Nguyên tắc và ứng dụng phân tích trình tự của nucleic acid

Nguyên tắc và ứng dụng phân tích trình tự của nucleic acid

GVHD: TS NGUYỄN VĂN DUY NHÓM : 8

LỚP: 52CNSH

GVHD: TS NGUYỄN VĂN DUY NHÓM : 8

LỚP: 52CNSH

TỔNG QUAN

NGUYÊN TẮC XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA

ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP

CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

A Khái niệm:

 Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự DNA

là quá trình xác định trật tự nucleotide của một đoạn DNA

 Trình tự của DNA mã hóa các thông tin cần thiết để

cho các cơ thể sống có thể tồn tại và tái sản sinh

 Giải mã trình tự các nucleotit có thể xem là việc đánh

dấu mẫu dò triệt để nhất của một hệ gen với tính chọn lọc cao

B Mục đích:

 Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trọng một đoạn DNA

Phân tích trình tự của các đơn vị mang thông tin di truyền

Lí giải tại sao và bằng cách nào mà các cơ thể tồn tại

Hiểu biết về trình tự DNA có thể trở nên hữu ích với các nghiên cứu sinh học và ứng dụng

So sánh giữa tương đồng gen giữa các loài và xác

định đột biến

 Là kĩ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide

hình thành nên phân tử DNA

 Các công trình đầu tiên về “DNA sequencing” được công bố bởi Maxam va Gilbert (1977), Sanger và cộng sự (1977)

 Cấu trúc của chuỗi DNA là một chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn liên kết với nhau bởi liên kết hidro Trên mỗi dãy có

một chuỗi các base, tập hợp của bốn nucleotide : A, T, C, G

 Kĩ thuật DNA sequencing sử dụng kĩ thuật điện di với gel loại polyacrylamide có độ phân giải cao

3 TYPE PHƯƠNG PHÁP ENZYME

PYROSEQUENCING PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

 Dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học

 Nguyên tắc của phương

pháp hoá học của Allan

Maxam và Walter Gilbert

là sử dụng phương pháp

đánh dấu phóng xạ (P32),

xử lí hoá học để phá huỷ 1 nucleotit tạo ra hàng loạt các đoạn ADN có kích

thước khác nhau

Đánh dấu phóng xạ (P32) ở đầu

5'

Sử dụng hoá chất phá huỷ một loại nucleotit nhất

định

điện di trên

gel poliacrylamid

DNA sợi kép

biến tính

thành dạng

sợi đơn

Hóa chất Base bị ảnh hưởng

 Nguyên tắc của phương pháp

này là sử dụng deoxynucleotit

không có nhóm OH ở vị trí 3'

do vậy trong quá trình kéo dài

chuỗi polinucleotit enzyme

polimerase gắn chúng vào chuỗi

polinucleotit thì quá trình tổng

hợp bị dừng lại Kết quả tạo ra

các đoạn DNA có kích thước

hơn kém nhau một nucleotit,

trên cơ sở đó xác định được

trình tự nucleotit

Frederick Sanger

Mồi tiếp hợp với DNA sợi

đơn.

Phản ứng tổng hợp chuỗi polinucleotit

điện di trên

gel poliacrylamid

DNA sợi kép

biến tính

thành dạng

sợi đơn

 Một hỗn hợp các

dNTPs trong đó có một loại dNTP

được đánh nhãn

phóng xạ hoặc được nhuộm màu huỳnh quang tùy theo từng lọ; ví dụ lọ 1 thì có dATP được đánh

nhãn phóng xạ, lọ 2 thì dCTP, lọ 3 dTTP

và lọ 4 là dGTP

 Mỗi loại ddNTP A, T, C, G được thêm vào mỗi

lọ thí nghiệm độc lập ở trên

 Tăng nhiệt độ trong lọ lên khoảng 92oC đến 96oC khi

đó chuỗi DNA sẽ tách ra thành 2 sợi đơn, một trong 2 sợi sẽ làm sợi khuôn(DNA template)

