hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá tương dương sinh học của thuốc tác dụng kéo dài và hệ điều trị qua da

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC QUỐC TẾ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – HÀN QUỐC BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG Q

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC QUỐC TẾ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

VIỆT NAM – HÀN QUỐC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC TÁC DỤNG KÉO DÀI VÀ HỆ ĐIỀU TRỊ QUA DA

Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Văn Tựu

Cơ quan chủ trì: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

7554

03/11/2009

HÀ NỘI - 2009

CHƯƠNG TRÌNH HỢP TÁC QUỐC TẾ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

VIỆT NAM – HÀN QUỐC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ

HỢP TÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC CỦA THUỐC TÁC DỤNG

KÉO DÀI VÀ HỆ ĐIỀU TRỊ QUA DA

Chủ nhiệm nhiệm vụ Cơ quan chủ trì:

TS Nguyễn Văn Tựu PGS TS Trịnh Văn Lẩu

HÀ NỘI - 2009

MỤC LỤC

1.1 Nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học 3

1.2 Tình hình nghiên cứu và ban hành hướng dẫn về nghiên cứu

1.4 Tổng quan về hai chế phẩm dùng trong nghiên cứu thực nghiệm 12

1.4.1 Chế phẩm tác dụng kéo dài có chứa Gliclazid 12

2.1 Đánh giá tương đương sinh học in vivo thuốc tác dụng kéo dài 15

2.1.1 Thuốc nghiên cứu, thiết bị, hóa chất, dung môi 15

2.1.2 Thiết kế nghiên cứu 16

2.1.4 Người tình nguyện 17

2.1.5 Phương pháp cho uống thuốc và lấy mẫu 17

2.1.8 Xác định các thông số dược động học và đánh giá tương đương sinh

2.2 Đánh giá tương đương in vitro hệ điều trị qua da 25

2.2.1 Thuốc nghiên cứu, thiết bị, nguyên vật liệu 25

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 26

2.2.3 Chuẩn bị mẫu thử - lấy mẫu 28

2.2.4 Phương pháp phân tích 28

2.3 Xây dựng qui trình đánh giá tương đương cho 2 chế phẩm 29

3.1 Đánh giá tương đương sinh học viên nén Gliclazid tác dụng kéo

3.1.3 Kết quả phân tích, thống kê, đánh giá tương đương sinh học 33

3.1.4 Kết quả xác định sinh khả dụng và đánh giá tương đương sinh học 42

3.2 Đánh giá tương đương in vitro Thuốc dán Ketoprofen 48

3.2.2 Xác định lượng ketoprofen thấm qua da theo thời gian 48

4.3 Nghiên cứu xây dựng hướng dẫn 65

4.4 Hiệu quả của sự hợp tác nghiên cứu theo nghị định thư 67

DANH MỤC CÁC BẢNG KẾT QUẢ

Bảng 3.1: Bố trí uống thuốc theo bảng ngẫu nhiên

Bảng 3.2: Nồng độ Gliclazid trung bình trong huyết tương

Bảng 3.3: Nồng độ Gliclazid tối đa trong huyết tương (Cmax)

Bảng 3.4: Thời gian đạt đến nồng độ tối đa trong huyết tương (Tmax)

Bảng 3.5: Diện tích dưới đường cong nồng độ – thời gian (AUC)

Bảng 3.6: Nồng độ Cmin trong khoảng thời gian τ ở trạng thái ổn định

Bảng 3.7: Nồng độ Cav trong khoảng thời gian τ khi thử đa liều

Bảng 3.8: Độ dao động DF và DF/τ trong khoảng thời gian τ khi thử đa liều

Bảng 3.9: Sinh khả dụng tương đối của thuốc thử so với thuốc chứng

Bảng 3.10: So sánh Cmax bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều

Bảng 3.11: So sánh AUC 0-∞ bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đơn liều

Bảng 3.12: So sánh Tmax bằng phương pháp thống kê phi tham số, đơn liều

Bảng 3.13: So sánh Cmax bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đa liều

Bảng 3.14: So sánh AUCss bằng phương pháp khoảng tin cậy 90%, đa liều

Bảng 3.15: So sánh Tmax bằng phương pháp thống kê phi tham số, đa liều

Bảng 3.16: Thông số dược động học trung bình sau khi uống viên Gliclazid MR

Bảng 3.17: Lượng Ketoprofen thấm qua da từ chế phẩm thử tích lũy theo thời gian

Bảng 3.18: Lượng Ketoprofen thấm qua da từ chế phẩm chứng tích lũy theo thời gian Bảng 3.19- Tập hợp hệ số flux của chế phẩm thử và chứng

Bảng 3.20 Phân tích một số Hướng dẫn đã tham khảo

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ - ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Quá trình tuyển chọn, kiểm tra sức khỏe, uống thuốc, lấy mẫu, xử lý và phân tích Hình 2.2 Thiết bị xác định độ thấm qua da

Hình 2.3 Qui trình chuẩn bị miếng da làm thsi nghiệm

Hình 3.1: Đường cong nồng độ thuốc trung bình – thời gian khi thử đơn liều

Hình 3.2: Đường cong nồng độ thuốc trung bình – thời gian khi thử đa liều

Hình 3.3: Lượng Ketoprofen từ chế phẩm thử thấm qua da tích lũy theo thời gian

Hình 3.4: Lượng Ketoprofen từ chế phẩm chứng thấm qua da tích lũy theo thời gian

DANH MỤC CÁC SẢN PHẨM:

SẢN PHẨM 1

SẢN PHẨM 3

- Qui trình đánh giá tương đương sinh học viên nén Gliclazid tác dụng kéo dài

- Qui trình đánh giá tương đương hệ điều trị qua da Ketoprofen

SẢN PHẨM 4

- Hướng dẫn đánh giá tương đương thuốc tác dụng kéo dài

- Hướng dẫn đánh giá tương đương hệ điều trị qua da

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

ASEAN Hiệp hội các nước khu vực đông nam châu Á

AUC Diện tích dưới đường cong

AUC 0-t Diện tích dưới đường cong từ thời điểm 0 đến t AUC 0-∞ Diện tích dưới đường cong từ thời điểm 0 đến vô cùng BCS Hệ thống phân loại sinh dược

Cmax Nồng độ thuốc tối đa

TĐSH Tương đương sinh học

Tmax Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa

USP Dược điển Mỹ

VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

WHO Tổ chức y tế thế giới

lý ngành chưa ban hành một qui chế hoặc hướng dẫn nào về việc cấp phép lưu hành liên quan tới bằng chứng sinh khả dụng và tương đương sinh học Trước tình trạng thị trường thuốc Việt Nam đang quá nhiều chủng loại, qui chế đăng ký thuốc hiện hành chưa đủ các tiêu chí để đánh giá chất lượng thuốc một cách đích thực, việc áp dụng qui định về sinh khả dụng và tương đương sinh học trong xét cấp phép lưu hành sẽ góp phần đảm bảo chất lượng thuốc dùng trong điều trị Đặc biệt với các thuốc có tác dụng kéo dài (dạng tác dụng kéo dài), quá trình phóng thích dược chất

đã được thay đổi bằng tác động kỹ thuật theo ý muốn của con người, nên cần thiết xây dựng chuẩn mực chất lượng để đánh giá

Trong thời gian qua, một số nghiên cứu đã được thực hiện, nhưng hầu hết còn mang tính chất tự phát, nhằm tiếp cận các kỹ thuật phân tích và đánh giá chất lượng sản phẩm Hơn nữa, với các dạng thuốc đặc biệt, hiểu biết của các nhà quản

lý về kỹ thuật bào chế và yêu cầu chất lượng của dạng thuốc còn hạn chế Cũng chính vì vậy, việc xem xét khi cấp phép cho các dạng thuốc này còn nhiều lúng túng, do chưa xây dựng được những tiêu chí chất lượng rõ ràng, đầy đủ

Trước xu thế toàn cầu hóa, khi mà yêu cầu về sinh khả dụng và tương đương sinh học có thể coi như một tiêu chí kỹ thuật được hầu hết các nước trên thế giới

thừa nhận Nếu quốc gia nào không áp dụng thì sẽ có những kẽ hở để thuốc kém chất lượng đưa vào thị trường, gây thiệt hại cho chất lượng điều trị và nền kinh tế nói chung Về trình độ kỹ thuật và trang thiết bị của Việt Nam còn chênh lệch nhiều

so với thế giới, khả năng đầu tư cho lĩnh vực này còn hạn chế, nên việc áp dụng những qui chế, hướng dẫn của các nước tiên tiến trong điều kiện hiện tại đã gặp nhiều điều bất cập Để dần dần nâng cao năng lực, có khả năng hòa hợp khu vực và toàn cầu, việc xây dựng và ban hành các Hướng dẫn và qui trình thử nghiệm phù hợp với điều kiện trong nước là cần thiết

