Microsoft Word - Môc lôc.docx

Microsoft Word Môc lôc docx Y häc thùc hµnh (787) – sè 10/2011 65 PH¸T HIÖN VI RóT DENGUE Vµ VI RóT CHIKUNGUNYA TR£N BÖNH NH¢N SèT XUÊT HUYÕT B»NG PCR §A MåI VŨ XUÂN NGHĨA1,2; NGUYỄN ĐÌNH ỨNG1; NGUYỄN[.]

Y häc thùc hµnh (787) – sè 10/2011 65

PH¸T HIÖN VI RóT DENGUE Vµ VI RóT CHIKUNGUNYA TR£N BÖNH NH¢N SèT XUÊT HUYÕT B»NG PCR §A MåI

VŨ XUÂN NGHĨA 1,2 ; NGUYỄN ĐÌNH ỨNG 1 ; NGUYỄN THU THỦY 1 ; NGUYỄN TRỌNG VIỄN 1,2

1

TT nghiên cứu ứng dụng Y Sinh Dược học - Học viện Quân y

2

Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus Dengue (DENV) thuộc họ Flavivirus và có 4

serotype Nhiễm DENV, đặc biệt là những trường hợp

có sự kết hợp giữa các serotype DENV, có thể gây

nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, thay đổi từ nhiễm

trùng không triệu chứng đến bệnh sốt cấp tính (sốt

Dengue) Sốt xuất huyết Dengue (SXH-D) và hội chứng

sốc Dengue có thể gây tử vong Virus Chinkungunya

(CHIKV) thuộc nhóm Alphavirus, họ Togaviridae Cả hai

loại virus đều gây bệnh thông qua vector là muỗi Các

vector chính của CHIKV/DENV là Aedes aegypti và

Aedes albopictus Thời gian gần đây, CHIKV đã nổi lên

như là nguyên nhân chính gây sốt xuất huyết tại Đông

Nam Á và khu vực Thái Bình Dương Bệnh cảnh lâm

sàng do CHIKV gây ra nguy hiểm không kém so với

DENV Ở Việt Nam, theo số liệu của Cục y tế dự phòng

và môi trường – Bộ Y tế, những tháng cuối năm 2009 số

ca mắc SXH tại Hà Nội – một địa phương trong 10 năm

qua số ca mắc bệnh này luôn ở mức rất thấp đã tăng gấp

14 lần so với cùng kỳ năm 2008 Trong số những ca

được chẩn đoán SXH có tới 50% được xác định là do

nhiễm DENV Những khu vực phân lập được CHIKV đều

là những khu vực có dịch SXH Dengue đang lưu hành

Bởi vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi ứng dụng

phương pháp PCR đa mồi phát hiện đồng thời DENV và

CHIKV Kết quả này góp phần vào điều trị và dự phòng

bệnh sốt xuất huyết do DENV và CHIKV gây ra

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Bệnh nhân nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng huyết tương (n=50) của bệnh

nhân ở giai đoạn cấp trong vụ dịch sốt xuất huyết 2009 từ

viện quân y 103 và trạm xá xã Tản Lĩnh, Thanh Trì Hà

Nội Bệnh nhân nhập viện và các trung tâm y tế với biểu

hiện sốt cao, phát ban và xuất huyết Nhiều bệnh nhân có

biểu hiện đau sưng khớp Nhóm người khỏe mạnh (n=10)

được sử dụng như chứng âm trong nghiên cứu

2 Chứng dương

Chứng dương của CHIKV là một plasmid bao gồm

toàn bộ đoạn gene mã hóa cho protein màng E1 được

clone vào vector pGOV4 Đây là plasmid nhận được từ

Malaysia theo chương trình hợp tác nghiên cứu Chứng

dương của DEN được thiết kế tại trung tâm Y Sinh

Dược học Học viện Quân y Nó cấu trúc gồm đoạn gene

đặc hiệu của DEN được clone vào vector pGOV4 bằng

cặp mồi DEN1, DEN2

3 Thiết kế mồi cho PCR đa mồi

Các primers đặc hiệu cho CHIKV và DEN được thiết

kế và lựa chọn dựa trên những công bố trước đây

Những primer này cũng được đánh giá cho chuẩn hóa

với qui trình chuẩn của Onestep RT-PCR và đảm bảo

tính đặc hiệu và nhạy cặp mồi của CHIKV là E1F

=5’-ACCGGCGTCTACCCATT-3’ và E1R=5’-

AGGGCGGGTAGTCCATG-3’, dựa trên CHIKV (S27

strain) (GenBank accession no AF490259) Cặp mồi của DEN là DEN1-(5'-TCAATATGCTGAAACGCGC-3’

và DEN2- (5'-TGCACCAACAGTCAATGT-3') theo trình

tự của DEN type II đã công bố

4.Tách chiết RNA của virus

RNA của virus được tách từ 150µl plasma bằng Qiagen RNA Blood mini kit theo qui trình chuẩn (Qiagen, Germany) và cất giữ ở -800C đến khi sử dụng

