng trong sản xuất giấy1

5

III TÁC HẠI CỦA DIOXIN TỚI CON NGƯỜI VÀ MÔI TRƯỜNG

Trong Báo cáo của Giáo sư Võ Quý trong phiên điều trần về chất độc da cam, lần thứ 2 tại Hạ viện Mỹ đã nói rõ hậu quả của chất độc da cam đối với môi trường Việt Nam Hậu quả về sinh thái quan trọng nhất của chất độc hóa học là các hệ sinh thái rừng Trước chiến tranh, rừng miền Nam Việt Nam có diện tích bao phủ là 10,3 triệu ha Trong suốt thời gian chiến tranh, từ năm 1961 tới năm 1971, đã có trên 77 triệu lít chất độc hóa học được sử dụng (Stellman, 2003), hầu hết là chất da cam, trong đó có chứa dioxin (TCDD) với nồng độ độc cao từ 3 - 4 mg/l, nhưng còn cao hơn nhiều trong trường hợp sản xuất với quy

mô lớn và khẩn cấp Diện tích các khu vực bị phun rải chiếm 24% diện tích Nam Việt Nam (FIDI 2007), 86% lượng chất độc hóa học được trực tiếp rải lên đất rừng, 14% còn lại được rải trực tiếp lên đất nông nghiệp mà chủ yếu là đất trồng lúa Sự tấn công của quân đội Mỹ đã làm cho hơn 2 triệu ha đất rừng bị phá hủy

Hình 1.2 Những cánh rừng bị tàn phá bởi dioxin 2

Tác động của chất độc hóa học rất đa dạng, nhưng cuối cùng đã phá hủy trên 150.000 ha rừng ngập mặn và khoảng 130.000 ha rừng tràm của vùng châu thổ sông Mekong và hàng trăm nghìn ha đất rừng nội địa K Graham, một nhà báo và nhà văn Mỹ đã phải nhận xét: “Không ở đâu sử phá hủy môi trường lại tàn bạo như ở Việt Nam trong cuộc chiến tranh vừa qua, chiến tranh đánh vào các khu rừng nhiệt đới Đông Nam Á Bom đạn thiêu hủy cây cối và làm tắc nghẽn dòng chảy Chất diệt cỏ phá hủy cây rừng Các loại máy móc khác của chiến tranh lại giáng tai họa nhiều hơn vào các hệ sinh thái trong lúc đi tìm kiếm mục tiêu con người2

Các công trình nghiên cứu trong những năm vừa qua đã xác định được hơn 3,3 triệu ha đất tự nhiên bị tác động bởi chất độc hóa học, trong đó khoảng 2 triệu ha đất rừng nội địa bị tác động với các mức độ khác nhau, gây thiệt hại hơn 100 triệu mét khối gỗ Nhiều vùng rộng lớn bị ảnh hưởng nặng nề bởi chất diệt cỏ đến nay vẫn chưa thể sử dụng cho trồng trọt hay chăn thả súc vật

Chúng ta có thể nói rằng chất da cam, thành phần chính của các chất độc hóa học được quân đội Mỹ sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam, đã làm đảo lộn các điều kiện tự nhiên và làm cho các hệ sinh thái rừng tự nhiên phong phú

6

với mức độ đa dạng sinh học cao, trở thành những vùng đất hoang tàn Nơi cư trú thuận lợi cho các loài động vật của rừng nhiệt đới, đặc biệt là các loài có cỡ lớn, đặc hữu của Việt Nam đã không còn nữa2

Các báo cáo của EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư cho con người Năm 1997, Tổ chức quốc tế về nghiên cứu ung thư (IARC) thuộc WHO đã công bố 2,3,7,8-TC DD là chất gây ung thư nhóm 1 (nghĩa là nhóm đã được công nhận là gây ung thư) Đồng thời, tháng 1 năm 2001, chương trình Độc học Quốc gia Hoa Kỳ đã chuyển dioxin vào nhóm "các chất gây ung thư cho người" Cuối cùng, trong một nghiên cứu kiểm định năm 2003, các nhà khoa học cũng khẳng định không có một liều lượng nào là an toàn hoặc ngưỡng dioxin mà dưới nó thì không gây ung thư3 Điều này có thể hiểu là nếu một người phơi nhiễm dioxin dù lượng nhỏ nhất thì đã mang trong mình hiểm họa ung thư

Ngoài ung thư, dioxin còn có thể liên quan đến một số bệnh nguy hiểm khác như bệnh rám da, bệnh đái tháo đường, bệnh ung thư trực tràng không Hodgkin, thiểu năng sinh dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai hoặc thiểu năng trí tuệ, đẻ trứng (ở nữ)…

Cơ chế phân tử của dioxin tác động lên các tế bào và cơ thể người, động vật vẫn đang còn nhiều tranh cãi Thời gian bán phân huỷ của dioxin trong cơ thể động vật là 7 năm hoặc có thể lâu hơn Thông thường, dioxin gây độc tế bào thông qua một thụ thể chuyên biệt cho các hydratcarbon thơm có tên là AhR

(Aryl hydrocarbon Receptor) Phức hợp dioxin - thụ thể sẽ kế hợp với protein vận chuyển ArnT (AhR nuclear Translocator) để xâm nhập vào trong nhân tế

bào Tại đây dioxin sẽ gây đóng mở một số gene giải độc quan trọng của tế bào như Cyp1A, Cyp1B, Đồng thời, một số thí nghiệm trên chuột cho thấy dioxin làm tăng nồng độ các gốc ion tự do trong tế bào Điều này, có thể là làm phá huỷ các cấu trúc tế bào, các protein quan trọng và quan trọng hơn cả, nó có thể gây đột biến trên phân tử DNA

Hình 1.3 Tác động biến đổi DNA của dioxin ở người 2

Trong một đánh giá về rủi ro và nghiên cứu các vấn đề chính sách được đưa ra trong Hội nghị Quốc tế về Dioxin tổ chức tại Berlin, 2004, nhóm tác giả

đến từ Cục Môi trường Liên bang Đức (Federal Environmental Agency) đã đưa

7

ra kiến nghị không có mức phơi nhiễm dioxin tối thiểu nào có độ an toàn cho phép (theo WHO 2002, thì mức phơi nhiễm dioxin cho phép qua thức ăn của mỗi người là 1-10 pg đương lượng độc (TEQ)/ngày)4

IV VẤN ĐỀ Ô NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

Ở Việt Nam, chất độc màu da cam và các loại thuốc diệt cỏ khác bắt đầu được thử nghiệm bởi quân đội Hoa Kỳ vào năm 1961 và được sử dụng rộng rãi với hàm lượng cao trong chiến tranh vào các năm 1967 - 1968, rồi giảm xuống

và ngừng sử dụng năm 1971 Các loại hợp chất này được trộn vào dầu hỏa hoặc nhiên liệu diezen rồi rải bằng máy bay hoặc các phương tiện khác5

Theo công bố của một nhóm tác giả trên tạp chí Nature thì có thể nói chiến dịch dùng hóa chất ở Việt Nam là một cuộc chiến tranh hóa học lớn nhất thế giới4 Trong thời gian 10 năm đó, quân đội Mỹ và quân đội Nam Việt Nam đã rải 76,9 triệu lít hóa chất xuống rừng núi và đồng ruộng Việt Nam Trong số này có 64% là chất độc màu da cam, 27% là chất màu trắng, 8,7% chất màu xanh và 0,6% chất màu tím

Tổng số lượng dioxin Việt Nam hứng chịu là vào khoảng 370 kg (Trong khi đó vụ nhiễm dioxin ở Seveso, Ý, 1976 chỉ với 30 kg dioxin thải ra môi trường mà tác hại của nó kéo dài hơn 20 năm3) Tổng số diện tích đất đai bị ảnh hưởng hóa chất là 2,63 triệu hécta Có gần 5 triệu người Việt Nam sống trong 25.585 thôn ấp chịu ảnh hưởng độc chất màu da cam