 Sau đó nhiệt độ trong lọ sẽ được hạ thấp xuống

khoảng 600C ,lúc này primer sẽ lại gắn vào DNA template tương ứng với nó và DNA polymerase III

sẽ xúc tác cho quá trình sao chép và quá trình tổng hợp bắt đầu

 Quá trình tổng hợp để tạo ra chuỗi DNA mới sẽ

diễn ra cho tới khi có một ddNTP tới bổ sung vào chuỗi mới thì phản ứng lúc này cũng dừng lại

 Tùy thuộc vào thời điểm ddNTP gắn vào mà đoạn DNA (DNA fragments) thu được sẽ có chiều dài ngắn khác nhau

 Trình tự của chuỗi DNA template có thể xác định

gián tiếp thông qua trình tự của chuỗi DNA mới tạo thành, dựa trên nguyên lí bổ sung cho nhau

 Nung nóng ở mỗi lọ để tách các DNA fragments mới ra khỏi DNA template

 DNA fragments sẽ được đưa riêng rẽ vào một môi

trường gọi là polyacrylamide gel để điện di

Xác định trình tự DNA template

ĐIỆN DI

VÀ ĐỌC KẾT QUẢ

 Dựa trên phương pháp Sanger

 Với kỹ thuật này thì primer hay các ddNTP được đánh dấu phóng xạ và các sản phẩm DNA được khuếch đại

tương tự như trong kỹ thuật PCR Chỉ cần một phản ứng

duy nhất và sản phẩm tạo ra là một dãy các phân tử

DNA mà phân tử này dài hơn phân tử kia một

nucleotide

Việc xác định trình tự Nucleotide đơn giản hơn

khi xử dụng các hệ thống tự động

 Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị

phóng xạ, thay vào đó là các hóa chất có khả

năng phát huỳnh quang (fluochrome)

 Mỗi loại Dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluochrome có màu khác nhau

 Tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại Dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu

 Điện di kết quả được đọc nhờ hệ thống vi tính

 Một hướng đọc trình tự tự động khác là các mẫu

DNA được điện di trong các ống thuỷ tinh rất nhỏ được gọi là các ống mao dẫn (capillary)

 Vì những ống này rất mỏng và lượng nhiệt tỏa ra

trong quá trình điện di rất ít nên việc đọc trình tự

diễn ra rất nhanh, kỹ thuật này cho phép đọc trình tự của 600 bp của 96 mẫu chỉ trong vòng 15 phút

 Ngoài ra một kỹ

thuật mới là sử

dụng sắc ký khối phổ (mass

spectroscopy), đây

là một kỹ thuât có

độ phân giải cao trước đây dùng để phân tích protein

 Sự phát triển của kỹ

thuật MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionizatio

n time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA

trong vài phút Hiện nay đây là kỹ thuật thu hút nhiều sự chú ý

 Sáng tạo đầu tiên bởi Pal Nyrén và Mostafa

Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996

 Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp”

dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng ddNTP

 Kỹ thuật này có tính nhạy cao hơn hẳn so với phương pháp giải trình tự truyền thống với độ chính xác là 99,9% với các đoạn 200 bp và 99% với các đoạn 400 bp

 Đầu tiên DNA được cắt thành các đoạn đầu bằng

(blunt end), và được gắn các oligonucleotide

adaptor vào cả hai đầu Từng đoạn này sau đó gắn với một hạt thủy tinh, và sẽ được khuếch đại bằng PCR trong các giọt nhũ dầu-nước, tạo ra nhiều

bản sao đoạn DNA trên mỗi hạt thủy tinh Sau đó các hạt thủy tinh được giữ trong các tấm picotiter trên một cơ chất dạng sợi, và giải trình tự