Khoa Dược, Trường Đại học Sung Kyun Kwan là một đơn vị hợp tác với Việt Nam nói chung và Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương nói riêng từ nhiều năm qua Một số cán bộ của Viện đã được gửi đào tạo và tốt nghiệp trên đại học tại Trường Trên cơ sở đó, Viện đã đề xuất chương trình hợp tác nghiên cứu, trao đổi kinh nghiệm và đào tạo với Trường dựa trên sự kế thừa và các kinh nghiệm thực tế, với mục tiêu chung của nhiệm vụ: xây dựng tài liệu đánh giá tương đương sinh học của thuốc tác dụng kéo dài và hệ điều trị qua da phù hợp điều kiện Việt Nam Các mục tiêu cụ thể như sau:

- Xây dựng qui trình đánh giá tương đương sinh học của thuốc tác dụng kéo dài

- Xây dựng qui trình đánh giá tương đương sinh học của hệ điều trị qua da

Đề cương nghiên cứu của nhiệm vụ đã được Hội đồng khoa học xem xét và Bộ Khoa học-Công nghệ phê duyệt cho Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương thực hiện trong 2 năm với các nội dung như sau:

- Nghiên cứu thực nghiệm đánh giá tương đương sinh học chế phẩm tác dụng

kéo dài có chứa gliclazid

- Nghiên cứu thực nghiệm đánh giá tương đương in vitro chế phẩm hệ điều trị

qua da có chứa ketoprofen

- Xây dựng qui trình đánh giá tương đương cho 2 loại chế phẩm có chứa 2 dược

chất đã nghiên cứu thực nghiệm

- Xây dựng hướng dẫn đánh giá tương đương cho 2 dạng bào chế tác dụng kéo

dài và hệ điều trị qua da

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Nghiên cứu sinh khả dụng và đánh giá tương đương sinh học

Sinh khả dụng (SKD) là đặc tính biểu thị tốc độ và mức độ hấp thu của một

dược chất hoặc nhóm chất có tác dụng vào tuần hoàn chung và sẵn có ở nơi tác động Nghiên cứu sinh khả dụng là những nghiên cứu về khả năng hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của dược chất hay chất có tác dụng trong cơ thể Nghiên cứu

có thể áp dụng cho dược chất mới, dạng bào chế mới, hoặc trên các đối tượng khác nhau, thường được thực hiện thông qua theo dõi nồng độ thuốc trong máu sau khi dùng Trên thực tế, đa số các dược chất có tác dụng toàn thân và người ta cho rằng nồng độ dược chất trong hệ tuần hoàn có tương quan với nồng độ dược chất ở nơi tác động Do vậy, có thể đánh giá sinh khả dụng của thuốc thông qua theo dõi nồng

độ thuốc trong máu

Khái niệm tương đương sinh học (TĐSH) được dùng để chỉ hai thuốc tương đương bào chế và có sinh khả dụng tương tự sau khi dùng cùng một mức liều, trong cùng điều kiện thử nghiệm Trong hầu hết các trường hợp, nghiên cứu TĐSH là so sánh SKD của 2 thuốc có chứa cùng dược chất trên người tình nguyện sau khi dùng cùng một mức liều, trong cùng điều kiện thử nghiệm Một số trường hợp nghiên cứu TĐSH có thể là các nghiên cứu so sánh dược lực hoặc so sánh lâm sàng Những

khái niệm này đã được đề cập trong Hướng dẫn nghiên cứu sinh khả dụng và tương

đương sinh học [3]

Như vậy, nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học có thể có mục tiêu và

ý nghĩa khác nhau, nhưng phương pháp và quá trình thực hiện là tương tự như nhau Nghiên cứu thường được thực hiện trên người tình nguyện (NTN) khỏe mạnh Sinh khả dụng được đánh giá dựa trên nồng độ thuốc theo thời gian từ khi thuốc được dùng cho tới khi thuốc thải trừ ra khỏi cơ thể Để đường biểu diễn nồng độ - thời gian phản ánh chính xác quá trình thuốc ở trong cơ thể, phải có đủ số mẫu máu và phân bố ở những thời điểm phù hợp Thời gian lấy mẫu thường kéo dài bằng khoảng 5 – 7 lần thời gian bán thải của dược chất Sự hấp thu, phân bố thuốc phụ

thuộc nhiều vào từng cá thể Do vậy, để hạn chế sự khác nhau đó, các nghiên cứu SKD và TĐSH thường được thiết kế chéo (mỗi NTN sẽ sử dụng cả 2 loại thuốc nghiên cứu (thử và chứng), sau một khoảng thời gian đủ dài để thuốc có thể thải trừ

ra khỏi cơ thể Số lượng NTN cho mỗi nghiên cứu phải đủ cho xử lý thống kê, nhưng cũng không nên quá nhiều vì chi phí cho các nghiên cứu này khá nhiều Bên cạnh đó, các nghiên cứu thực hiện trên người phải đảm bảo nguyên tắc về đạo đức

Đề cương nghiên cứu phải được phê duyệt bởi một hội đồng đạo đức Quá trình nghiên cứu phải được kiểm soát chặt chẽ với các hồ sơ, số liệu ghi chép đầy đủ, chính xác và rõ ràng Báo cáo kết quả trình bày quá trình nghiên cứu và các kết quả

có thể kiểm soát được

1.2 Tình hình nghiên cứu và ban hành hướng dẫn về nghiên cứu SKD và

và hướng dẫn cho việc nghiên cứu và cấp phép lưu hành thuốc Các qui chế của Mỹ qui định khá rõ ràng về hồ sơ cần đệ trình khi đăng ký sản xuất và lưu hành các loại thuốc, cũng như trường hợp thay đổi sau khi được cấp phép Đồng thời, FDA cũng ban hành các tài liệu mang tính chất hướng dẫn kỹ thuật cho thực hiện nghiên cứu như hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích, hướng dẫn xử lý và bảo quản

mẫu sinh học và xem xét miễn thử SKD hoặc TĐSH in vivo cho những thuốc uống

dạng rắn [12],[18] [19] [20] Cùng với đó, Dược điển Mỹ cũng ban hành chuyên

luận Hướng dẫn nghiên cứu tương đương sinh học in vivo, kèm theo là qui trình thử

cho một số chế phẩm cụ thể, trong đó có 2 thuốc tác dụng kéo dài (Diclofenac và Pentoxyphillin) [37] Hiệp hội các nước Châu Âu cũng đã ban hành hướng dẫn nghiên cứu chung và hướng dẫn cho dạng thuốc tác dụng kéo dài [33] Nói chung, hướng dẫn của các nước tiên tiến, đặc biệt của châu Âu thường chung chung và đưa

ra các yêu cầu cao mà điều kiện hiện tại của Việt Nam chưa thể thực hiện được

Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã dự thảo hướng dẫn chung cho các nghiên cứu đánh giá thuốc generic, trong đó đề cập đến dạng thuốc phóng thích kéo dài cần phải thực hiện nghiên cứu, nhưng chưa có hướng dẫn chi tiết Theo hướng dẫn của WHO, các qui định cụ thể sẽ được ban hành riêng để phù hợp với trình độ quản lý

và năng lực kỹ thuật thực tế của của từng quốc gia [39]

Một số nước châu Á như Hàn quốc, Trung Quốc cũng đã có những hướng dẫn cho việc thử nghiệm SKD/TĐSH (bằng tiếng địa phương) Mặc dù vậy, cho đến nay Hàn Quốc chưa chính thức ban hành hướng dẫn cho dạng thuốc tác dụng kéo dài cũng như hệ điều trị qua da

Trong quá trình triển khai hội nhập kinh tế của các nước khối ASEAN, Ủy ban tư vấn về tiêu chuẩn và chất lượng của ASEAN (ASEAN Consultative Committee for Standard and Quality - ACCSQ) đã có nhiều cuộc họp thường niên