V CÁC QUY ĐỊNH VỀ NGƯỠNG DIOXIN CHO PHÉP Ở VIỆT NAM

8

PHẦN 2

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DIOXIN

Hiện nay, để phân tích dioxin, người ta dùng phương pháp Method 8280B

và Method 8290A do Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ cung cấp (US.EPA)

I PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ PHÂN GIẢI CAO/PHỔ KHỐI LƯỢNG PHÂN GIẢI THẤP (HRGC/LRMS) - Method 8280B (US.EPA)8

1 Phạm vi ứng dụng

Phương pháp này dùng để phát hiện và định lượng tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD), 2,3,7,8-tetrachlorodibenzofuran (2,3,7,8-TCDF), và các dẫn xuất thế clo ở vị trí penta-, hexa-, hepta-, và octa- của dibenzo-p-dioxin (PCDDs) và dibenzofuran (PCDFs) trong nước (ở hàm lượng ppt), trong đất, tro bụi, và chất thải hóa học (ở hàm lượng ppb) Những hợp chất sau đây được xác định bởi phương pháp này:

2,3,7,8-Bảng 2.1 Những hợp chất được phân tích theo phương pháp HRGC/LRMS

9

Phương pháp này chỉ sử dụng để phát hiện các hợp chất có giá trị ở giới hạn định lượng cho ở bảng 2.2 Nếu hàm lượng thấp hơn giới hạn định lượng thì phải sử dụng phương pháp sắc ký khí độ phân giải cao/phổ khối lượng phân giải cao (HRGC/HRMS, sẽ được trình bày ở mục II)

Bảng 2.2 Giới hạn định lượng của các hợp chất cần phân tích

Chất phân tích Nước

(ng/L)

Đất (µg/kg)

Tro hóa học (µg/kg)

Chất thải (µg/kg)

(matrix Số lượng được chỉ định của mẫu nước, đất, tro bụi, hoặc chất thải hóa học được thêm chất nội chuẩn và được chiết theo quy trình chiết đặc trưng kiểu

ma trận Những mẫu lỏng được lọc, và những mẫu rắn tồn tại trong pha lỏng được ly tâm trước khi chiết Quy trình chiết và dung môi cụ thể như sau:

+ Những mẫu đất, tro bụi, hoặc chất thải hóa học được chiết bằng sự kết hợp của bẫy nước Dean-Stark và cột chiết Soxhlet sử dụng Toluen Đất, tro bụi,

và chất rắn khác cũng được có thể được chiết bằng cách sử dụng phương pháp chiết lưu chất áp lực (pressurized fluid extraction - PFE) hay phương pháp chiết microwave

+ Mẫu nước được chiết với một phễu chiết hoặc cột chiết liquid-liquid sử dụng diclometan CH2Cl2, và phần hạt nhỏ còn lại sau quá trình lọc mẫu nước được chiết riêng trong cột chiết Soxhlet sử dụng Toluen Mẫu nước cũng có thể

Sau khi làm sạch mẫu chiết ra, mẫu được cô đặc đến gần khô Ngay trước khi tiêm mẫu, những chất nội chuẩn được thêm vào mỗi mẫu chiết ra, sau

đó tiêm mẫu vào hệ thống HRGC/LRMS có chế độ hiển thị ion được chọn (SIM)

- Sự xác định các hợp chất cuối cùng dựa trên thứ tự thoát ra của chúng so với dung dịch chuẩn (bảng 2.3) từ hệ thống sắc ký khối phổ thích hợp Đặc trưng đồng phân cho tất cả hợp chất 2,3,7,8-PCDDs/PCDFs không thể thu được trên một cột đơn lẻ Việc sử dụng cả hai cột DB-5 và SP2331 được khuyên dùng Không có phép phân tích nào có thể xử lý nếu không có tất cả các tiêu chuẩn về thời gian lưu, peak đặc trưng, tín hiệu/nhiễu (signal-to-noise) và tỉ lệ ion được phát hiện trong hệ thống GC/MS sau khi hiệu chỉnh ban đầu và xác nhận hiệu chỉnh

Bảng 2.3 Các dung dịch hiệu chỉnh được dùng cho phép phân tích HRGC/LRMS

Chất phân tích Hàm lượng chất chuẩn (ng/µl)

để bảo đảm sự xác thực của kết quả trên cột GC thứ hai

3.1.2 Cột GC

Cột mao quản fused silica (Cột mao quản silica phủ Polyimide chịu nhiệt cao hoặc Acrylate) được sử dụng Cột phải tách được các đồng phân 2,3,7,8- đặc trưng dù là phép phân tích cột đơn hay cột kép được chọn Những điều kiện vận hành cột phải được đánh giá ở điểm bắt đầu và điểm kết thúc của mỗi chu kỳ 12 giờ mà trong thời gian đó các dung môi hiệu chỉnh nồng độ cũng được phân tích

Có thể sử dụng các loại cột khác và phải bảo đảm được độ chính xác cũng như độ phân giải của phép đo

Đồng phân đặc trưng cho tất cả các hợp chất 2,3,7,8-PCDDs/PCDFs không thể thu được trên cột DB-5 60m Vấn đề được giải quyết chỉ khi có sự tách biệt của 2,3,7,8-TCDD từ 1,2,3,7-TCDD và 1,2,6,8-TCDD, và sự tách biệt của 2,3,7,8-TCDF từ 1,2,4,9-, 1,2,7,9-, 2,3,4,6-, 2,3,4,7-, và 2,3,4,8-TCDF Bởi

vì sự lo ngại độc tính của 2,3,7,8-TCDD và 2,3,7,8-TCDF nên phép phân tích thêm sẽ có thể được thực hiện đối với một số mẫu Trong trường hợp giá trị TEQ lớn hơn 0,7 ppb (đối với mẫu rắn), 7 ppt (đối với mẫu lỏng), hay 7 ppb (đối với mẫu chất thải hóa học), thì phép phân tích lại của các mẫu chiết ra trên cột sắc ký SP-2330 hay SP-2331 hay cột DB-225 có thể được yêu cầu để xác định hàm lượng của riêng những đồng phân 2,3,7,8- Đối với cột DB-225, vấn đề sẽ bao gồm cả sự tách biệt của 2,3,7,8-TCDF từ 2,3,4,7-TCDF và sự kết hợp của 1,2,3,9- và 2,3,4,8-TCDF

12

Ở phép phân tích trên cột DB-5 mà ở đó 2,3,7,8-TCDF có thể cho dự đoán là có nồng độ cao thì phép phân tích các mẫu chiết ra sẽ phải thực hiện trên cột sắc ký thứ hai với kết quả cho ra sự tách biệt của 2,3,7,8-TCDF

Nếu chỉ sử dụng một cột GC thì phép phân tích phải bảo đảm được sự tác biệt cần thiết của các đồng phân phát hiện được cũng như nồng độ của các chất

là nhỏ nhất chấp nhận được

3.1.3 Phổ khối lượng

Một thiết bị có độ phân giải thấp được chọn để thực hiện phép phân tích,

sử dụng nguồn năng lượng điện tử 70 vôn trong chế độ ion hóa theo kiểu va chạm điện tử Hệ thống phải có khả năng hiển thị ion được chọn (chế độ SIM) Cấu hình đề xuất là cho khoảng ít nhất 18 ion một vòng, với thời gian một vòng

là 1 giây hoặc ít hơn, và thời gian tích phân nhỏ nhất là 25 mili giây một m/z Thời gian tích phân được sử dụng để phân tích mẫu phải đồng nhất với thời gian tích phân được sử dụng để phân tích dung dịch chuẩn ban đầu và kế tiếp và những mẫu kiểm soát chất lượng phân tích

- Giao diện: Giao diện GC/MS được cấu trúc bởi thủy tinh và các vật liệu gắn với thủy tinh là cần thiết Thủy tinh phải được khử hoạt hóa bằng quá trình silan hóa với diclo dimetyl silan Gắn cột fused silica trực tiếp vào nguồn MS Cẩn thận không để lộ hở đoạn cuối của cột với dòng điện tử