5 Chuẩn hóa qui trình Onestep RT-PCR đa mồi

Qui trình được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kít nhưng có thay đổi để tối ưu hóa phương pháp Thành phần tham gia phản ứng: 5x Qiagen Onestep RT-PCR buffer, dNTP 10mM, cặp mồi phát hiện CHIKV và DEN 20pmol, enzyme Mix 2,5 đơn vị, RNA của virus và nước cất vừa đủ 50µl Chu trình nhiệt được thực hiện theo 45

°C trong 45 phút Tiếp đến là 95 °C trong 2 phút và 40 vòng của các giai đoạn: duỗi xoắn ở 94 °C trong 30 s, bám mồi 55 °C trong 1 phút, kéo dài 72 °C trong 1 phút Cuối cùng là giai đoạn kéo dài 72 °C trong 10 phút Sản phẩm PCR được chạy trên Agarose Gel 1,2% ở 100v và được chụp trên hệ thống máy đọc gel

KẾT QUẢ

1 Chuẩn hóa Onestep RT-PCR đa mồi

Phương pháp Onestep RT-PCR đa mồi được chuẩn hóa với chứng dương và kết quả PCR của CHIKV và DEN chạy trên agarose gel 1,2% với 100v đạt 331 bp

và 511 bp riêng biệt

(1)

(2) Hình 1: Chuẩn hóa qui trình chạy Onestep RT-PCR

đa mồi CHIKV (1), DEN (2) M: marker DNA 50bp; P+: chứng dương Lane 1: chứng âm;

2 Phát hiện DENV và CHIKV bằng Onestep RT-PCR đa mồi

Phương pháp Onestep RT-PCR đa mồi được sử dụng phát hiện nhanh, chính xác RNA của CHIKV và DENV trong mẫu nghiên cứu Trong 50 mẫu nghiên cứu

Y học thực hành (787) – số 10/2011

66

cho thấy số mẫu nhiễm DENV 20/50 (40%), CHIKV 4/50

(8%) và đồng nhiễm DENV/CHIKV 3/50 (6%) Hỡnh ảnh

đồng nhiễm (mẫu 4,5,6) hiện rừ 2 vạch band cú độ lớn là

331 bp và 511bp (Hỡnh 2)