để bàn về việc thống nhất các tiêu chí hoà hợp Trong tiến trình này, bản “Hướng

dẫn thực hiện đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc” đã được

xây dựng để áp dụng cho việc công nhận kết quả nghiên cứu lẫn nhau về thuốc khi xét cấp phép lưu hành giữa các nước trong khối Đây là tài liệu hướng dẫn chung nhất cho việc thực hiện đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học Các cuộc họp chủ yếu thảo luận các dạng thuốc uống thông thường, chưa đề cập tới dạng bào chế đặc biệt như tác dụng kéo dài hay hệ điều trị qua da Trên thực tế, nghiên cứu của các nước ASEAN cũng thực hiện với các chế phẩm qui ước, và hiếm có nghiên cứu trên chế phẩm tác dụng kéo dài

1.2.2 Trong nước

Cho tới nay, Việt Nam chưa ban hành một văn bản nào hướng dẫn thực hiện

các thử nghiệm đánh giá SKD và TĐSH Năm 2008, bản Hướng dẫn thực hành tốt

thử thuốc trên lâm sàng (GCP) đã được ban hành (số 799/2008/QĐ-BYT) là những

tài liệu hướng dẫn chi tiết về đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu thực hiện trên người Đồng thời, kèm theo quyết định số 2626, ngày 17/05/2008, Bộ Y tế cũng ban hành Qui chế hoạt động của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Bộ Y tế Bản qui chế này qui định cụ thể các hoạt động của Hội đồng theo chuẩn mực GCP hiện hành [4]

Trong thời gian gần đây, trường đại học Dược đã thực hiện một số nghiên cứu dạng phóng thích kéo dài như: bào chế viên nén Nifedipin [5]; viên nén Salbutamol [11];

Nghiên cứu chất lượng viên Ketoprofen tác dụng kéo dài [1] Một số nghiên cứu

khác về tương đương điều trị cũng đã bước đầu được đề cập đến như nghiên cứu đánh giá tương đương điều trị của chế phẩm Rifampicin, Omeprazol Những nghiên cứu này đã góp phần rất tích cực trong đào tạo đội ngũ cán bộ ngành dược có thêm kiến thức về SKD và TĐSH Kết quả có ý nghĩa lớn trong đào tạo, nhưng còn hạn chế về thực tiễn đánh giá sản phẩm thuốc; các qui định về GCP (trong pha lâm sàng) cũng như GLP (trong phân tích) chưa được áp dụng và tuân thủ một cách đầy

đủ Với chế phẩm phóng thích kéo dài, chưa có một nghiên cứu đặc biệt nào được

áp dụng để đánh giá về ảnh hưởng của thức ăn hoặc đánh giá ở trạng thái ổn định

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương là đơn vị đầu tiên triển khai thực hiện các nghiên cứu đánh giá TĐSH một cách chính quy theo yêu cầu của nhà nước Việc tiếp cận phương pháp nghiên cứu, tài liệu hướng dẫn, chuẩn bị cơ sở vật chất

đã được tiến hành từ năm 2003 Cho đến nay, một số nghiên cứu đã được thực hiện, có thể theo yêu cầu của cơ quan quản lý để xem xét cấp phép lưu hành hoặc một số nghiên cứu khác theo yêu cầu của chính các doanh nghiệp nhằm tự đánh giá chất lượng thuốc của mình như Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang, Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm

Trước nhu cầu hội nhập và mục tiêu tăng cường đảm bảo chất lượng cho thuốc, Cục Quản lý Dược đang soạn thảo ban hành danh mục các thuốc yêu cầu

phải cung cấp dữ liệu về SKD và TĐSH khi xin cấp phép lưu hành Danh mục này

đã được gửi lấy ý kiến của các doanh nghiệp dược trong và ngoài nước đang kinh doanh dược phẩm ở Việt Nam Do có nhiều ý kiến bàn luận chưa được giải quyết thỏa đáng, nên thời điểm áp dụng dự kiến ban đầu là tháng 1/ 2009 đã phải lui lại đến tháng 07/ 2009 Theo đó các thuốc phóng thích kéo dài đều bắt buộc phải có kết quả đánh giá SKD và TĐSH khi xin cấp phép lưu hành Chính vì vậy, việc xây dựng tiêu chí đánh giá và hướng dẫn nghiên cứu càng cấp thiết hơn

1.3 Tổng quan về hai dạng thuốc nghiên cứu

1.3.1 Thuốc tác dụng kéo dài

Trong nghiên cứu phát triển dược phẩm, nghiên cứu bào chế làm thay đổi khả năng hoặc vị trí phóng thích dược chất ra khỏi dạng thuốc ngày càng được quan tâm Những nghiên cứu này có thể tạo ra các dạng bào chế đặc biệt nhằm cải thiện hiệu quả điều trị và sử dụng Mong muốn thường gặp nhất là điều chỉnh sự phóng thích dược chất nhằm duy trì tác dụng điều trị trong một thời gian dài, giảm các phản ứng bất lợi hoặc vì một vài mục đích điều trị khác

Nghiên cứu dạng thuốc tác dụng kéo dài chưa được phổ biến ở Việt Nam Gần đây, một số nghiên cứu cũng đã được thực hiện nhưng chủ yếu ở qui mô phòng thí nghiệm của các trường đại học hoặc viện nghiên cứu [5], [11] , việc nâng cỡ lô và triển khai ở qui mô sản xuất công nghiệp còn hạn chế

Tại các nước có nền công nghiệp dược phát triển, để có được một chế phẩm tác dụng kéo dài, phải trải qua quá trình nghiên cứu rất công phu từ giai đoạn lựa chọn công thức, kỹ thuật bào chế đến đánh giá chất lượng [34] Chất lượng của dạng thuốc phóng thích kéo dài được chú trọng cải thiện liên tục trong quá trình nghiên cứu phát triển một chế phẩm mới Từ xây dựng công thức, nghiên cứu tăng cỡ lô theo qui mô sản xuất Việc điều chỉnh công thức có thể gây ảnh hưởng lên tính chất của thuốc Người ta cho rằng, phép thử độ hòa tan có thể dự đoán những thay đổi ảnh hưởng tới hiệu quả và độ an toàn của thuốc Phép thử độ hòa tan phải được xây dựng với các điều kiện thử sao cho có thể xác định mức đáp ứng của chế phẩm với

môi trường sinh lý mong muốn sau khi dùng Trong nghiên cứu chuẩn mực, người

ta xác định khả năng phân biệt điều kiện thử đã chọn của phép thử bằng so sánh dữ

liệu độ hòa tan in vitro và dữ liệu SKD in vivo của những công thức khác nhau Nếu đạt được một tương quan in vitro – in vivo (IVIVC, in vivo – in vitro corelation),

phương pháp thử ĐHT sau khi thẩm định có thể được coi là phép đánh giá chất

lượng tin cậy nhất liên quan tới hiệu quả in vivo

Giống như nghiên cứu bào chế các dạng thuốc khác, bào chế các dạng thuốc tác dụng kéo dài cần xem xét đến mục đích điều trị muốn đạt được Với mỗi dược chất, cần đánh giá đặc tính dược động học (AUC, Cmax, Tmax, t1/2) Những thay đổi đối với dược chất (kích thước tiểu phân, hình dạng), và tá dược kiểm soát phóng thích (kích thước tiểu phân, đặc tính tạo gel- dính) hoặc qui trình sản xuất là những yếu tố gây ảnh hưởng nhiều nhất tới sinh khả dụng của thuốc

Do vậy, với các chế phẩm phóng thích kéo dài, nghiên cứu sinh khả dụng là bắt buộc trong hầu hết các trường hợp Nghiên cứu SKD cần phải thực hiện trên mẫu sản xuất có cỡ lô ít nhất bằng 1/10 lô sản xuất qui mô công nghiệp Có thể chấp nhận mẫu nghiên cứu SKD lấy từ cỡ lô nhỏ hơn nếu những lô này được sản xuất trong điều kiện cơ bản của qui trình sản xuất theo cỡ lô qui mô công nghiệp

Do cơ chế theo hướng phóng thích muộn hoặc kéo dài, các thuốc tác dụng kéo dài thường tồn tại lâu trong đường tiêu hóa nên có nhiều khả năng thức ăn ảnh hưởng tới sinh khả dụng của thuốc Do vậy, ngoài những nghiên cứu sinh khả dụng theo yêu cầu chung như những thuốc qui ước, cần đánh giá ảnh hưởng của thức ăn với các chế phẩm tác dụng kéo dài Sự ảnh hưởng của thức ăn có thể do:

- Chậm vận chuyển qua dạ dày;

- Kích thích lưu lượng mật;

- Thay đổi pH đường tiêu hóa;