- Hệ thống dữ liệu: Một hệ thống dữ liệu giao điện cần thiết để thu nhận, lưu trữ, xử lý và hiển thị dữ liệu phổ khối lượng

3.1.4 Thiết bị khác

- Dụng cụ bay hơi nitrogen (N-Evap)

- Cân có khả năng cân nặng chính xác đến ±0,01 g

- Thiết bị giữ nhiệt nước, có thể kiểm soát nhiệt độ trong vòng ± 2oC

- Bình thép không rỉ (hoặc thủy tinh) có sức chứa được 1 pint (0,57 lít) mẫu chất

- Găng tay: sử dụng để chuẩn bị chất chuẩn và giữ cho khỏi bị phơi nhiễm bởi các mẫu rắn/trầm tích có chứa các hạt mịn

- Thiết bị bay hơi dung môi R-110, Buchi/Brinkman, số hiệu E5045-10 hoặc thiết bị tương đương

- Máy ly tâm: có khả năng vận hành ở lực ly tâm cực đại 400 xg với sức chứa 250-300 ml

- Lò sấy

- Lò chân không: có khả năng làm khô tác nhân rắn rửa dung môi ở

110oC

- Máy lắc: một thanh khuấy từ, có khả năng lắc mạnh, sử dụng cho tiền xử

lý mẫu tro bụi

3.1.5 Dụng cụ thủy tinh khác

- Hủ chiết: làm bằng thủy tinh có màu hổ phách với nắp vặn có lót polytetraflouroethylene (PTFE); dung tích chứa nhỏ nhất khoảng 200 ml; phải tương thích với máy lắc được sử dụng

13

-Thiết bị làm bay hơi Kuderna-Danish: bình thót cổ 500 ml, ống cô đặc 10

ml với nắp thủy tinh, cột marco-Snyder 3 bi Những dụng cụ bay hơi khác có thể được sử dụng như Turbovap và Nevap miễn là thích hợp với phương pháp

- Pipet Pasteur dùng một lần, dài 150 mm x đường kính trong 5 mm

- Pipet huyết thanh dùng một lần, 10 ml, dùng cho chuẩn bị cột cacbon

- Các lọ nhỏ: 0,3 ml và 2 ml loại thủy tinh borosilicate bình chứa hình nón

và nắp được nối với đĩa silicone PTFE

- Phễu: thủy tinh, cỡ thích hợp với giấy lọc (12,5 cm)

- Cột sắc ký: 300 mm x 10,5 mm bằng thủy tinh có khóa PTFE

- Dụng cụ Soxhlet, bình 500 ml, tất cả bằng thủy tinh

- Dụng cụ tách nước Dean-Stark với khóa PTFE Phải vừa với ống chiết Soxhlet và thiết bị làm lạnh

- Ống cô cạn: ống ly tâm hình nón

- Phễu tách: 125 ml và 2 lít với khóa vòi PTFE

- Ống chiết liquid-liquid liên tục: sức chứa 1 lít mẫu, thích hợp cho sử dụng với dung môi nước hay nặng hơn

- Những mảnh PTFE hoặc Carbonrundum, được rửa với hexane trước khi

sử dụng

- Phễu Buchner 15cm

- Bình lọc: sử dụng với phễu Buchner, sức chứa 1 lít

- Các dụng cụ thủy tinh và các loại giấy lọc cần thiết khác

4 Thuốc thử và chất chuẩn

4.1 Hóa chất làm thuốc thử:

Phải được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm Nó phải bảo đảm độ tinh khiết để không làm giảm đi độ chính xác của phép phân tích Nó phải được bảo quản trong lọ bằng thủy tinh để tránh sự thấm qua gây ô nhiễm của các bình chứa bằng nhựa

Tất cả dung môi phải bảo đảm chất lượng, được chưng cất trong dụng cụ thủy tinh Dung môi cần được đuổi khí trước khi sử dụng

Những mẫu chất nên được chiết bởi các dung môi cho hiệu quả tối ưu, có thể chiết hoàn toàn các chất cần xác định ở nồng độ quan tâm Việc lựa chọn dung môi chiết thì phụ thuộc vào chất phân tích và không có dung môi nào là sử dụng được cho tất cả các nhóm chất cần phân tích Các dung môi phải thỏa mãn tiêu chuẩn của Hội Hóa học Mỹ (ACS) Bất cứ hệ dung môi nào được sử dụng cho phép phân tích thì nhân viên phân tích phải chứng minh được sự phát hiện những chất phân tích ở mức hàm lượng mong muốn Hệ dung môi được sử dụng

14

- Acetone, CH3COCH3

- Tridecane, CH3(CH2)11CH3

- Nonane, C9H20

- Cát thạch anh trắng: tỉ lệ mắc lưới 60/70, sử dụng cho ống chiết

Soxhlet-Dean-Stark (SDS) Nung ở 450oC trong ít nhất 4 giờ

- Na 2 SO 4 (dạng hạt, khan): được làm tinh khiết bằng cách đun ở nhiệt độ

400oC trong 4 giờ trong một khay nông, hoặc bằng cách chiết với diclo metan Nếu, sau đun nóng, Na2SO4 chuyển thành dạng xám (bởi sự có mặt của cacbon trong hỗn hợp tinh thể), thì mẻ đó không thể sử dụng và nên loại bỏ Sự chiết với CH2Cl2 có thể thu được Na2SO4 thích hợp để sử dụng, nhưng sự chiết sau

đó, mẫu trắng phải được phân tích để chứng minh rằng không có nhiều gây ra từ

Na2SO4

- Axit sunfuric H 2 SO 4 , đặc: chuẩn ACS, khối lượng riêng đặc trưng 1,84

- Kali hydroxit KOH: chuẩn ACS, chuẩn bị dung dịch 20% (khối

lượng/thể tích trong nước

- Natri clorua NaCl: chuẩn ACS, chuẩn bị dung dịch 5% (w/v) trong

nước

- Axit clohydric HCl, đặc: chuẩn ACS, khối lượng riêng 1,17 Chuẩn bị

dung dịch 1N trong nước cho tiền xử lý mẫu tro bụi

4.2 Thuốc thử cho cột sắc ký

Các loại thuốc thử này được sử dụng cho quá trình làm sạch mẫu được chiết ra Chất lượng của 2 trong số các loại thuốc thử này, oxit nhôm và silica gel có tính quyết định cho sự thành công của phép phân tích

- Nhôm, có tính axit: Supelco 19996-6C (hoặc tương đương) Soxhlet chiết với CH2Cl2 khoảng 18 giờ bằng cách đun nóng đến 130oC ít nhất 12 giờ

- Than cacbon: Cacbon hoạt tính, Carbopak C (Supelco) hoặc tương đương, rửa trước với CH3OH và làm khô chân không ở 110oC

- Celite 545 (Supelco) hoặc tương đương

- Silica gel: độ tinh khiết cao, kiểu mắc lưới 60, 70-230 Soxhlet chiết với

CH2Cl2 khoảng 21 giờ và hoạt hóa bằng cách đun nóng trong bình chứa thủy tinh được bao phủ lá kim loại khoảng 24 giờ ở 190oC

- Silica gel tẩm với 2% (w/w) NaOH: thêm 1 phần lượng của dung dịch 1M NaOH vào 2 phần silica gel (đã chiết và hoạt hóa) trong bình có nút vặn và trộn với đũa thủy tinh đến khi không còn vón cục

- Silica gel tẩm với 40% (w/w) H2SO4: thêm 2 phần lượng H2SO4 đặc vào

3 phần silica gel (đã chiết và hoạt hóa), trộn với đũa thủy tinh đến khi không còn vón cục, bảo quản trong lọ thủy tinh có nắp vặn

4.3 Dung dịch hiệu chỉnh (bảng 2.3)

Chuẩn bị 5 dung dịch tridecane (hay nonane) (CC1-CC5) có chứa 10 hợp chất không gắn nhãn đồng vị và 7 hợp chất có gắn nhãn đồng vị Cacbon của PCDDs/PCDFs ở nồng độ đã biết để hiệu chỉnh thiết bị Một trong 5 dung dich j này được sử dụng như dung dịch xác nhận hiệu chỉnh và chứa 7 đồng phân 2,3,7,8- không gắn nhãn đồng vị thêm vào Khoảng nồng độ là tương đồng hay

