Khảo sát tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus và định typ trong mẫu nước bọt thanh niên 18-25 tuổi

Bài viết Khảo sát tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus và định typ trong mẫu nước bọt thanh niên 18-25 tuổi trình bày chuẩn hóa quy trình xác định typ EBV trong mẫu nước bọt; Khảo tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng chủng EBV ở thanh niên từ 18-25 tuổi.

6 Chronopoulou E, Harper JC., "IVF culture

media: past, present and future.," Hum

Reprod Update: 21:39-55 Vol 21, No.1,

https://doi.org/10.1093/humupd/dmu040

7 Morbeck DE, Krisher RL, Herrick JR,

Baumann NA, Matern D, Moyer T ,

"Composition of commercial media used for

human embryo culture.," Fertil Steril

Vol.102, No.3, 2014 pp 759–766.e9

https://doi.org/110.1016/j.fertnstert.2014.05.0

43., 2014

8 Leese HJ, Whitear SL., " Female tract

environment and its relationship to ART

media composition In: Quinn P, editor

Culture media, solutions and systems in

human ART," Cambridge: Cambridge University Press; 2014 p 21–9

9 Cimadomo D, Scarica C, Maggiulli R, Orlando G, Soscia D, Albricci L, et al , "

Continuous embryo culture elicits higher blastulation but similar cumulative delivery rates than sequential: a large prospective study.," J Assist Reprod Genet, vol 35, no.7,

https://doi.org/10.1007/s10815-018-1195-4

10 Piko L and Taylor K.D, "Amounts of

mitochondrial DNA abundance of mitochondrial gene transcripts in early mouse embryos," Developmental Biology, vol 123, no.2, 1987, pp 364-374 https:// doi.org/10.1016/0012-1606(87)90395-2

KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ ĐỊNH TYP

TRONG MẪU NƯỚC BỌT THANH NIÊN 18-25 TUỔI

Đặng Thị Hồng 1 , Trần Văn Khoa 1 , Lê Thị Kim Dung 1 , Nguyễn Văn Phong 1 , Phạm Trường Giang 1 , Trần Khánh Linh 2

TÓM TẮT 30

Epstein-Barr Virus (EBV) là virus thuộc

nhóm Human Herpes virus 4, lây nhiễm nhiễm

phổ biến trong các cộng đồng trên toàn cầu EBV

là yếu tố tham gia vào cơ chế tiến triển của một

số bệnh ở vật chủ như bệnh tăng bạch cầu đơn

1

Học viện quân y

2 Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia

Hà Nội

Chịu trách nhiệm chính: Đặng Thị Hồng,

Trần Văn Khoa

Email: tvkhoabio@gmail.com

Ngày nhận bài: 26/7/2022

Ngày phản biện khoa học: 10/08/2022

Ngày duyệt bài: 29/08/2022

nhân nhiễm khuẩn, u lympho Burkitt, ung thư biểu mô vòm họng (UTVH) Việc định typ EBV có vai trò quan trọng trong nghiên cứu và

đi sâu tìm hiểu cơ chế tiến triển của các loại ung thư Ngoài ra, xác định tỷ lệ nhiễm từng typ trong quần thể và trong từng loại ung thư còn là

cơ sở khoa học để thiết kế vaccin phòng EBV

Mục tiêu: i) Chuẩn hóa quy trình xác định typ

EBV trong mẫu nước bọt; ii) Khảo tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng chủng EBV ở thanh niên từ

18-25 tuổi Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mẫu nước bọt của 131 thanh niên khoẻ

mạnh (91 nam và 50 nữ) lứa tuổi từ 18-25 tuổi được tách chiết DNA và xác định nhiễm EBV,