- Tăng lưu lượng máu nội tạng;

- Thay đổi chuyển hóa dược chất trong đường tiêu hóa;

- Tương tác về vật lý hoặc hóa học với dược chất hoặc dạng thuốc

Với các thuốc phóng thích ngay thuộc nhóm 2, 3, 4 của hệ phân loại BCS và tất cả các thuốc tác dụng kéo dài, ảnh hưởng của thức ăn thường là do sự kết hợp của

nhiều yếu tố phức tạp làm ảnh hưởng tới độ hòa tan in vivo và sự hấp thu của thuốc

Ảnh hưởng của thức ăn nhiều nhất khi thuốc được dùng ngay sau bữa ăn Lượng thức ăn, tỷ lệ chất dinh dưỡng, nhiệt độ của thức ăn đều có thể gây nên những thay đổi sinh lý trong đường tiêu hóa, làm ảnh hưởng tới thời gian vận chuyển thuốc qua

đó, ảnh hưởng tới độ tan, khả năng thấm của thuốc và khả năng tuần hoàn Nói chung, các bữa ăn có lượng chất béo cao và nhiều năng lượng sẽ làm ảnh hưởng tới sinh lý đường tiêu hóa nhiều hơn, gây ảnh hưởng nhiều hơn tới SKD của thuốc Do vậy, trong các nghiên cứu cần đánh giá ảnh hưởng của thức ăn hoặc nghiên cứu TĐSH trong tình trạng không đói, nên dùng bữa ăn có nhiều chất béo và giàu năng lượng Trên thực tế, thật khó để xác định chính xác cơ chế thức ăn làm thay đổi SKD của thuốc nếu không thực hiện những nghiên cứu đặc hiệu về cơ chế Với một

số thuốc, ảnh hưởng có thể do thuốc chuyển hóa lần đầu qua gan; thuốc dễ bị hấp phụ, tạo phức với thức ăn; hoặc không bền trong đường tiêu hóa Hơn nữa, tá dược hoặc chính những thay đổi do thức ăn trong ruột có thể góp phần thêm vào những ảnh hưởng của thức ăn tới sinh khả dụng của thuốc Tuy nhiên, trong những nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học, người ta hy vọng rằng ảnh hưởng của thức ăn

sẽ tương tự nhau giữa thuốc thử và thuốc đối chứng, nên nếu thực hiện so sánh với thiết kế chéo trong cùng điều kiện, hai thuốc chịu sự ảnh hưởng sẽ có thể xác định được mức độ ảnh hưởng [18], [7]

Bên cạnh các qui định về SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành, qui chế đăng ký thuốc của hầu hết các quốc gia đều yêu cầu xem xét hoặc cần thiết phải nghiên cứu cho trường hợp thay đổi sau khi đã cấp phép lưu hành Nói chung, với các trường hợp thay đổi sau lưu hành, cần cung cấp dữ liệu nghiên cứu SKD/TĐSH so với sản

phẩm trước khi thay đổi, đặc biệt với trường hợp không có sự tương quan in vitro –

in vivo hoặc tương quan ở mức thấp Nếu vẫn chưa thể nộp được kết quả đánh giá

SKD/TĐSH, cần phải giải thích rõ Nếu chế phẩm có mức tương quan in vitro – in

vivo tốt (mức A) và tiêu chuẩn phóng thích không thay đổi, (ví dụ những thay đổi

thuộc loại II, thay đổi với tá dược không kiểm soát sự phóng thích; thay đổi không đáng kể với những tá dược kiểm soát sự phóng thích, hoặc những thay đổi về cách

bố trí sản xuất), có thể được chấp nhận dựa trên các dữ liệu in vitro và chỉ số điều trị

của dược chất [34]

Một trong những dạng thuốc phóng thích biến đổi là dạng thuốc phóng thích muộn,

do chủ ý của nhà sản xuất muốn cho dược chất phóng thích muộn lại trong một khoảng thời gian định trước sau khi dùng và sau đó thì phóng thích như dạng thuốc thông thường Với dạng thuốc này, chỉ có thêm một khoảng thời gian thuốc tiềm tàng trong cơ thể mà không gây thay đổi về các thông số dược động học khác Trong nghiên cứu bào chế, cần xác định rõ ý nghĩa của thuốc phóng thích muộn, là

để bảo vệ niêm mạc dạ dày, bảo vệ dược chất khỏi ảnh hưởng của môi trường acid

dạ dày hoặc dự định cho dược chất phóng thích trong một đoạn xác định của đường tiêu hóa để điều trị tại chỗ Cần giải thích rõ về việc lựa chọn tá dược để thuốc có thể chịu đựng được môi trường acid dịch vị (hoặc phóng thích ở một pH nào đó trong ruột)

Việc đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học cho các thuốc tác dụng kéo dài là bắt buộc, nhưng trên thực tế ở nước ta và các nước khác trong khu vực ASEAN còn rất hạn chế Chưa có nhiều nghiên cứu được thực hiện ở khu vực này,

và cũng chưa có một hướng dẫn nào cho nghiên cứu SKD và TĐSH các thuốc này

Từ giữa năm 2008, Cục Quản lý Dược yêu cầu bổ sung kết quả nghiên cứu SKD và TĐSH cho dạng thuốc này khi nộp hồ sơ đăng ký lưu hành, nhưng chưa có qui định

cụ thể về yêu cầu nghiên cứu

1.3.2 Dạng thuốc hệ điều trị qua da

Cho tới nay, hệ điều trị qua da vẫn còn khá mới ở Việt Nam, tài liệu hướng dẫn về bào chế cũng như đánh giá chất lượng còn hạn chế Trên thực tế, chưa có chế phẩm nào được nghiên cứu sản xuất ở trong nước được phép lưu hành dựa trên những nghiên cứu, đánh giá chất lượng một cách đầy đủ

Hệ điều trị qua da là một dạng thuốc được bào chế dưới dạng thuốc dán trên da để dược chất được hấp thu qua da vào máu Bằng cách sử dụng hệ tá dược kết hợp với cấu trúc đặc biệt của da làm cho hệ điều trị qua da có khả năng điều chỉnh theo hướng kéo dài sự phóng thích và hấp thu dược chất vào cơ thể Dạng thuốc sử dụng đơn giản, đa số các trường hợp đều có khả năng kéo dài tác dụng điều trị, nên ngày càng có triển vọng phát triển Tuy nhiên, lựa chọn hệ tá dược và kỹ thuật bào chế cho một chế phẩm đáp ứng được các yêu cầu chất lượng của hệ điều trị qua da cũng rất phức tạp trong quá trình nghiên cứu phát triển sản phẩm, phải thực hiện các nghiên cứu để đạt được tốc độ và mức độ dược chất ra khỏi dạng bào chế và hấp thu vào cơ thể như mong muốn

Về mặt bào chế, dựa theo sự phân tán dược chất trong dạng thuốc, có thể phân làm

4 loại như sau [7], [8]:

- Dược chất được phân tán vào màng

- Dược chất được phân tán vào cốt trơ

- Dược chất phân tán trong nền dính

- Dược chất phân tán vào các polymer thân nước

Một số nhóm dược chất đã được nghiên cứu bào chế dạng hệ điều trị qua da như:

- Các chất chống viêm phi steroid: như ketoprofen, piroxicam, diclofenac

- Các nội tiết tố: estradiol và các dẫn chất, thuốc tránh thai

- Thuốc dùng trong hệ tim mạch, huyết áp: nitroglycerin, isosorbid dinitrat, clonidin

- Một số thuốc khác: hyoscin, scopolamin, chlopheniramin (chống say tàu xe); nicotin (cai nghiện thuốc lá)

So với thuốc dùng qua đường uống, hệ điều trị qua da có một số ưu điểm như sau:

- Thuốc hấp thu qua da nên tránh được những yếu tố ảnh hưởng của đường tiêu hóa như pH, dịch tiêu hóa, thức ăn trong dạ dày

- Dược chất được hấp thu thẳng vào hệ mạch, tránh được những chuyển hóa qua gan lần đầu, hạn chế thuốc bị phân hủy hoặc giảm hiệu lực điều trị

- Thuốc được dự trữ và phóng thích theo tốc độ và mức độ xác định, nên có thể cải thiện được thời gian tác dụng cho những dược chất có thời gian bán thải ngắn Có thể điều chỉnh để nồng độ thuốc luôn nằm trong khoảng điều trị Do vậy, thuốc thích hợp cho các bệnh hen suyễn, tim mạch và huyết áp