15

phụ thuộc, với hàm lượng thấp nhất cùng với các dẫn xuất tetra- và penta- của dioxin và furan (0,1 - 2,0 ng/µl), và hàm lượng cao nhất với những hợp chất đồng đẳng dẫn xuất octa-, hexa- (0,5 - 10,0 ng/µl)

Những chất chuẩn sẵn có trên thị trường chứa tất cả 17 chất phân tích không gắn nhãn trong mỗi dung dịch có thể được sử dụng Tất cả các chất chuẩn nên được bảo quản ở nơi có nhiệt độ thấp (≤ 6oC) và tránh ánh sáng khi không

sử dụng (nhiệt độ -10oC được đề nghị) và nên được chuẩn bị lại 1 lần 1 năm hay sớm hơn nếu những chất chuẩn này biểu hiện có vấn đề Chất chuẩn xác nhận hiệu chỉnh nên được chuẩn bị, khi cần thiết và được lưu giữ ở nhiệt độ ≤ 6oC Những dung dịch được trộn lẫn trước khi sử dụng được lưu trữ theo tài liệu hướng dẫn của nhà sản xuất và cất trữ ở nhiệt độ đề nghị

4.4 Dung dịch nội chuẩn (bảng 2.4)

Chuẩn bị 1 dung dịch chứa 5 chất nội chuẩn trong tridecane (hoặc nonane) với hàm lượng nhỏ như ở bảng 1.4 Trộn 10 µl với 1 ml acetone trước khi thêm vào mỗi mẫu chất và mẫu trắng

4.5 Dung dịch khôi phục chuẩn (bảng 2.4)

Chuẩn bị 1 dung dịch trong hexane chứa những chất chuẩn khôi phục,

13

C12-1,2,3,4-TCDD và 13C12-1,2,3,7,8,9-HxCC, ở hàm lượng 5 ng/µl

Bảng 2.4 Dung dịch nội chuẩn, khôi phục và làm sạch

DUNG DỊCH CHẤT NỘI CHUẨN

DUNG DỊCH CHUẨN PHỤC HỒI

16

125 µl Dung dịch hiệu chỉnh bổ sung (bên dưới)

50 µl Dung dịch phục hồi chuẩn (Bảng 2.4)

50 µl Dung dịch chuẩn làm sạch (Bảng 2.4)

Dung dịch này sẽ đưa đến một thể tích cuối cùng 1 ml ở nồng độ

đặc trưng cho dung dịch CC3 ở bảng 2.3 Dung dịch hiệu chuẩn bổ sung được chuẩn bị từ những nguồn

4.8 Chuẩn đánh dấu mẫu (bảng 2.6)

Chuẩn bị dung dịch chứa 10 đồng phân của các dẫn xuất 2,3,7,8- ở nồng

độ được cho ở bảng 1.6 trong tridecane (hoặc nonane) Sử dụng dung dịch này

để chuẩn bị cho tỉ lệ của mẫu được đánh dấu Pha loãng 10 µl của chất chuẩn này với 1 ml acetone và thêm vào theo tỉ lệ đã chọn để đánh dấu

Bảng 2.6 Dung dịch đánh dấu mẫu

4.10 Dung dịch kiểm tra cột

Độ phân giải sắc ký được xác nhận bằng việc sử dụng một hỗn hợp kiểm tra tương ứng với mỗi cột, cụ thể như sau:

Nếu sử dụng một cột khác có thứ tự đi ra khỏi cột khác với những cột được chỉ ra ở đây, thì phải chắc rằng những đồng phân đi ra gần nhất với 2,3,7,8-TCDD được đại diện trong dung dịch kiểm tra cột

- Những mẫu tro bụi và những mẫu đất/trầm tích có thể được chiết bằng

sự kết hợp của ống chiết Soxhlet với ống chiết nước Dean-Stark

- Những mẫu nước được lọc và sau đó phần lọc ra được chiết sử dụng hoặc là quy trình chiết phễu hoặc là quy trình chiết liquid-liquid liên tục

- Những phần hạt nhỏ sau khi lọc được chiết bằng sự kết hợp ống chiết Soxhlet với ống chiết tách nước Dean-Stark

- Những mẫu tro bụi, đất/trầm tích, và những mẫu rắn khác có thể được tách sử dụng phương pháp PFE, hoặc chiết microwave

5.1 Tổng quan chung về sử dụng thiết bị Soxhlet-Dean-Stark (SDS)

Những quy trình sau áp dụng để sử dụng thiết bị SDS cho việc chiết các mẫu bằng phương pháp này

Sự kết nối của ống chiết Soxhlet và bẫy Dean-Stark được sử dụng cho tách nước và chiết dẫn xuất PCDDs/PCDFs từ các mẫu tro bụi, đất/trầm tích, và phần hạt rắn lọc ra của mẫu nước

Với những mẫu đất/trầm tích, những kết quả của phép phân tích này được báo cáo dựa trên khối lượng ẩm của mẫu Tuy nhiên, việc sử dụng SDS cho phép lượng nước trong mẫu được xác định từ tỉ lệ giống nhau của mẫu cũng được tách trong phép phân tích Lượng nước lấy ra từ mẫu trong quá trình chiết được sử dụng để tính gần đúng phần trăm lượng chất rắn trong mẫu Dữ liệu phần trăm chất rắn có thể được xử lý bằng người phân tích để tính gần đúng hàm lượng khối lượng khô Sự xác định phần trăm chất rắn không áp dụng để chiết những phần hạt rắn thu được từ việc lọc mẫu nước hoặc để chiết những mẫu tro bụi (được xử lý bằng HCl trước khi chiết)

Quá trình chiết mẫu đất/trầm tích, tro bụi, và mẫu hạt rắn lọc từ mẫu nước đòi hỏi phải sử dụng ống lồng Soxhlet (Soxhlet thimble) Trước khi chuẩn bị chiết, chuẩn bị ống lồng bằng cách thêm 5 gam silica gel 70/230 vào ống lồng

để thu được một lớp mỏng ở phần dưới của ống lồng Lớp này sẽ bẫy phần hạt nhỏ ở lại trong ống lồng Thêm 80-100 gam cát thạch anh trên phần trên của silica gel, và đặt ống lồng vào trong ống chiết

Chiết trước SDS khoảng 3 giờ với Toluen, sau đó làm mát dụng cụ và lấy ống lồng ra Trộn khối lượng tương ứng của mẫu với cát trong ống lồng, cẩn thận không làm ảnh hưởng đến lớp silica gel

Nếu tỉ lệ mẫu được chiết chứa lượng những hạt lớn, hoặc là khó trộn trong ống lồng, thì cát và mẫu có thể được trộn trong bình chứa khác Lấy khoảng 2/3 lượng cát từ ống lồng vào trong bình chứa sạch, cẩn thận không làm ảnh hưởng đến lớp silica gel Trộn hoàn toàn cát với mẫu với dao trộn sạch, và đưa hỗn hợp mẫu/cát vào ống lồng

19

Nếu mẫu có độ ẩm quá cao thì để được chiết, thì cần phải lại một lượng nhỏ hơi ẩm trong mẫu Điều này sẽ làm cho nước thoát qua ống lồng nhanh hơn trong những giờ đầu của quá trình chiết Khi độ ẩm được tách khỏi trong những giờ đầu của quá trình chiết, mẫu sẽ được chiết một cách đồng nhất

5.2 Chiết mẫu chất thải hóa học (bao gồm dầu nhiên liêu ẩm/bùn dầu

và cặn dầu)

Lắp ráp một bình thót cổ, một bẫy Dean-Stark, và một thiết bị làm lạnh,

và tiền chiết với Toluen trong 3 giờ Sau khi tiền chiết, làm mát dụng cụ và loại

bỏ toluen sử dụng hoặc gom lại cho phép phân tích sau để làm sạch dụng cụ thủy tinh

