Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

“Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng

trong kiểm tra động vật chuyển gen

Trang 3

Đặt vấn đề

• Động vật chuyển gen: là những động vật có hệ gen bị biến đổi bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen của nó Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ thế khác gọi là gen chuyển

• Để khẳng định ĐV có được chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem có gen lạ xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật hay không Phương pháp thường hay sử dụng đó là các kỹ thuật lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Nouthern blot….)

Trang 4

Hình ảnh một số động vật chuyển gene

Mèo phát sáng Cá gấu trúc phát sáng

Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp

43CNSH

Trang 5

Hình ảnh một số động vật chuyển gene

Dê tạo tơ nhện Lợn thân thiện với môi trường

Trang 6

Nội dung

1 Khái niệm về lai phân tử

2 Các phương pháp lai phân tử

3 Các phương pháp khác

4 Kết luận

43CNSH

Trang 7

1.Khái niệm về lai phân tử

• Lịch sử:

- 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý

ngành học tại Đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại

(reannealing).Quá trình này bao gồm sự kết hợp của những

mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững Từ sự khám phá ra quá trình reannealing phương pháp lai các nucleic được phát triển

- Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trọn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi

được đặt tên là thể lai (hybrid).

Trang 8

=> Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng lai DNA như 1 kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng

43CNSH

Trang 9

*Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA

Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy Tm thì 2 mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết Hydro nối liền mạch Sau khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này gọi là lai phân tử

* Đặc điểm của lai phân tử:

-Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự có trình tự hoàn toàn bổ sung

-Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lại DNA-RNA

Trang 10

1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến lai phân tử

- Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA

- Ảnh hưởng của độ dài DNA

- Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch)

- Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

43CNSH

Trang 11

1.1.1 Ảnh hưởng của thành phần base

Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau (A=T; G =C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là

tỷ lệ các base G,C Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng

công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C)

Trang 12

1.1.2 Ảnh hưởng của độ dài DNA

Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2 mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng

càng cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base

Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn

43CNSH

Trang 13

1.1.3Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch

)

+ Bắt cặp sai lệch ngoài quy tắc ( A=T, G=C) => Giảm tính ổn định của phân tử lai

+ Tm giảm 10ºC => 1% bắt cặp sai lệch

Trang 14

1.1.4 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

* Ảnh hưởng của nồng độ muối:

+ Sự giảm lực ion sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy

+ Dung dịch càng loãng càng làm mất tính ổn định của chuỗi xoắn kép DNA

* Ngoài ra còn các yếu tố như : nhiệt độ tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thường phản ứng lai đạt cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó 25%

43CNSH

Trang 16

2.1 Lai trong pha lỏng

Nguyên tắc:

+Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch

đệm

+Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển

động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ

43CNSH

Trang 17

2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế

- DNA hấp thụ ánh sáng yếu hơn DNA mạch đôi

- Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm

- Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển

thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là phản ứng siêu

sắc (hyperchromic effect).

Trang 18

2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế

Nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun nóng và làm lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm Đó là hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thụ tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi

43CNSH

Trang 19

2.1.2 Phương pháp sử dụng nuclease S1

- Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn

bất kể là DNA hy RNA trong một số điều kiện thực nghiệm

- Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần đem xử lý với

nuclease S1

- Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các NA còn lại tương ứng với

các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

Trang 20

2.1.3 Phương pháp sắc ký trên hydroxylapatite

• Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci

• Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết

• Sau khi bị đốt nóng chúng được làm lạnh để những mạch đơn

va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600

trong một dung dịch đệm Natri phosphat

• Ở nồng độ muối cao chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn được vào giá thể này, phần nucleic không gắn sẽ được thu nhận

43CNSH

Trang 21

2.2 Lai trên pha rắn

* Nguyên tắc:

- Giống với nguyên tắc lai trên pha lỏng

- Khác ở chỗ một trong 2 trình tự bổ sung được cố định trên một giá thể rắn

Trang 22

2.2.1 Phương pháp Southern blot

Nguyên tắc:

Màng lai nitrocelluse có khả nagw tiếp nhậ DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứ lai nucleic acid khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960.

Các bước tiến hành:

• Cắt DNA bằng enzyme giới hạn

• Điện di sản phẩm cắt trên gel

• Làm biến tính DNA

• Chuyển DNA lên màng lai

• Lai DNA đã được cố định với mẫu dò DNA có đánh dấu

• Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.

43CNSH

Trang 23

2.2.1 Phương pháp Southern blot

Trang 24

2.2.2 Phương pháp Nouthern blot

Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với cơ chất không màu Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm không màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp

43CNSH

Trang 25

2.2.2 Phương pháp Nouthern blot

Trang 26

2.2.3 Phương pháp Western blot

• Là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể để phát hiện protein điện di trên gel SDS-PAGE

và chuyển lên màng lai

• Phương pháp này cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân

tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau

* Các bước thực hiện:

• Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE

• Các pr được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel

• Ủ màng lai với một kháng thể sơ cấp

• Tiếp tục ủ màng lai trong hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme

• Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp

43CNSH

Trang 27

2.2.3 Phương pháp Western blot

Trang 28

2.2.4 Dot và slot blot

Mục đích:

Định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn

hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra Phương pháp này

có thể sử dụng cho RNA

Đặc điểm:

Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên

mà mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot hay 1 khe_Slot) Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai

43CNSH

Trang 30

*Nguyên tắc:

Nghiên cứu acid nucleic mà không cần giai đoạn tách chiết chúng

ra khỏi mô hay tế bào

43CNSH

Trang 31

- Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai.

- Màng lai sau đó sẽ được xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào

vi khuẩn và làm biến tính DNA

- Việc cố định trên màng lai và thao tác lai diễn biến theo các bước tương tự như ở các phương pháp lai trên pha rắn

- Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép các định dòng vi

Trang 32

3.2 Lai khuẩn lạc

43CNSH

Trang 33

• Các NST ở giai đoạn trung kỳ (các NST này thường có nguồn gốc

từ bạch cầu) được xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame

• NTS cố định trên lame được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ

• Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame 1 dịch huyền nhạy cảm với tia xạ Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên

Trang 34

3.3 Lai trên NTS

43CNSH

Trang 35

3.4 Lai trên tế bào và mô

*Mục đích:

Nghiên cứu chức năng và sự điều hòa biểu hiện của gen cũng như sự tương tác giữa mRNA với các thành phần khác nhau của tế bào và mô

Trang 36

43CNSH

Trang 37

Tài liệu tham khảo

1 Bài giảng CNSHĐV, TS Nguyễn Văn Duy, khoa CNSH &

CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2 “Công nghệ sinh học trên người và động vật”, (2007), Phan

Kim Ngọc, NXB Giáo dục

3 Bài giảng “ Công nghệ sinh học thú y”,GS.TS Nguyễn Quang

Tuyên, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Trang 38

Cảm ơn thầy giáo và các bạn đã

chú ý lắng nghe

43CNSH

Tiêu đề	Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật
Trường học	Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh Học – Công nghệ Thực Phẩm
Thể loại	Chuyên đề
Năm xuất bản	2014
Thành phố	Thái Nguyên

Định dạng
Số trang	39
Dung lượng	2,69 MB