- Sử dụng thuốc đơn giản, bệnh nhân không phải dùng thuốc nhiều lần

Tuy nhiên, chỉ một số dược chất có thể thích hợp để bào chế và sử dụng dưới dạng

hệ điều trị qua da, như phải có tác dụng tương đối mạnh, rõ ràng; bền, không quá nhạy cảm và kích ứng trên da [7], [8]

Để có thể đưa ra thị trường một sản phẩm hệ điều trị qua da đáp ứng yêu cầu

và có hiệu quả điều trị như mong muốn, cần thực hiện các nghiên cứu trong quá trình sản xuất như:

- Nghiên cứu động học quá trình phóng thích dược chất, bằng phép thử độ hòa

tan hoặc tính thấm qua da in vitro

- Nghiên cứu quá trình thấm qua da người in vivo, điều chỉnh công thức và kỹ

thuật bào chế để đạt được tốc độ thấm qua da mong muốn

- Nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo để xác định được phương pháp

thích hợp dùng trong đánh giá chất lượng trong quá trình sản xuất và lưu hành

Sinh khả dụng của hệ điều trị qua da chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố:

- Đặc tính của dược chất, chủ yếu về tính thân dầu hay nước, hệ số khuếch tán của dược chất

- Đặc điểm, cấu trúc của da (phụ thuộc vào loại da khô hay da dầu, vị trí da trên cơ thể ) Do đặc điểm của da có nhiều lớp: biểu bì, trung bì và hạ bì có cấu trúc phức tạp, các lớp mỡ xen kẽ, các tuyến, mạch dẫn Ngoài ra, các yếu tố như nhiệt độ, nước cũng tác động nhiều tới khả năng hấp thu của da

- Tá dược: tá dược nền, cốt phân tán

1.4 Tổng quan về hai chế phẩm dùng trong nghiên cứu thực nghiệm

1.4.1 Chế phẩm tác dụng kéo dài có chứa gliclazid

Gliclazid dưới dạng bột kết tinh màu trắng, hầu như không tan trong nước, tan nhiều trong methylen chlorid, tan ít trong aceton và alcol Công thức hóa học và công thức phân tử như dưới đây [36]

- Công thức phân tử : C15H21N3O3S

- Khối lượng phân tử : 323,4

- Công thức cấu tạo :

Gliclazid là một acid yếu (pKa = 5,98) Hệ số phân bố dầu/nước của gliclazid

là logP = 2,418, do đó có khả năng dùng phương pháp chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ để chiết tách ra khỏi dịch sinh học

Gliclazid được dùng làm thuốc chống đái tháo đường thuộc nhóm sulfonylure, thuốc tác dụng do kích thích tế bào tuyến tụy giải phóng insulin Do vậy, thuốc chỉ

có tác dụng khi tuyến tụy còn hoạt động Gliclazid dễ hấp thu qua đường tiêu hóa Thời gian đạt đến nồng độ thuốc tối đa sau khi uống thuốc: khoảng 2-4 giờ với các thuốc qui ước và khoảng 7 giờ với các thuốc giải phóng chậm Thời gian bán thải khoảng 10-14 giờ Thuốc thải trừ chủ yếu qua đường thận và một phần qua phân Gliclazid là một thuốc chống đái tháo đường nhóm sulfonylure, thuốc tác dụng do kích thích tế bào tuyến tụy giải phóng insulin Do vậy, thuốc chỉ có tác dụng khi tuyến tụy còn hoạt động Gliclazid dễ hấp thu qua đường tiêu hóa Thời gian đạt đến nồng độ thuốc tối đa sau khi uống thuốc: khoảng 2-4 giờ với các thuốc qui ước và khoảng 7 giờ với các thuốc giải phóng chậm Thời gian bán thải khoảng 10-14 giờ Thuốc thải trừ chủ yếu qua đường thận và một phần qua phân

Liều thường dùng hàng ngày ở người lớn là 40 – 320mg/ ngày (1 - 4 viên 30mg), chia 1 - 2 lần Liều có thể điều chỉnh tăng tùy theo đáp ứng của bệnh Liều tối đa 320mg/ngày, chia làm 2 lần [2]

Hiện nay, gliclazid thường được dùng trong điều trị dưới cả dạng thuốc phóng thích ngay (viên nén 80mg) và dạng tác dụng kéo dài (viên nén 30mg) Chế phẩm Diamicron MR 30mg là dạng viên tác dụng kéo dài đầu tiên được phép lưu hành (thuốc phát minh) Liều dùng cho dạng thuốc tác dụng kéo dài là 1 - 4 viên, một lần/ ngày Hiện nay một số nhà sản xuất đang nghiên cứu dạng tác dụng kéo dài 60mg, dùng 1-2 viên / lần/ ngày

1.4.2 Chế phẩm Ketoprofen hệ điều trị qua da

nước, tan trong benzen, dễ tan trong ethanol, chlorofor, aceton và ether Ketoprofen

là một acid yếu (pKa = 5,94) Công thức hóa học và công thức phân tử như dưới đây [36]

- Công thức phân tử : C16H14O3

- Khối lượng phân tử : 254,28

- Công thức cấu tạo :

Hệ số phân bố dầu/nước của ketoprofen là logP = 0,97, do đó có khả năng dùng phương pháp chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ để chiết tách ra khỏi dịch sinh học

Ketoprofen được dùng đường uống hoặc dạng hệ điều trị qua da Do thời gian bán thải ngắn của thuốc nên đường uống ketoprofen được dùng dưới dạng viên nén bao hoặc viên nang với liều 50mg, 3 lần/ngày, có thể tăng liều tới 100 mg, dùng 2-3 lần/ngày Hệ điều trị qua da có thể hạn chế các tác dụng phụ thường gặp của ketoprofen ở đường tiêu hóa, tăng tác dụng tại chỗ và giảm tần xuất dùng thuốc so với đường uống, được dùng dạng miếng dán 30 mg, một lần/ngày Trên thực tế, thuốc vừa có tác dụng tại chỗ, vừa có khả năng hấp thu qua da và có tác dụng toàn thân Mức độ hấp thu tùy thuộc vào từng chế phẩm do công thức và kỹ thuật bào chế khác nhau

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đánh giá tương đương sinh học in vivo thuốc tác dụng kéo dài

2.1.1 Thuốc nghiên cứu, thiết bị, hóa chất, dung môi:

Thuốc nghiên cứu

Theo thỏa thuận về việc bảo mật các thông tin của nhà sản xuất, trong báo cáo này, các mẫu thuốc dùng trong nghiên cứu được gọi là Thuốc thử (sản xuất trong nước)

và thuốc đối chứng (chế phẩm nhập ngoại)

Thuốc thử (mã hóa: T): Gliclazide controlled release tablets 60mg

Số lô: 06031; Hạn dùng: 11/08 Nơi sản xuất: Công ty TNHH Dược phẩm A, Việt Nam Thuốc được dự kiến dùng 1 -2 viên, một lần/ ngày

Thuốc đối chứng (mã hóa: R): Gliclazide Modified release 30mg, nhập khẩu

Số lô: 797982; Ngày sản xuất: 08/2007; Hạn dùng: 08/2010 Nơi sản xuất: Nhà phát minh, Pháp

Thuốc được chỉ định dùng 1 -4 viên, một lần/ ngày

Dung môi, hoá chất:

- Acetonitril, methanol, dicloromethan loại dùng cho HPLC - Merck

- Isopropanol, n - hexan và các hoá chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng trong chiết tách và sắc ký

Huyết tương: dùng huyết tương trắng của người, mua tại Viện Huyết học và Truyền

máu Trung ương

Thiết bị: đã được hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISO 17025 và GLP

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC SHIMADZU detector UV

- Các thiết bị: máy ly tâm lạnh, máy lắc, tủ bảo quản mẫu ở - 40oC và các loại dụng cụ thuỷ tinh có độ chính xác thích hợp

- Cột sắc ký: RP18 (250mm x 4mm, 5µm)

2.1.2 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu: Thiết kế chéo, 2 thuốc, 2 giai đoạn, đơn liều và đa liều, trong

tình trạng đói Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn là 10 ngày

Cỡ mẫu (số lượng người tình nguyện):

Tiến hành thử nghiệm thăm dò trên 3 người tình nguyện để khảo sát khoảng nồng độ thuốc và điều chỉnh thời gian lấy mẫu phù hợp Nghiên cứu chính thức thực hiện trên 20 NTN được tuyển chọn đạt yêu cầu chấp nhận