Cân khoảng 1 gam mẫu chất thải đến 2 chữ số thập phân vào bình 125 ml Thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn loãng trong acetone vào mẫu trong bình Nối ống tách chiết Dean-Stark tiền chiết với thiết bị làm lạnh vào bình chứa mẫu và chiết mẫu bằng dòng chảy ngược với 50 ml Toluen ít nhất trong 3 giờ

Tiếp tục cho chảy ngược mẫu cho đến khi tất cả nước được tách ra Làm lạnh mẫu, và lọc mẫu chiết Toluen qua một giấy lọc sợi thủy tinh vào bình chứa tròn 100 ml Rửa giấy lọc với 10 ml Toluen, và trộn mẫu chiết với lượng vừa lọc

ra Cô đặc dung dịch đến khoảng 10 ml sử dụng hoặc là thiết bị bay hơi K-D hoặc là thiết bị bay hơi R-110 Cho phần cô đặc vào phễu tách 125 ml Rửa bình với Toluen và thêm lượng rửa đó vào phễu chiết Sau đó xử lý làm sạch mẫu

Chuẩn bị 2 tỉ lệ 1 gam của mẫu được chọn để đánh dấu Sau khi cân mẫu trong bình (cân cả bình), thêm 1 ml dung dịch chuẩn đánh dấu mẫu loãng trong acetone vào 2 tỉ lệ đã chọn Sau khi cho dung dịch đánh dấu đạt cân bằng trong

1 giờ, thêm dung dịch nội chuẩn và chiết những mẫu đánh dấu như các bước nói trên

5.3 Chiết mẫu tro bụi

Cân khoảng 10 gam tro bụi chính xác đến 2 chữ số thập phân, cho vào một hủ chiết Thêm 1 ml dung dịch chất nội chuẩn pha loãng trong acetone vào mẫu

Thêm 150 ml dung dịch HCl 1N vào mẫu trong hủ Đậy hủ với một nắp đậy vặn có màng PTFE, đặt vào máy lắc cơ học, và lắc khoảng 3 giờ ở nhiệt độ phòng

Rửa giấy lọc Whatman #1 (hoặc tương đương) với Toluen, và sau đó lọc mẫu qua giấy lọc bằng phễu Buchner vào bình chứa dung tích 1 lít Rửa mẫu tro bụi với khoảng 500 ml nước hoạt hóa (organic-free reagent water)

Trộn mẫu tro bụi với cát trong ống lồng tiền chiết Đặt giấy lọc lên trên cát Đặt ống lồng trong ống chiết SDS, thêm 200 ml Toluen, và chiết khoảng 16 giờ Dung môi nên đi vòng hoàn toàn qua hệ thống 5-10 lần/giờ Làm nguội và lọc mẫu đã chiết qua trong Toluen qua một giấy lọc sợi thủy tinh vào trong bình chứa 500 ml Rửa giấy lọc với 10 ml Toluen Cô cạn mẫu chiết ra Sau đó cho mẫu vào phễu chiết 125 ml Rửa bình với Toluen và thêm phần rửa đó vào phễu chiết Xử lý làm sạch mẫu và thực hiện phân tích

Đặt ống lồng vào trong thiết bị SDS, thêm 200-250 ml Toluen, và cho chảy ngược trong 16 giờ Dung môi nên chảy vòng qua hoàn toàn hệ thống 5-10 lần/giờ

Ước lượng phần trăm lượng đất trong mẫu đất/trầm tích bằng việc đo lượng nước thoát ra trong quá trình chiết SDS Đối với mẫu quá ẩm, bẫy Dean-Stark có thể cần thiết để làm khô một hoặc nhiều lần trong 16 giờ chiết Gom nước từ bẫy, và đo thể tích của nó đến gần 0,1 ml Giả sử khối lượng riêng là 1g/ml, và tính toán ra phần trăm lượng đất theo công thức sau:

Phần trăm

đất trong mẫu =

Khối lượng mẫu ẩm - Khối lượng nước

x 100 Khối lượng mẫu ẩm ướt

Cô cạn phần chiết này Cho vào phễu chiết 125 ml Rửa bình với Toluen

và cho phần rửa đó vào phễu chiết Thực hiện quá trình làm sạch và thực hiện phân tích

Chuẩn bị 2 mẫu có tỉ lệ 10 gam của mẫu được chọn cho việc đánh dấu sử dụng như đánh dấu mẫu và nhân đôi đánh dấu Sau đó, cho các mẫu đánh dấu đó vào ống lồng trước khi chiết, thêm 1 ml dung dịch chuẩn đánh dấu nền pha loãng trong acetone vào mỗi mẫu đánh dấu Sau khi cho dung dịch đánh dấu đạt cân bằng trong khoảng 1 giờ, thêm chất nội chuẩn và chiết những mẫu này y như các bước trên

5.5 Chiết mẫu nước

Cho mẫu ở nhiệt độ môi trường, sau đó đánh dấu mặt khum của trên thành của lọ mẫu 1 lít để xác định chính xác thể tích mẫu

Thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn pha loãng trong acetone vào lọ mẫu Đậy nắp lọ, và trộn mẫu bằng lắc chậm khoảng 30 giây

21

Lọc mẫu qua giấy lọc 0,7 µm đã được rửa qua bởi Toluen Thu gom phần lọc ra vào bình sạch Nếu tổng lượng chất rắn hòa tan và lơ lửng quá nhiều khi lọc qua giấy lọc 0,7 µm, ly tâm mẫu, gạn chất lỏng và sau đó lọc phần chất lỏng Ngoài ra, việc xếp chồng giấy lọc để làm giảm những phần hở có thể được thực hiện Quy trình chiết của phần chất rắn lọc ra được nêu ở phần 1.5.5.1 bên dưới Phần chất lỏng có thể được chiết sử dụng kỹ thuật phễu chiết hoặc là cột chiết liquid-liquid liên tục trước khi thực hiện chiết

5.5.1 Phần chất rắn sau khi lọc

Gộp phần chất rắn trên giấy lọc và cả giấy lọc và nếu ly tâm được dùng thì cả những chất rắn trong chai lọc với cát trong ống lồng Soxhlet trước khi chiết Đặt giấy lọc trên hỗn hợp phần chất rắn với cát và đặt ống lồng vào trong thiết bị SDS

Thêm 200-250 ml Toluen vào thiết bị SDS và cho chảy ngược trong 16 giờ Dung môi nên chảy qua toàn bộ hệ thống 5-10 lần/giờ

Để nguội ống Soxhlet, lấy Toluen và cô đặc mẫu chiết này

Phương pháp chiết lưu chất áp lực PFE và chiết microwave có thể được

sử dụng và cũng có thể cho dữ liệu mong muốn

Na2SO4 với ít nhất 30 ml CH2Cl2 Cô đặc mẫu chiết này theo các bước sẽ được nêu bên dưới

- Chiết bằng phương pháp liquid-liquid liên tục: Một ống chiết LLE được

sử dụng trong phễu chiết khi thực hiện với mẫu từ nguồn đã cho chỉ ra rằng vấn

đề mẫu dạng nhũ tương sẽ gây kết quả hay khi mẫu nhũ tương bị gặp phải sử dụng phễu chiết Quy trình sau được sử dụng cho phương pháp LLE

+ Tiền chiết ống chiết LLE khoảng 3 giờ bằng CH2Cl2 và nước reagent

Để nguội ống chiết, loại bỏ phần CH2Cl2 và nước reagent và thêm vào mẫu lỏng

đã lọc vào trong ống LLE liên tục Thêm 60 ml CH2Cl2 vào lọ đựng mẫu, đậy kín và lắc khoảng 30 giây