định typ EBV bằng Nested-PCR Kết quả: 1, Đã

chuẩn hoá và hoàn thiện quy trình xác định typ

EBV trong mẫu nước bọt của thanh niên bằng kỹ

thuật Nested-PCR; 2, Mẫu nước bọt thanh niên

khoẻ mạnh (18-25 tuổi) có tỷ lệ nhiễm EBV là

50,38% trong đó: tỷ lệ nhiễm EBV typ 1 là

36,64%; tỷ lệ nhiễm EBV typ 2 là 7,63% và tỷ lệ

đồng nhiễm cả 2 typ là 6,87%; 3, Không có sự

khác biệt lớn về tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng

chủng nhiễm trong mẫu nước bọt giữa hai giới

tính ở thanh niên khoẻ mạnh (18-25 tuổi)

Từ khoá: EBV, typing

SUMMARY

SURVEY ON EPSTEIN –BARR VIRUS

INFECTION RATES AND TYPOLOGY

IN SALIVA SAMPLES OF

18-25 YEAR OLDS

Epstein-Barr Virus (EBV) is a member of the

Human Herpes virus group 4, infecting

communities around the world EBV is a factor

involved in the progression mechanism of a

number of host diseases such as infectious

mononucleosis, Burkitt lymphoma,

nasopharyngeal carcinoma (UCVH), etc EBV

typing plays an important role in the research and

in-depth understanding of the mechanism of

cancer progression In addition, determining the

infection rate for each type in the population and

in each type of cancer is also a scientific basis for

designing EBV vaccines Objectives: i)

Standardize the procedure for determining EBV

type in saliva samples; ii) To study the

prevalence of EBV infection and the rate of each

strain of EBV in young people aged 18-25 years

old Subjects and methods: Saliva samples of

131 healthy young men (91 men and 50 women)

aged 18-25 years old were extracted DNA and

determined for EBV infection, EBV type

determination by Nested-PCR Results: 1,

Standardized the process of determining EBV

type in saliva samples of young people by

Nested-PCR technique; 2, The saliva sample of

healthy young adults (18-25 years old) had an

EBV infection rate of 50.38%, of which: EBV type 1 infection rate was 36.64%; the rate of EBV type 2 infection was 7.63% and the rate of co-infection with both types was 6.87%; 3, There were no major differences in the prevalence of EBV infection and the prevalence of each strain

in saliva samples between the sexes in healthy young adults (18-25 years of age)

Key words: EBV, typing

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Epstein-Barr Virus (EBV) được phát hiện lần đầu vào năm 1964 bởi Epstein và cộng

sự, là virus thuộc nhóm Human Herpes virus

4, lây nhiễm nhiễm phổ biến trong các cộng đồng trên toàn cầu Số liệu được CDC Hoa

Kỳ ước tính, có đến 90% người trưởng thành

có bằng chứng từng nhiễm EBV trước đó [1] Tính lây nhiễm phổ biến của EBV bắt nguồn từ đặc điểm lây truyền dễ dàng qua đường miệng, thông thường nhất bởi nước bọt từ những cá thể nhiễm EBV; ngoài ra ghép tạng và truyền máu cũng là đường lây truyền bệnh [2-3] Virus gây sơ nhiễm và tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh cho vật chủ Tuy nhiên trong một số trường hợp, EBV lại là yếu tố tham gia vào cơ chế tiến triển của một số bệnh ở vật chủ như bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn, tăng sinh lympho B hay u lympho Burkitt, bệnh Hodgkin, một số dạng T-lymphoma, ung thư biểu mô vòm họng (UTVH)… Chúng được cho là nguyên nhân của khoảng 200,000 ca mắc ung thư mỗi năm trên toàn cầu [4-5]

Hệ gen EBV có cấu trúc DNA sợi đôi, dài khoảng 184kps mã hóa cho hơn 85 gen trong

đó có ba họ gen đóng vai trò quan trọng: EBNAs (EBV nuclear antigens), LMPs (Latent membrane proteins) và EBERs