Ngẫu nhiên hóa (bố trí uống thuốc): Lựa chọn ngẫu nhiên bằng phần mềm excel để

xác định thứ tự loại thuốc sẽ uống trong giai đoạn 1

Theo thiết kế chéo, mỗi người tình nguyện sẽ uống cả 2 loại thuốc, theo trình tự AB hoặc BA

2.1.3 Đảm bảo các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu

Theo hướng dẫn thực hành tốt lâm sàng (GCP) và các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh học, đề cương nghiên cứu chi tiết được Hội đồng đạo đức cơ sở của Viện Kiểm nghiệm thuốc TW xem xét và thông qua Phiếu chấp thuận số 05/HĐ-ĐĐ ngày 06/06/2008

Tất cả người tình nguyện khi tham gia nghiên cứu đều phải được thông báo chi tiết

về nội dung và phương pháp cho uống thuốc, lấy mẫu NTN ký bản cam kết tham gia nghiên cứu một cách hoàn toàn tự nguyện trước khi bắt đầu nghiên cứu Quá trình đăng ký, tuyển chọn đều có kế hoạch, phân công cụ thể và tuân thủ theo đúng các phương pháp đã nêu trong đề cương

2.1.4 Người tình nguyện

Nguồn gốc: Tuyển chọn NTN là sinh viên của các trường đại học và một số người

đang làm việc trong khu vực Hà Nội

- Các chỉ số xét nghiệm máu đều phải trong giới hạn bình thường Xét nghiệm bao gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit; Sinh hoá lâm sàng: AST(GOT), ALT(GPT), creatinine, glucose;

- Xét nghiệm (bằng test thử nhanh) kháng thể HIV và kháng nguyên viêm gan B phải âm tính

Tiêu chuẩn loại trừ:

- NTN nghiện ma tuý, rượu hoặc thuốc lá;

- Người đang có những rối loạn về tim mạch, hô hấp, thận, tiêu hóa, miễn dịch, huyết học, nội tiết, hệ thần kinh hoặc bệnh tâm thần ;

- Người có các giá trị xét nghiệm nằm ngoài khoảng bình thường ;

- Người nghi ngờ có nhiễm HIV và HbsAg (dương tính với phép thử nhanh)

- Người có tiền sử dị ứng với thuốc nghiên cứu hoặc các thuốc cùng nhóm;

- Người mới bị ốm trong vòng 2 tuần trước khi uống thuốc giai đoạn I;

- Người đã dùng bất kỳ một loại thuốc nào gây cảm ứng hoặc ức chế chuyển hoá thuốc ở gan trong vòng 28 ngày trước khi uống thuốc giai đoạn I;

Qui trình kiểm tra NTN khi tuyển chọn: Tuyển chọn và kiểm tra NTN theo các chỉ

tiêu trên trong vòng 2 tuần trước khi bắt đầu uống thuốc giai đoạn 1

2.1.5 Phương pháp cho uống thuốc và lấy mẫu

Liều dùng và cách dùng:

- Đơn liều: 1 viên 60mg thuốc thử hoặc 2 viên 30mg thuốc đối chứng

- Đa liều: 1 viên 60mg thuốc thử hoặc 2 viên 30mg thuốc đối chứng/ lần/ ngày, liên tục trong 6 ngày

Trước khi uống thuốc, đo huyết áp tư thế ngồi và nhịp tim Uống thuốc với 250mL nước ấm trong tình trạng đói Nghiên cứu viên sẽ chuẩn bị thuốc và kiểm soát cho từng NTN uống thuốc đúng theo giờ đã qui định NTN chỉ được uống nước

1 giờ trước và sau khi uống thuốc, không kể khi uống thuốc Trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc, NTN không được nằm

Ăn, uống của NTN khi lấy mẫu: Khoảng 2 giờ sau khi uống thuốc, mỗi NTN được

uống 200ml dung dịch đường trắng 10% để phòng bị hạ đường huyết NTN dùng bữa ăn tiêu chuẩn khoảng 4 giờ sau khi uống thuốc, theo thời gian biểu từng giai đoạn Không được dùng các loại nước uống như rượu, nước uống có chứa cồn, caffein trong vòng 48 giờ trước khi uống thuốc và trong suốt thời gian lấy mẫu máu của mỗi giai đoạn

Dùng thuốc trong thời gian lấy mẫu: Trong thời gian nghiên cứu, NTN không được

dùng bất kỳ loại thuốc nào trừ khi cần phải điều trị các phản ứng bất lợi

Thời điểm lấy mẫu của mỗi giai đoạn:

Đơn liều: Lấy 1 mẫu thời điểm 0 giờ trước khi uống thuốc và các thời điểm (giờ) sau khi uống thuốc như sau

Do thuốc thử phóng thích rất chậm, dựa vào kết quả khảo sát, thời gian lấy mẫu được kéo dài đến 72 giờ

1 3 4 5 6 8 10 12 16 24 36 48 60 72

Đa liều: Thuốc thử được nghiên cứu và dự định dùng liều 1 lần/ ngày Do vậy, nghiên cứu đa liều được thiết kế đánh giá trên khoảng cách liều là 24 giờ Uống thuốc liên tục trong 6 ngày Ngày thứ 4 và 5, lấy 01 mẫu trước khi uống thuốc Ngày thứ 6, lấy 01 mẫu trước khi uống thuốc và các thời điểm (giờ) sau khi uống thuốc trong một khoảng liều như sau:

1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 16 24

Cách lấy máu: Dùng kim Vasocan Braunule 20G luồn vào tĩnh mạch cẳng tay của

mỗi NTN và cố định sao cho không cản trở các hoạt động bình thường của cẳng tay Mỗi lần lấy 6 mL máu bằng bơm tiêm rồi cho vào các ống nghiệm đã có sẵn chất chống đông (EDTA, 10mg/ ống) Các mẫu máu được ly tâm, tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở -40°C cho đến khi tiến hành phân tích

Theo dõi an toàn cho NTN: Cán bộ y tế sẽ theo dõi NTN trong suốt quá trình uống

thuốc và lấy mẫu Đo huyết áp tư thế ngồi và nhịp tim bất kỳ lúc nào NTN cảm thấy khó chịu Xử trí các phản ứng nếu xảy ra theo phác đồ qui định

Quá trình cho uống thuốc và lấy mẫu máu được thực hiện tại phòng lấy mẫu đặt tại Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, 48 – Hai Bà Trưng, Hà Nội Các bác sĩ, y tá của Bệnh viện Đống Đa cùng phối hợp theo dõi, giám sát và chăm sóc y tế cho NTN Phương tiện và thuốc cấp cứu cho các phản ứng sốc phản vệ và phản ứng bất lợi được chuẩn bị sẵn sàng để sơ cứu tại chỗ Trường hợp nặng sẽ được gửi tới phòng cấp cứu, BV Việt nam – Cuba, 37 – Hai Bà Trưng hoặc bệnh viện Đống Đa Quá

trình lấy mẫu tuân thủ theo Hướng dẫn thực hành tốt lâm sàng (GCP) của Tổ chức

Y tế thế giới

Quá trình thực hiện nghiên cứu in vivo được minh họa trên hình 2.1 từ các giai đoạn

tuyển chọn NTN, kiểm tra sức khỏe, cho uống thuốc và lấy mẫu đến khi phân tích

Khảo sát xác định các điều kiện sắc ký với các loại cột khác nhau, thành phần và tỷ

lệ pha động thích hợp để cho khả năng tách tốt nhất

[ ] ∑− ( ) ( )

=

+ + × −+

= 1

0

1 1

0

2

n i

i i i

i

AUC

Thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu qui định của dược điển

và hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học của US – FDA, bao gồm tính đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ chính xác, độ ổn định của chất cần nghiên cứu trong huyết tương khi bảo quản (sau 3 chu kỳ đông - rã đông và bảo quản dài ngày), độ

ổn định của dung dịch chuẩn gốc và nội chuẩn gốc trong ngày và thời gian dài

2.1.7 Phân tích mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc

Sử dụng phương pháp phân tích đã được thẩm định để định lượng các mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc

Khi phân tích, huyết tương được lấy ra khỏi tủ bảo quản và để tan chảy ở nhiệt độ phòng Tiến hành phân tích ngay sau khi để tan chảy Mẫu huyết tương của mỗi NTN (bao gồm cả thuốc thử và thuốc đối chứng được phân tích trong cùng 1 ngày với cùng một đường chuẩn và điều kiện phân tích