+ Cho dung môi vào ống chiết Lặp lại việc rửa lọ mẫu bằng phần nhỏ

50-100 ml CH2Cl2 thêm vào và thêm phần rửa đó vào trong ống chiết thêm

200-500 ml CH2Cl2 vào bình chưng cất và đủ nước reagent để bảo đảm việc vận hành thích hợp Chiết khoảng 16 giờ Để nguội, sau đó gỡ kết nối bình và làm khô mẫu bằng cách chạy nó qua phễu rửa chứa sợi len thủy tinh và 5 gam

ra được cô đặc cùng nhau theo quy trình được mô tả bên dưới

5.5.4 Đo mẫu nước ban đầu bằng cách làm đầy lọ mẫu đến điểm đánh

dấu và cho chất lỏng vào ống hình trụ có chia độ 1 lít Ghi lại thể tích mẫu đến gần nhất 5 ml

5.5.5 Chuẩn bị 2 lượng mẫu đánh dấu 1 lít có tỉ lệ của mẫu được chọn để

đánh dấu mẫu và nhân đôi đánh dấu Thêm 1 ml dung dịch chuẩn đánh dấu mẫu pha loãng trong acetone vào mỗi mẫu đánh dấu trong lọ mẫu ban đầu Sau khi cho dung dịch đánh dấu đạt cân bằng khoảng 1 giờ, thêm dung dịch nội chuẩn

và lọc và chiết như các bước ở trên

5.6 Quy trình cô đặc macro (dùng cho tất cả các mẫu)

Trước khi làm sạch, những mẫu chiết ra từ tất cả các mẫu phải được cô đặc đến khoảng 10 ml Thêm vào đó, như ở trên đã nói, phần chiết được cô cạn

từ phần lọc ra và phần chất rắn còn lại sau lọc của mẫu nước phải được kết hợp lại trước khi làm sạch Hai quy trình có thể được sử dụng cho cô đặc macro: bay hơi quay, hoặc là Kuderna-Danish (K-D) Việc cô đặc của Toluen bằng K-D bao gồm việc giữ nhiệt, bởi vì điểm sôi của Toluen ở trên điểm sôi của nước Cụ thể

2 quy trinh như sau:

5.6.1 Cô đặc bằng K-D

Thêm 1 hoặc 2 mảnh nhỏ (để làm sôi đều) vào trong bình và nối cột Snyder 3 bi Làm ướt cột trước bằng cách thêm khoảng 1 ml Toluen qua phần đỉnh thiết bị

Nối bộ phận làm lạnh khôi phục dung môi, đặt bình dưới trong bộ phận giữ nhiệt và áp dụng nhiệt độ cần thiết để hoàn thành quá trình cô đặt trong khoảng 15-20 phút Ở tốc độ chưng cất hợp lý, những quả bi của cột sẽ dịch chuyển liên tục nhưng bình chứa không bị tràn

Khi thể tích nhìn thấy của chất lỏng tiến đến 10 ml, gỡ thiết bị K-D ra khỏi bồn nước và cho nó cạn và nguội ít nhất 10 phút

5.6.2 Cô đặc bằng phương pháp cô quay (rotary evaporator)

Lắp ráp hệ thống cô đặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất, làm nóng nước đến 45oC Làm sạch hệ thống bằng 100 ml dung dịch chiết sạch Lưu giữ cả hai dung môi sau khi làm sạch qua hệ thống và dung môi sạch ban đầu để kiểm tra

độ sạch khi cần thiết Giữa các mẫu, 3 tỉ lệ từ 2-3 ml Toluen nên được rửa xuống ống cung cấp vào bình chứa chất thải

Nối bình phía dưới để chứa mẫu chiết ra Lấy chân không chậm và bắt đầu cho quay mẫu Hạ thấp bình mẫu vào trong nước và điều chỉnh tốc độ quay

để có thể hoàn thành việc cô đặc trong 15-20 phút Ở tốc độ cô đặc thích hợp, dòng dung môi ngưng tụ vào trong bình chứa sẽ điều đặn

23

Khi thể tích chất lỏng nhìn thấy được tiến đến mức 10 ml, tắt chân không

và hệ thống quay Cho không khí đi chậm vào trong hệ thống, cẩn thận không làm tóe phần mẫu chiết ra khỏi bình chứa

5.7 Quy trình làm sạch axit-bazơ

Những mẫu chiết ra được cô đặc từ tất cả các dạng mẫu được thực hiện một loạt các quy trình làm sạch nói chung bắt đầu từ sự rửa axit-bazơ, và tiếp tục với một cột sắc ký silica gel, sắc ký oxit nhôm, và sắc ký cacbon Sự rửa axit-bazơ có thể không cần thiết cho những mẫu chiết không màu, nhưng tất cả quy trình làm sạch khác nên được thực hiện, không quan tâm đến màu của mẫu chiết ra Bắt đầu những quy trình làm sạch này bằng cách chuyển có định lượng mẫu chiết được cô đặc đến một phễu tách 125 ml

Trước khi làm sạch, tất cả các mẫu chiết được đánh dấu với chất chuẩn làm sạch 37Cl4-2,3,7,8-TCDD Sự khôi phục của chất chuẩn này được sử dụng

để đánh giá hiệu quả của quy trình làm sạch Đánh dấu 5 ml của chất chuẩn làm sạch (hay một thể tích lớn hơn của dung dịch pha loãng chứa 25 ng 37Cl4-2,3,7,8-TCDD) vào trong mỗi phễu tách chứa một mẫu chiết ra, kết quả thu được một hàm lượng 0,25 ng/µl trong mẫu chiết cuối cùng được phân tích bởi GC/MS

Lưu ý: Axit và bazơ đặc sinh nhiệt khi trộn với những dung dịch nước, và

có thể gây cho dung dịch sôi hay bắn tung tóe Thực hiện những quá trình chiết sau cẩn thận, cho nhiệt và áp suất trong phễu tách tan đi trước khi lắc phễu

Ngăn phần mẫu chiết được cô đặc với 40 ml axit sunfuric đặc Lắc 2 phút Lấy và loại bỏ lớp axit (Thực hiện việc rửa axit tối đa 4 lần)

Ngăn mẫu chiết được cô đặc với 40 ml dung dịch NaCl 5% (Chú ý: axit sinh ra trong mẫu chiết có thể sinh nhiệt khi trộn với dung dịch NaCl) Lắc khoảng 2 phút Lấy và loại bỏ lớp nước (ở dưới)

Ngăn phần mẫu chiết được cô đặc với 40 ml dung dịch KOH 20% (cho nhiệt thoát hết trước khi lắc) Lắc khoảng 2 phút Lấy và loại bỏ lớp bazơ (ở dưới) Lặp lại quá trình rửa bazơ cho đến khi màu không còn ở lớp bazơ ở dưới (thực hiện tối đa 4 lần) Bazơ mạnh (KOH) được biết là có thể phân hủy PCDDs/PCDFs; do đó, thời gian thực hiện nên là ngắn nhất có thể

Ngăn phần mẫu chiết được cô đặc với 40 ml dung dịch NaCl 5% (Lưu ý: axit trong mẫu chiết có thể sinh nhiệt khi trộn lẫn với dung dịch NaCl) Lắc 2 phút Lấy và loại bỏ lớp dung dịch phía dưới Làm khô lớp hữu cơ bằng cách rót qua một chiết phễu chứa lớp lọc điền đầy 1/2 phễu của Na2SO4 khan Thu mẫu chiết trong lượng thích hợp (100-250 ml) vào bình ở dưới Rửa phễu tách bởi 2 phần 15 ml hexane, rót qua phễu và trộn vào mẫu chiết

Cô đặc mẫu chiết từ tất cả các loại mẫu ban đầu đến 1 ml hexane sử dụng quy trình sau đây (mục 5.8) Việc trao đổi dung môi thu được bằng cách cô đặc mẫu chiết đến khoảng 100 µl, thêm 2-3 ml hexane vào ống cô đặc và tiếp tục cô đặc đến thể tích cuối cùng là 1 ml

24

5.8 Quy trình cô đặc vi mô (cho tất cả các mẫu tiến hành)

Khi nồng độ cô đặc hơn nữa được đòi hỏi, hoặc là dùng kỹ thuật cột micro-Snyder hoặc là kỹ thuật bay hơi nitrogen được sử dụng để điều chỉnh mẫu chiết đến thể tích cuối cùng được yêu cầu