 Sợi khuôn DNA đơn sau khi

PCR, được lai với một

primer giải trình tự và sau đó được ủ với các enzyme DNA polymerase, ATP

 Khi dNTP đầu tiên được bắt cặp

bổ sung, nó được gắn với sợi DNA khuôn nhờ DNA polymerase và

kèm theo sẽ giải phóng một PPi PPi được biến đổi thành ATP nhờ enzyme ATP sulfyrelase cùng với

sự tham gia của APS, sau đó một phản ứng được xúc tác bởi

licuferase sẽ biến đồi luciferin

thành oxyluciferin - tạo ra ánh

sánh nhìn thấy, có độ sáng tương ứng với lượng ATP tạo thành Ánh sáng này được nhận viết bởi một camera và phân tích bởi một

chương trình phần mềm

 Ưu điểm của kỹ thuật pyrosequencing là tính linh hoạt

cao khi kết cặp primer, phân tích được nhiều đột biến,

dữ liệu và thông tin trình tự tập hợp được đầy đủ

 Hệ thống giải trình tự được 400-600 triệu bp trong 10

giờ vì vậy giá thành thấp hơn khi giải trình tự lượng lớn DNA với thời gian nhất định so với khi sử dụng phương pháp Sanger – mất nhiều ngày để giải trình tự một

lượng DNA tương đương

 Các sợi khuôn đem giải trình tự có thể được

chuẩn bị bằng cả hai phương pháp là: chuẩn bị sợi khuôn pha rắn – solid phase template

preparation (streptavidin-coated magnetic bead, hạt thủy tinh từ tính có bọc streptavidin) và

chuẩn bị sợi khuôn mang enzyme – enzymatic template preparation (apyrase và exonuclease)

 Phát hiện đột biến

 Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử

 Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

 Chọn giống vật nuôi, cây trồng

 Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn

 Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân tử

Y học – Khoa học hình sự.

 Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus

 Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền

 Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

 Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…

Việt nam hiện tại có hơn 300.000 liệt sỹ vô danh

Việc trả lại tên cho các liệt vô danh và đưa các liệt

sỹ về với gia đình, người thân của mình là công việc được toàn xã hội đặc biệt quan tâm

 Ty thể là một bào quan quan trọng của tế bào, nằm trong nguyên sinh chất của tế bào.

 Trình tự DNA của gen ty thể thường ổn định qua một thời gian dài trong lịch sử tiến hoá và sự khác biệt trình tự của gen ty thể giữa các thành viên có quan hệ di truyền theo dòng mẹ là rất hiếm.

 Ở người DNA ty thể có 16569 cặp bazơ (nucleotide) trong đó có chứa tổng cộng 37 gen mã hoá các sản phẩm, ngoài ra còn có vùng không mã hoá gọi là vùng kiểm soát hay vùng D-Loop có chứa

nhiều đặc điểm cấu trúc DNA đặc trưng cho cá thể và vì vậy nó được sử dụng cho mục đích giám định hình sự truy nguyên nguồn gốc cá thể và xác định mối quan hệ huyết thống theo dòng mẹ.

Sơ đồ 1: Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ DNA ty thể inheritance (maternal)

• Lấy một lượng nhỏ xương hài cốt để tách chiết

DNA ty thể Phòng thí nghiệm để tách DNA ty thể phải có môi trường rất sạch vì DNA ty thể có khả năng nhiễm cao

• Sau khi tách đươc DNA ty thể từ hài cốt chúng ta tiến hành nhân bội DNA vùng D-loop bằng máy PCR để thu được một lượng lớn DNA ty thể phục vụ cho việc giải trình tự.

• Giải trình tự DNA vùng D-loop.

Sau khi giải được trình tự DNA ty thể của các mẫu cần giám định, các trình tự này được so sánh với nhau bằng phần mềm SeqScape2.5, sự so sánh này đều thông qua trình tự chuẩn Anderson để tìm ra mối quan hệ huyết thống giữa chúng với nhau

1 http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1977_Gilbert.php

2 http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing

3 http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Obenr ader/sanger_method_page.htm

4 http://baigiang.violet.vn/present/same/entry_id/4791342

5 Phương pháp xác định trình tự DNA của PGS.TS NÔNG VĂN HẢI ( Viện công nghệ sinh học ).

6 Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương

7 Một số tài liệu trên internet