2.1.8 Xác định các thông số dược động học và đánh giá tương đương sinh học

Xác định thông số dược động học

Nghiên cứu đơn liều

Xác định các thông số dược động học của từng NTN theo nồng độ thuốc đã xác định được tại các thời điểm của quá trình thử đơn liều, bao gồm:

- Nồng độ thuốc tối đa (Cmax): xác định trực tiếp trên giá trị đo được

- Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Tmax): xác định trực tiếp trên giá trị đo được

- Diện tích dưới đường cong từ 0 – t và ngoại suy tới vô cùng (AUC0 – t và AUC0-∞):

Xác định bằng phương pháp hình thang, theo công thức:

Trong đó Ci là nồng độ thuốc tại thời điểm lấy mẫu ti

- Thời gian bán thải (T1/2): tính bằng công thức 0,693/Kel

Nghiên cứu đa liều

Xác định các thông số dược động học của từng NTN theo nồng độ thuốc đã xác định được tại các thời điểm của quá trình thử đa liều, bao gồm:

- Cmax, Tmax: xác định trực tiếp từ số liệu đo được tương ứng khi dùng liều cuối cùng (liều thứ 6)

- Nồng độ thuốc tối thiểu Cmin tính bằng công thức: Cmin = (C06 + Cτ)/ 2

trong đó: C06 là nồng độ thuốc ở thời điểm trước khi uống liều thứ 6

Cτ là nồng độ thuốc ở thời điểm τ (nồng độ của mẫu lấy tại thời điểm cuối cùng khi uống liều thứ 6)

- Nồng độ thuốc trung bình ở trạng thái ổn định (Cav)

Cav = (AUCss)/τ

trong đó τ là khoảng cách liều

- AUCss được tính theo phương pháp hình thang tương tự như đơn liều, trong khoảng thời gian τ (từ thời điểm 0 đến thời điểm 24 giờ của liều thứ 6)

- Độ dao động của nồng độ thuốc trong huyết tương (DF)

DF = (Cmax – Cmin) x 100%/ Cav

trong đó Cmax, Cmin và Cav là các giá trị tính được ở trên khi dùng

liều thứ 6 của quá trình uống thuốc đa liều

Xác định sinh khả dụng và đánh giá tương đương sinh học

Sinh khả dụng tương đối khi dùng đơn liều

F0-t = (AUC0-t)T/ (AUC0-t)R x 100%

F0-∞= (AUC0-∞)T/ (AUC0-∞)R x 100%

trong đó (AUC0-t)T và (AUC0-t)R là diện tích dưới đường cong tương ứng từ 0 đến thời điểm lấy mẫu cuối cùng (t) của thuốc thử và thuốc chứng

(AUC0-∞)T và (AUC0-∞)R là diện tích dưới đường cong tương ứng ngoại suy từ 0 đến

vô cùng của thuốc thử và thuốc chứng

Sinh khả dụng tương đối ở trạng thái ổn định:

Fss = (AUCss)T/ (AUCss)R x 100%

trong đó (AUCss)T và (AUCss)R là diện tích dưới đường cong tương ứng trong khoảng thời gian τ ở trạng thái ổn định của thuốc thử và thuốc chứng

Đánh giá tương đương sinh học

Nghiên cứu tiến hành so sánh sinh khả dụng tương đối của một thuốc thử là dạng phóng thích có kiểm soát với thuốc chứng là dạng tác dụng kéo dài khi dùng cùng một mức liều Do vậy, nghiên cứu nhằm đánh giá các thông số Cmax và AUC trung bình xem có đáp ứng yêu cầu về tương đương sinh học so với thuốc chứng không

t R

T

CI = ln( ) ± ( 0 , 1 ; ' ) 2 ×

Trong đó: T: Giá trị AUC0-∞ hoặc AUCss của thuốc thử

R: Giá trị AUC0-∞ hoặc AUCss của thuốc chứng N’: Bậc tự do của sai số xác định bằng ANOVA

MSE: Trung bình bình phương của sai số xác định bằng ANOVA N: Tổng số NTN tham gia đánh giá TĐSH

- So sánh DF/τ: Tính tỷ lệ giá trị DF/τ của thuốc thử so với thuốc chứng:

(DF/τ thử/ DF/τ chứng) x 100%

- So sánh Tmax: So sánh theo phương pháp thống kê phi tham số của Wilcoxon

(Wilcoxon signed – rank test) Giá trị Tmax của thuốc thử và thuốc chứng khác

nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,01) nếu tổng giá trị thứ tự xếp hạng dương hoặc âm

(sum of possitive or negative rank) nhỏ hơn hoặc bằng giá trị tra bảng với cỡ mẫu n

(n là số lượng cặp Tmax có sai khác)

Hai thuốc được coi là tương đương sinh học nếu:

- Khoảng tin cậy 90% của tỷ lệ Cmax và AUC trung bình của thuốc thử so với thuốc chứng nằm trong khoảng 80 – 125%, tính trên số liệu đã chuyển logarit

- Giá trị DF/τ của thuốc thử phải không lớn hơn 143% giá trị của thuốc chứng

- Giá trị Tmax của hai thuốc khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Loại bỏ số liệu NTN khi phân tích, đánh giá:

Không dùng mẫu của NTN vào phân tích nếu:

- NTN rút lui trong quá trình nghiên cứu, không tham gia hết các giai đoạn

- Trong hoặc sau khi nghiên cứu, phát hiện thấy NTN không tuân thủ những qui định của nghiên cứu

- NTN bị nôn hoặc ỉa chảy trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc hoặc có các phản ứng bất lợi nghiêm trọng trong khi uống thuốc và lấy mẫu

- Số các mẫu máu lấy bị mất ≥ 4 điểm

Không dùng số liệu của NTN vào tính thống kê nếu:

Mất ≥ 2 điểm lấy mẫu liên tiếp trong pha hấp thu hoặc xung quanh Tmax;

2.2 Đánh giá tương đương in vitro hệ điều trị qua da

2.2.1 Thuốc nghiên cứu, thiết bị, nguyên vật liệu

Thuốc nghiên cứu

Tương tự như phần nghiên cứu in vivo, trong báo cáo này, các mẫu thuốc dùng

trong nghiên cứu được gọi là Thuốc thử và Thuốc đối chứng

Thuốc thử (mã hóa: T): Thuốc dán Ketoprofen 30mg, đã được lưu hành

Số lô: KEI 411 Hạn dùng: 20110427 Nơi sản xuất: Công ty Dược phẩm B, Hàn Quốc

Thuốc đối chứng (mã hóa: R): Thuốc dán Ketoprofen 30mg, thuốc phát minh

Số lô: J22408165; Hạn dùng: 20110817 Nơi sản xuất: Nhà phát minh, Hàn Quốc

Cả 2 thuốc nghiên cứu đều có cùng hàm lượng 30mg, kích thước 10cm x 7 cm

Thiết bị: đã được hiệu chuẩn theo qui định, đáp ứng yêu cầu ISO 17025 và GLP

- Thiết bị thẩm thấu qua da (hình 2.2), có 6 bình Franz, φ 9mm

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC SHIMADZU detector UV

- Các thiết bị: máy ly tâm , máy lắc, tủ bảo quản mẫu ở - 40oC và các loại dụng

cụ thuỷ tinh có độ chính xác thích hợp

Chất chuẩn:

- Chuẩn Ketoprofen - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW; hàm lượng: 99,8%, độ

ẩm 0,03%, số lô: 0105178

- Chuẩn nội: Chất đối chiếu Naproxen - Sigma Chemical Co., USA

Dung môi, hoá chất:

- Acetonitril, methanol, dicloromethan loại dùng cho HPLC - Merck

- Isopropanol, n - hexan và các hoá chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (P.A.) dùng trong chiết tách và sắc ký

Màng thẩm thấu: Nghiên cứu khảo sát trên 3 loại màng khác nhau: màng nhân tạo,

màng da chuột cống và da thỏ

- Màng da nhân tạo Epiderm FT, Mattek, USA

- Da động vật: Thỏ được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

- Chuột cống trắng được mua từ Trung tâm nghiên cứu Học viện Quân y Cách chuẩn bị da động vật để làm thí nghiệm