Khi thể tích chất lỏng thấy được tiến đến 0,5 ml, gỡ thiết bị K-D từ bồn nước và cho nó sạch và làm mát ít nhất 10 phút Gỡ cột Snyder và rửa bình và những điểm thấp hơn của nó với khoảng 0,2 ml dung môi và thêm vào ống cô đặc Điều chỉnh thể tích cuối cùng đến 1 ml với dung môi

5.8.2 Kỹ thuật bay hơi nitrogen

Đặc ống cô đặc trong bồn nước ấm (khoảng 35oC) và cho bay hơi thể tích dung môi đến mức yêu cầu sử dụng dòng nitrogen khô, sạch (được lọc qua một ống chứa than hoạt tính) Lưu ý: không sử dụng ống làm bằng nhựa giữa bẫy than và mẫu)

Thành trong của mẫu phải được rửa xuống vài lần với dung môi thích hợp trong quá trình vận hành Trong quá trình làm bay hơi, mức dung môi trong ống phải được đặt để ngăn nước ngưng tụ thành mẫu (mức dung môi nên dưới mức nước trong bồn) Dưới điều kiện vận hành bình thường, mẫu chiết không nên được cho thành khô

Khi thể tích nhìn thấy của chất lỏng tiến đến 0,5 ml, gỡ ống cô đặc từ bồn nước Điều chỉnh thể tích cuối cùng đến 1 ml với dung môi

5.9 Quy trình sắc ký cột Silica gel và oxit nhôm

5.9.1 Cột Silica gel: Gắn sợi len thủy tinh vào phía dưới của cột trọng

lượng (cột thủy tinh 1 x 30 cm) vừa với khóa van PTFE Thêm 1 g silica gel và

gõ nhẹ để cho silica gel rơi xuống Thêm 2 g NaOH-có trộn với silica gel, 1g silica gel, 4 g axit sunfuric trộn silica gel và 2 g silica gel Gõ nhẹ cột sau mỗi lần thêm vào Một áp suất nhỏ (5 psi) của nitrogen có thể sử dụng nếu cần thiết

5.9.2 Cột nhôm oxit: Gắn sợi thủy tinh vào phía dưới của cột trọng lực

(cột thủy tinh 1 x 30 cm) gắn với khóa PTFE Thêm 6 g nhôm oxit hoạt tính Gõ nhẹ phía trên cột

Thêm hexane vào mỗi cột cho đến khi trong cột không có bóng bóng khí Một áp suất nhỏ (5 psi) của khí nitrogen có thể được sử dụng nếu cần thiết Kiểm tra cột có tạo dòng chảy không Nếu dòng chảy xuất hiện, loại bỏ cột Không gõ vào cột ẩm

Lắp ráp 2 cột lại để mà chất thoát ra từ cột silica gel sẽ đi trực tiếp vào cột nhôm oxit Hoặc là 2 cột có thể được tách rời ra

Cho các mẫu đã cô đặc ở trên vào cột silica gel Rửa bình với lượng vừa

đủ hexane (1-2 ml)

có gắn nhãn bị mất đi đâu nếu hệ số phục hồi nhỏ hơn 50%

Thêm 20 ml dung dịch 20% CH2Cl2 - 80% hexane (về thể tích) vào cột 2

Chuẩn bị cột thủy tinh dài 4 inch bằng cách cắt phần cuối của pipet huyết thanh dùng 1 lần 10 ml Nối sợi thủy tinh vào phần cuối của cột, và đóng chặt nó với 1 g hỗn hợp cacbon/Celite Nối sợi thủy tinh nữa vào đầu còn lại

Rửa cột với:

- 4 ml Toluen

- 2 ml CH2Cl2/methanol/Toluen (75:20:5 về thể tích)

- 4 ml cyclohexane/CH2Cl2 (50:50 về thể tích) Trong khi cột vẫn ẩm, chuyển mẫu vào cột cacbon đã chuẩn bị Rửa bình chứa với 2 phần 0,5 ml hexane và chuyển lượng rửa đó vào cột cacbon Tách rửa cột với những dung môi sau:

- 10 ml cyclohexane/CH2Cl2 (50:50 về thể tích)

- 5 ml CH2Cl2/methanol/Toluen (75:20:5 về thể tích) Một khi các dung môi đã thoát qua cột, lật cột lại và tách rửa phần PCDD/PCDF với 20 ml Toluen và thu phần tách ra

5.11 Cô đặc lần cuối

Cho bay hơi Toluen của mẫu thu được ở bước trên đến khoảng 1 ml, sử dụng quy trình ở mục 5.6 Chuyển mẫu chiết đến bình nón 2 ml sử dụng Toluen

để rửa bình

Lưu ý: không cho bay hơi mẫu đến khô

Thêm 100 µl tridecane (hoặc nonane) vào mẫu chiết và làm giảm thể tích đến 100 µl sử dụng dòng hơi nhẹ của nitrogen khô, sạch Thể tích cuối cùng là

100 µl tridecane (hoặc nonane) Đậy kín bình và giữ mẫu chiết trong bóng tối ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích

5.12 Điều kiện vận hành sắc ký

Thiết lập những điều kiện vận hành GC cần thiết để thu được độ phân giải

và độ nhạy yêu cầu cho phép phân tích, sử dụng những điều kiện sau cho cột DB-5:

Tốc độ dòng Helium: 35-40 cm/s ở 240oC

Nhiệt độ ban đầu: 170oC

26

Thời gian đầu: 10 phút

Chương trình nhiệt độ: tăng đến 320oC với tốc độ 8oC/phút

Thời gian giữ: Cho đến khi OCDF thoát ra

Thời gian tổng cộng: 40-45 phút

Trên cột DB-5, độ phân giải của sắc ký được đánh giá sử dụng chất hiệu chỉnh CC3 trong cả 2 lần hiệu chỉnh ban đầu và hiệu chỉnh xác nhận Sự tách peak sắc ký giữa 13C12-2,3,7,8-TCDD và 13C12-1,2,3,4-TCDD phải được phân giải với phần chênh lệch (valley) ≤ 25%, ở đó:

% Valley = (x/y).100 Với y là chiều cao peak của bất kỳ đồng phân TCDD

x là đại lượng được tính như trên hình 2.1

Hình 2.1 Độ chênh lệch giữa 2,3,7,8-TCDD và những đồng phân gần khác

thoát ra trên cột GC DB-5

Tiêu chuẩn độ phân giải phải được đánh giá sử dụng sự đo lường được làm trên cấu hình dòng ion chọn lọc (SCIP) cho những ion xấp xỉ cho mỗi đồng phân Phép đo không được thực hiện từ cấu hình dòng ion tổng

Tối ưu hóa điều kiện vận hành cho độ nhạy và độ phân giải và sử dụng cũng điều kiện cho cả hai phép phân tích mẫu và hiệu chỉnh

5.13 Hiệu chỉnh GC/MS

Hiệu chỉnh hệ thống bao gồm 3 quy trình tách rời: hiệu chỉnh khối lượng

MS, thiết lập cửa sổ thời gian lưu và hiệu chỉnh chất phân tích mục tiêu

Lưu ý: Tất cả thể tích các mẫu chiết, mẫu trắng và mẫu kiểm soát chất

lượng và dung dịch hiệu chỉnh phải như nhau

5.13.1 Hiệu chỉnh khối lượng

Hiệu chỉnh khối lượng của MS được thực hiện trước khi phân tích dung dịch hiệu chỉnh, mẫu trắng và mẫu chất Thiết bị cần được hiệu chỉnh đến độ nhạy cao hơn trong khoảng khối lượng cao để thu kết quả tốt hơn cho những hợp chất thoát ra sau Tối ưu kết quả bằng cách sử dụng FC-43 cho hiệu chỉnh khối lượng có thể thu được bằng quét từ 222-510 amu mỗi giây hoặc ít hơn, sử

27

dụng điện thế 70 V năng lượng electron trong kiểu ion hóa điện tử Dưới những điều kiện này, m/z 414 và m/z 502 sẽ khoảng 30-50% m/z 264 (peak nền)

