Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng potx

Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang... Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này

TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy

Realtime PCR

Nguyên tắc và ứng dụng

PCR

PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR

PCR và phát hiện sản phẩm bằng

điện di trên gel agarose

1 Phát hiện điểm cuối

(End-Point Detection)

2 Độ đặc hiệu kém

3 Độ nhạy thấp

4 Độ phân giải kém

4 Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR

5 Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm

6 Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư)

Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang

REALTIME PCR

HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR

Kính lọc kích thích Kính lọc phát sáng

Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen

Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube)

1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6

Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11

C.33 C.31 C.29

C.34

Mẫu chưa biết [C]

Standard curve

PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU

Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu nền.

REALTIME PCR

REALTIME PCR

Rael time PCR định

lượng số copies trong

giai đoạn tăng lũy thừa

Log view

Primers Taq polymerase

dNTP PCR buffer MgCl 2

Real-time PCR MIX

Target DNA (Template)

Real-time PCR mix

Chất phát huỳnh quang

1 Chất nhuộm khi chèn vào sợi

đôi DNA sẽ phát huỳnh quang:

SYBR GREEN I

Huỳnh quang

SYBR GREEN I

DNA cần tìm

DNA không cần tìm

Không phân biệt được sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu

 Tính đặc hiệu không cao

 Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe

đặc hiệu

 Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có

primer dimer, không có amplicon không đặc hiệu

SYBR GREEN I

PHÂN BIỆT SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU

(Melting Curve)

Mục đích :

phân tích tính đặc hiệu của sản phẩm sau khuếch đại

Melting temperature (Tm) của dsDNA:

–To tại đó ½ pt DNA ở dạng sợi đôi, ½ sợi đơn–Phụ thuộc chiều dài và thành phần nucleotide

Melting Curve

PHÂN BIỆT

SẢN PHẨM ĐẶC HIỆU

(Melting Curve)

REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE

1 ƯU ĐIỂM

Probe đặc hiệuMultiplex PCR

2 NHƯỢC ĐIỂM

Giá thành cao

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease

DNA probe

C G C A A A G

T A

T C A T

C C C T C C A G G

G C

G

G

C C A

A T T

Q

DNA đích

F

GC A A A GT A T C A T C C C T C C A G C

G

T T

Q

C G T T T C A T A G T A G GGA GG T A

Stem Loop

enc her Dy

e

REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE

Giai đoạn biến tính

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Giai đoạn bắt cặp

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Giai đoạn kéo dài

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

1) Reaction efficiency (PCR efficiency ): E%, sử

dụng đường cong chuẩn (standard curve) Tối

ưu E 100% thì E=2

đánh giá độ chính xác trong thao tác

ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR

ỨNG DỤNG CỦA REALTIME PCR

TRONG CHẨN ĐOÁN

VÀ NGHIÊN CỨU

 Đơn giản, nhanh chóng,

Độ đặc hiệu tốt Công cụ tốt nhất

đoán kết quả

Realtime PCR là công cụ định lượng tác nhân

gây bệnh tốt nhất trong mẫu bệnh phẩm

Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm:

Samonella, Campyllobacter….

Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm:

Samonella, Campyllobacter….

Realtime PCR ứng dụng trong ung thư học lâm sàng

Phát hiện sự tồn lưu ác tính trong bệnh ung thư

-Trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) và bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho (ALL), dùng realtime

PCR định lượng 2 tổ hợp gen khác nhau gây bệnh là p190 và p210

So sánh kết quả định lượng trước và sau điều trị giúp đánh giá mức độ tồn lưu ác tính của bệnh

Realtime PCR trong nghiên cứu biểu hiện gen

Ứng dụng rất rộng rãi trong việc đánh giá mức độ biểu hiện gen.

VD: Sau khi tế bào được xử lý với kháng nguyên hay hóa chất, tìm hiểu sự đáp ứng của TB trong mức độ biểu hiện của gen đích

Các ng d ng khác c a Real-Time PCR ứ ụ ủ

discrimination)