Hỡnh 2: Kết quả chạy RT-PCR trờn 3 bệnh nhõn

đồng nhiễm DENV và CHIKV

(M) Thang chuẩn; (1) chứng õm; (2) chứng dương

DENV; (3) chứng dương CHIKV; (4,5,6) Bệnh nhõn

đồng nhiễm DENV/CHIKV

BÀN LUẬN

Phương phỏp Onestep RT-PCR đa mồi được sử

dụng trong nghiờn cứu này cho phộp kỹ thuật thực hiện

được nhanh hơn, thuận lợi hơn và giảm thiểu tối đa khả

năng lõy nhiễm Hơn nữa, sử dụng Onestep RT-PCR đa

mồi trong phỏt hiện sớm virus CHIKV và DENV ở nhúm

bệnh nhõn cú nguy cơ cao nhiễm hai loại virus này mở

ra hướng đi mới trong cụng tỏc phũng và chống bệnh

sốt xuất huyết ở nước ta Kết quả cho thấy, trong 50

mẫu bệnh phẩm, tỉ lệ nhiễm CHIKV là 4/50 chiếm 8%,

nhiễm DENV 20/50 chiếm 40% và đồng nhiễm là 3/50

chiếm 6% Tỉ lệ nhiễm CHIKV và đồng nhiễm

CHIKV/DENV trong vụ dịch khụng phải là cao khi so với

một số khu vực trờn thế giới như ở Gabon, trong số 773

bệnh nhõn sốt xuất huyết thỡ cú đến 275 dương tớnh với

CHIKV và 54 với DENV nhưng khụng cú ca nào đồng

nhiễm DENV và CHIKV Với kết quả ban đầu này cho

thấy những vụ dịch sốt xuất huyết khụng chỉ do DEN

gõy ra mà chớnh sự thay đổi về tớch chất, cường độ của

dịch phản ỏnh vai trũ CHIKV trong cỏc vụ dịch

KẾT LUẬN

Phương phỏp sinh học phõn tử Onestep RT-PCR đa

mồi được thực hiện trong nghiờn cứu này sẽ là một

phương phỏp cực kỳ hữu dụng sử dụng trong phỏt hiện

sớm và nhanh CHIKV, DENV Bởi vậy, nú cú thể được

sử dụng rộng rói trong chẩn đoỏn thường quy ở những

khu vực cú dịch, cú virus lưu hành và khụng cú dịch

Mặc dự tỉ lệ phỏt hiện CHIKV, DENV và đồng nhiễm

CHIKV/DENV trong nhúm bệnh nhõn sốt xuất huyết khụng cao (4/50; 20/50; 3/50) nhưng cho thấy lưu hành đồng thời cả CHIKV và DENV trong cỏc khu vực cú tỉ lệ bệnh nhõn xuất huyết cao

DETECTION OF DENGUE FEVER AND CHIKUNGUNYA VIRUS ON HEMORRAGIC FEVER PATIENTS BY MULTI-PCR

Both of Chikungunya virus (CHIKV) and Dengue fever virus (DENV) are of considerable public health concern in Southeast Asian and African countries Despite of serological evidence, the diagnosis of this arthropod-borne human disease is confirmed infrequently and needs to be improved In fact, illness caused by CHIKV or DENV can be confused with each other, based on the similarity of the symptoms, and laboratory confirmation of suspected cases is required to launch control measures during an epidemic Moreover,

no sensitive and early tool is described to detect CHIKV/DENV in clinical samples In this study, a specific and sensitive multi-RT-PCR assay was used as a tool to detect CHIKV/DENV Results showed that 4 cases were positive with CHIKV, 20 cases were positive with DENV and 3 cases were co-infection with CHIKV/DENV in 50 suspected clinical samples

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bodenmann P, Genton B Chikungunya, an epidemic in real time Lancet 2006, Vol 368, p.258

2 Harendra S Chahar, Preeti Bharaj, Lalit Dar, Randeep Guleria, Sushil K Kabra, and Shobha Broor Co-infections with Chikungunya Virus and Dengue Virus

in Delhi, India, Emerg Infect Dis 2009, 15(7),

pp.1077-1080

3 Carey, D E Chikungunya and dengue, a case of mistaken identity? J Hist Med Allied Sci 1971, Vol 26, pp.243-262

4 Charrel RN, de Lamballerie X, Raoult D Chikungunya outbreaks-the globalization of vectorborne diseases N Engl J Med 2007, Vol 356, pp.769-771

5 Kowalzik S, Xuan NV, Weissbrich B, Scheiner B, Schied T, Drosten C, Mỹller A, Stich A, Rethwilm A, Bodem J.Characterization of a chikungunya virus from a German patient returning from Mauritius and development of a serological test Med Microbiol Immunol.2008, 197 (4), pp.381-386

6 Robinson MC An epidemic of virus disease in southern province, Tanganyka Territory, in 1952-1953.Trans R Soc Trop Med Hyg.1955, 49, pp.28-32

Một số yếu tố tiên lượng sốc ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue

điều trị tại khoa Truyền nhiễm Bệnh viện 103 năm 2009

Đỗ Tuấn Anh

Bộ môn Khoa truyền nhiễm viện 103-HVQY

Tóm tắt

Nghiên cứu 258 bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue

(SXHD) có sốc và không sốc được điều trị tại khoa

Truyền nhiễm Bệnh viện 103 năm 2009, chúng tôi rút

ra một số yếu tố tiên lượng sốc sau:

Ngoài 5 dấu hiệu TCYTTG (1986) đưa ra (Vật v∙ hoặc li bì, đau bụng tăng lên, lạnh đầu chi, da xung huyết, đái ít) thì các dấu hiệu: hạ sốt đột ngột, gan to, nôn nhiều, tràn dịch màng ngoài tim, tràn dịch màng phổi, tràn dịch màng bụng, xuất huyết nội tạng đều là