5.13.2 Cửa sổ thời gian lưu

Trước khi hiệu chỉnh chất phân tích mục tiêu, cần phải thiết lập thời gian vận hành cho các mức hiển thị SIM (bảng 1.8)

Bảng 2.8 Các mức hiển thị SIM đề xuất

Những ion của mỗi chế độ hiển thị đề xuất được sắp xếp để mà có sự chồng lên nhau giữa các chế độ hiển thị Những ion cho những đồng phân TCDD, TCDF, PeCDD và PeCDF trong phần hiển thị đầu tiên, những ion cho PeCDD, PeCDF, HxCDD và HxCDF trong phần hiển thị thứ hai, những ion cho đồng phân HxCDD, HxCDF, HpCDD và HpCDF trong phần hiển thị thứ ba và những ion cho những đồng phân HpCDD, HpCDF, OCDD và OCDF trong phần hiển thị thứ tư Thời gian vận hành hiển thị được thiết lập như vậy để những đồng phân thoát ra từ GC trong cửa sổ thời gian lưu đã cho sẽ cũng là những ion của đồng phân đó được hiển thị Những đồng đẳng chồng lên nhau giữa các phần hiển thị, phòng thí nghiệm sẽ sử dụng để suy xét thiết lập thời gian lưu Tuy nhiên, không thiết lập thời gian vận hành mô tả như vậy để một sự thay đổi

28

trong phần hiển thị xảy ra ở hoặc gần thời gian lưu mong đợi của bất kỳ đồng phân của 2,3,7,8- nào

5.13.3 Hiệu chỉnh chất phân tích mục tiêu

Hai kiểu quy trình hiệu chỉnh, hiệu chỉnh ban đầu và hiệu chỉnh xác nhận,

là cần thiết Hiệu chỉnh ban đầu là cần thiết trước khi bất kỳ mẫu nào được phân tích, và không liên tục suốt sự phân tích mẫu, khi được quyết định bằng kết quả của hiệu chỉnh xác nhận Hiệu chỉnh xác nhận là cần thiết ở lúc bắt đầu của chu

kỳ thời gian 12 giờ mẫu được phân tích

* Hiệu chỉnh ban đầu: Khi hỗn hợp hiển thị đã được phân tích và thời gian vận hành hiển thị được xác nhận

Tiêu chuẩn có mặt ion tương ứng với PCDDs/PCDFs có mặt trong bảng 1.9 nên được nhìn thấy cho tất cả các peak bao gồm cả chất nội chuẩn và chất chuẩn khôi phục, trong tất cả các mẫu Giới hạn trên và giới hạn dưới của tỉ lệ ion có mặt ở khoảng ±15% xung quanh tỉ lệ lý thuyết cho mỗi cặp ion được chọn Tiêu chuẩn sạch của 37Cl4-2,3,7,8-TCDD là không chứa 35Cl, như vậy tỉ lệ ion không áp dụng cho hợp chất này

* Tính toán hệ số đáp ứng (RF) cho những 17 chất phân tích mục tiêu không gắn nhãn tương ứng với nội chuẩn thích hợp (RFn) (bảng 2.9) theo công thức bên dưới Cho 7 chất phân tích không gắn nhãn và chất chuẩn sạch 37Cl4-2,3,7,8-TCDD được tìm thấy trong dung dịch CC3, chỉ duy nhất 1 chỉ số RF được tính cho mỗi chất phân tích Cho 10 hợp chất không gắn nhãn còn lại, tính

hệ số RF của mỗi chất trong mỗi chuẩn hiệu chỉnh

Bảng 2.9 Quan hệ của chất nội chuẩn đến chất phân tích, và chuẩn phục hồi đến chất nội chuẩn, chuẩn làm sạch và chất phân tích

Các chất nội chuẩn và chất phân tích Chất nội chuẩn Chất phân tích 13

13

C12-HpCDF

1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,5,8,9-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF

29

Tính toán hệ số RFs cho 5 chất nội chuẩn gắn nhãn và chuẩn làm sạch tương ứng với chuẩn phục hồi thích hợp (RFis) (bảng 2.9), trong mỗi chuẩn hiệu chỉnh, theo công thức sau:

(An1 + An2) x Qis

(Ais 1

+ Ais 2

) x Qn

(Ais1 + Ais2) x Qrs(Ars

1

+ Ars 2

Qn là lượng chất mục tiêu không gắn nhãn được tiêm vào (ng)

Qis là lượng chất nội chuẩn thích hợp được tiêm vào (ng)

Qrs là lượng chất chuẩn phục hồi thích hợp được tiêm vào (ng)

Chỉ có một ion định lượng cho chuẩn làm sạch 37Cl Tính toán hệ số đáp ứng tương đối như được miêu tả cho RFis, sử dụng một diện tích cho chất chuẩn làm sạch, và tổng các diện tích của các ion từ chuẩn phục hồi

Chỉ số RFn và x RFis là đại lượng không thứ nguyên, do đó đơn vị được sử dụng để thể hiện Qn, Qis và Qrs phải giống nhau

Tính toán hệ số đáp ứng cho PCDDs/PCDFs không gắn nhãn liên quan đến chuẩn phục hồi (RFrs), ở đó:

% = Độ ệ ê ẩ

30

Chỉ số %RSD của 5 số RFs (CC1 đến CC5) cho những chất không gắn nhãn PCDDs/PCDFs và chất nội chuẩn không được vượt quá 20%

Những hệ số đáp ứng được sử dụng để xác định hàm lượng đồng đẳng tổng

Chuẩn bị dung dịch CC3 bằng trộn thể tích của dung dịch cho trong bảng 2.5 để thu được thể tích cuối cùng là 1 ml ở hàm lượng được liệt kê cho dung dịch CC3 trong bảng 2.3 Hoặc có thể sử dụng những dung dịch có sẵn chứa các hợp chất mục tiêu ở hàm lượng CC3 được cho trong bảng 2.3

Với cột DB-5, bắt đầu chu kỳ 12 giờ với việc phân tích dung dịch CC3 Tiêm tỉ lệ 2 µl của dung dịch xác nhận hiệu chỉnh (CC3) vào trong GC/MS Những điều kiện GC/MS/DS sử dụng cho phép phân tích của những dung dịch hiệu chỉnh ban đầu phải được sử dụng cho dung dịch xác nhận hiệu chỉnh Đánh giá độ phân giải sắc ký thông qua tiêu chuẩn QC nêu ở mục 5.12

Đánh giá hệ số RFs cho 17 chất phân tích mục tiêu không gắn nhãn tương ứng với những chất nội chuẩn thích hợp của chúng (RFn) và những hệ số đáp ứng cho 5 chất nội chuẩn gắn nhãn và chuẩn làm sạch tương ứng với chuẩn phục hồi thích hợp (RFis) theo công thức nêu ở mục 5.13.3

Tính toán hệ số RFs cho những chất không gắn nhãn PCDDs/PCDFs tương ứng với chuẩn phục hồi (RFrs), sử dụng công thức ở mục 5.13.3

Không tiếp tục thực hiện phân tích mẫu cho đến khi tiêu chuẩn xác nhận hiệu chỉnh được đáp ứng cho:

- Tiêu chuẩn độ phân giải cột GC: độ phân giải sắc ký trên cột DB-5 phải đạt được tiêu chuẩn ở mục 5.12 Thêm vào đó, sự tách peak sắc ký giữa 1,2,3,4,7,8-HxCDD và 1,2,3,6,7,8-HxCDD trong dung dịch CC3 phải được phân giải với độ chênh lệch %valey ≤ 50% (hình 1.1)

- Tiêu chuẩn có mặt giàu ion: sự có mặt ion tương đối được cho trong bảng 2.10

Bảng 2.10 Tiêu chuẩn cho xác định tỉ lệ đồng vị đối với các chất PCDDs/PCDFs

Chất phân tích Những ion

được chọn

Sự có mặt ion theo lý thuyết

Các giới hạn kiểm soát