Chọn lô động vật trưởng thành, có trọng lượng đồng đều (100 – 150g, 6 – 8 tuần tuổi) Động vật mua từ nhà cung cấp, được nuôi giữ, chăm sóc trong khoảng 1 tuần trước ngày tiến hành thí nghiệm Đến trước ngày thí nghiệm, cạo sạch lông ở vùng lưng Tiến hành bóc tách lấy lớp da Lọc bỏ toàn bộ lớp mỡ, tránh làm tổn thương bề mặt da Miếng da có thể được sử dụng ngay hoặc có thể bảo quản ở nhiệt

độ thích hợp (khoảng - 200C) tới khi thực hiện thử nghiệm (thời gian bảo quản không quá 1 tuần) Khi tiến hành, rã đông và cắt các miếng da có kích thước phù hợp cho thử nghiệm Các bước tiến hành được minh họa trong hình 2.3

Hydrat hóa: Các miếng da được hydrat hóa bằng cách ngâm trong môi trường khuếch tán khoảng 30 phút để đạt đến trạng thái cân bằng Mức độ hydrat hóa là một trong những yếu tố ảnh hưởng nhiều tới sự thấm của dược chất, do vậy lượng môi trường và thời gian hydrat hóa các miếng da phải giống nhau để đảm bảo sự đồng nhất

Môi trường nhận dược chất: Dược chất sau khi thẩm thấu qua màng da sẽ được hòa

tan vào trong một môi trường lỏng Môi trường có thể là nước cất, dung dịch đệm, hoặc các hỗn hợp dung môi thích hợp Trong thí nghiệm này, sử dụng đệm phosphat pH 7,4 (gần với pH của máu) Lắc siêu âm đuổi khí trong 30 phút trướng khi dùng

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu in vitro 2 thuốc, mỗi thuốc dùng 6 miếng, đánh giá độ thấm qua da

trong cùng điều kiện

Hình 2.2 Thiết bị xác định độ thấm qua da

Hình 2.3 Quá trình chuẩn bị miếng da làm thí nghiệm

2.2.3 Chuẩn bị mẫu thử-lấy mẫu:

Mẫu thử được dán lên lớp biểu bì của da và lắp vào thiết bị Tiến hành thử nghiệm song song trong cùng điều kiện với thuốc thử và thuốc đối chứng Mỗi loại, được thử trên ít nhất 6 đơn vị (6 miếng da) Các miếng da có thuốc thử và thuốc chứng cần được bố trí xen kẽ và thay đổi vị trí giữa các lần thử để loại bỏ ảnh hưởng của bình thử Bố trí được sắp xếp như sau:

Thời điểm lấy mẫu: Lấy mẫu tại các thời điểm (tính bằng giờ) sau khi vận hành thiết bị để xây dựng đường biểu thị mức độ giải phóng và thẩm thấu của dược chất qua màng theo thời gian như sau:

2.2.5 Đánh giá kết quả:

Từ kết quả phân tích, xác định nồng độ hoạt chất trong bình tiếp nhận tại từng thời điểm lấy mẫu Từ đó xác định lượng hoạt chất tích lũy tại từng thời điểm theo đơn vị diện tích bề mặt da hoặc màng theo công thức:

VrCt + ∑−

=

1 0 i

s C V

t i

Đánh giá tương đương in vitro, so sánh độ thấm qua da giữa chế phẩm thử và

chế phẩm chứng bằng phương pháp test t-student cho tập hợp hệ số flux thu được từ các đơn vị thử Giá trị P bằng 0,05 được sử dụng để đánh giá mức độ ý nghĩa thống

kê Hai chế phẩm được coi như có độ thấm qua da tương đương nhau nếu P>0.05

2.3 Xây dựng qui trình đánh giá tương đương cho 2 chế phẩm

Dựa trên các kết quả thực nghiệm và các hướng dẫn kỹ thuật, xây dựng qui trình đánh giá tương đương sinh học cho chế phẩm có chứa gliclazid tác dụng kéo

dài và đánh giá in vitro thuốc dán có chứa Ketoprofen

Qui trình bao gồm các phần: mục tiêu, yêu cầu thiết thị, hóa chất, tiêu chuẩn

người tình nguyện (qui trình in vivo), tiêu chuẩn chất lượng màng da (qui trình in

vitro), thiết kế, phương pháp phân tích, cách tính kết quả, nội dung báo cáo

2.4 Xây dựng Hướng dẫn cho hai dạng bào chế

2.4.1 Phân tích tài liệu tham khảo

Tập hợp các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước, phân loại tài liệu thành các nhóm để phân tích và tham khảo thông tin

Phân nhóm tài liệu tham khảo theo tổ chức, địa lý:

- Tài liệu của các khu vực, tổ chức: Châu Âu, WHO

- Tài liệu của các quốc gia: Trung Quốc, Canada, Mỹ

Phân nhóm tài liệu theo thông tin hướng dẫn:

- Tài liệu hướng dẫn chung

- Tài liệu hướng dẫn kỹ thuật

Phân tích các tài liệu theo nhóm để xác định các thông tin chung, phù hợp với điều kiện của Việt Nam

2.4.2 Xây dựng và hoàn thiện hướng dẫn

- Tổng hợp các dữ liệu phân tích từ phân tích tài liệu tham khảo (2.2.1) và những kinh nghiệm thông qua nghiên cứu thực nghiệm để Dự thảo hướng dẫn

- Xem xét các nghiên cứu trong nước cũng như của các nước khác

- Bản thảo lần 1 được gửi lấy ý kiến các chuyên gia đầu ngành về dược và tương đương sinh học

- Tổ chức hội thảo để thảo luận trực tiếp giữa các chuyên gia quản lý, kỹ thuật, và các cán bộ nghiên cứu

- Đăng một số nội dung trên tạp chí chuyên ngành để lấy ý kiến bạn đọc trong ngành

- Hoàn thiện bản thảo: Tập hợp các ý kiến góp ý Hoàn thiện bản thảo để nghiệm thu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng Gliclazid trong huyết tương Qui trình phân tích và điều kiện sắc ký xác định được như sau:

Qui trình phân tích:

Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng Ngay sau khi rã đông, lấy 1 ml huyết tương, thêm 50µl dung dịch nội chuẩn và 1 ml acetonitril, chiết bằng chloroform Lắc, ly tâm lấy lớp dung môi, bốc hơi dưới dòng khí N2 ở 40oC Hòa tan cắn trong 0,5 ml pha động Lắc, tiêm sắc ký Với các trường hợp mẫu có nồng độ vượt quá giới hạn định lượng trên của phương pháp, tiến hành pha loãng mẫu hai lần: lấy 0,5

mL mẫu huyết tương NTN, thêm 0,5 mL huyết tương trắng Lắc đều, xử lý mẫu theo quy trình như trên

Điều kiện sắc ký:

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu

- Cột : Rp18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), có bảo vệ cột Rp18 (4 x 3 mm, 5 µm) Nhiệt độ cột: 40oC

- Pha động: Đệm phosphat pH 3,0 - acetonitril, tỷ lệ thích hợp

- Có tính chọn lọc với Gliclazid

- Có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ Gliclazid với tỷ lệ diện tích pic của Gliclazid và chuẩn nội Glibenclamid, Khoảng nồng độ tuyến tính: 0,16µg/mL – 5,40µg/mL, hệ số tương quan tuyến tính: r ≥ 0,999

- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): 0,16 µg/mL

- Độ đúng và độ chính xác, tỷ lệ thu hồi của phương pháp được thực hiện ở 3 nồng độ: nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) Độ đúng cho giá trị trong ngày và khác ngày trong khoảng từ 93,8 – 113,2% so với giá trị thực, độ lặp lại dao động trong khoảng từ 2,2 – 6,5% tất cả các kết quả đều đáp ứng yêu cầu cho phép phân tích mẫu trong dịch sinh học (± 15%)

- Tỷ lệ thu hồi đạt trên 70% đối với cả 2 chuẩn và chuẩn nội

- Độ đúng và độ chính xác của phương pháp khi pha loãng mẫu 2 lần được thực hiện ở nồng độ khoảng 8,0 µg/mL, độ đúng: 101,0 %, độ chính xác: 1,0%

- Mẫu huyết tương ổn định khi bảo quản ở nhiệt độ - 40oC trong 75 ngày

3.1.2 Kết quả giai đoạn lâm sàng

Tiến hành cho uống thuốc và lấy mẫu theo phương pháp đã nêu trong phần

phương pháp (2.1.5)

Kết quả lựa chọn ngẫu nhiên để bố trí uống thuốc được nêu trong bảng 2

Bảng 1: Bố trí uống thuốc theo bảng ngẫu nhiên

Giai đoạn Người tình nguyện