(Non-coding nuclear RNAs) [6] Dựa vào khác biệt

trình tự kháng nguyên do một số gen mã hoá

(EBNA2-A và EBNA2-B hoặc EBNA3-A,

EBNA3-B và EBNA3-C), EBV được chia

làm 2 typ: EBV typ 1 (typ A) và EBV typ 2

(typ B) Hai typ này khác nhau về khả năng

biến đổi và khả năng tái hoạt trong vật chủ

Việc định typ EBV có vai trò quan trọng

trong nghiên cứu và đi sâu tìm hiểu cơ chế

tiến triển của các loại ung thư Ngoài ra, xác

định tỷ lệ nhiễm từng typ trong quần thể và

trong từng loại ung thư còn là cơ sở khoa học

để thiết kế vaccin phòng EBV Tại Việt

Nam, các nghiên cứu tập chung chủ yếu về

mối liên quan giữa EBV và các giá trị

marker của nó trong các loại ung thư Chưa

thực sự có một nghiên cứu nào bài bản với

cỡ mẫu lớn được thực hiện trên thanh niên để

xác định tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng typ

Chính vì vậy, xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn

mang lại và mong muốn góp phần bổ sung

vào bản đồ thế giới về tỷ lệ nhiễm EBV,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định tỷ lệ

nhiễm Epstein-Barr Virus và định typ trong

mẫu nước bọt ở thanh niên độ tuổi 18-25”

với hai mục tiêu:

1 Chuẩn hóa quy trình xác định typ EBV

trong mẫu nước bọt của thanh niên

2 Khảo sát tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng

chủng EBV ở thanh niên khoẻ mạnh độ tuổi

18-25

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nước bọt của 131 người khoẻ mạnh (91 nam và 50 nữ) lứa tuổi từ 18-25 tuổi

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Kỹ thuật tách chiết và bảo quản DNA từ mẫu nước bọt

Mẫu nước bọt thu được từ các đối tượng được bảo quản trong các ống falcon chứa 5ml dung dịch bảo quản trước khi tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit QIAamp DNA mini Kit (Đức) Quy trình tách chiết được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Dung dịch SDS và proteinase K sử dụng để phá vỡ nhân tế bào niêm mạc miệng và phân hủy protein DNA được phân tách theo phương pháp cột silica Nồng độ DNA và độ tinh sạch từ các mẫu bệnh phẩm sau tách chiết được xác định bằng máy đo SpectraMax QuickDrop, đảm bảo lượng DNA tổng số trong khoảng 10-20 pg, độ tinh sạch A260/280 từ 1,8-2,2 Các mẫu không đảm bảo tiêu chuẩn được tiến hành tinh sạch lại cho đến khi đạt yêu cầu, sau đó được bảo quản ở -20°C trước khi tiến hành PCR và giải trình tự gen

2.2 Phản ứng Nested-PCR định typ EBV

Các cặp mồi được nhóm nghiên cứu lựa chọn và kiểm tra để khuếch đại đoạn gen EBNA2-A và EBNA2-B bằng cách sử dụng phần mềm Primer-BLAST

Bảng 1: Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen EBNA2-A và EBNA2-B

Tất cả các mồi sử dụng trong phản ứng

đều có nhiệt độ nóng chảy xấp xỉ trong

khoảng 52ºC -58.5ºC, trong đó EBNA-2F và

EBNA-2I khuếch đại cho đoạn gen vòng

ngoài (801bp); cặp mồi EBNA-2C và

EBNA-2G khuếch đại đoạn gen

EBNA2-A(250bp); EBNA-2C và EBNA-2B cho đoạn gen EBNA2-B với kích thước 300bp

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng sử dụng trong phản ứng cặp mồi globin F và β-globin R khuếch đại đoạn gen beta-β-globin (119bp), như chứng nội nhằm mục đích kiểm tra chất lượng mẫu ADN tách chiết

Bảng 2: Trình tự mồi khuếch đại đoạn đoạn gen beta-globin

Sau khi chạy phản ứng Nested-PCR, sản

phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng phương

pháp điện di trên gel agarose 3%, qua đó

mẫu sẽ được xác định dương tính với EBV

hay không và loại typ EBV tương ứng

2.3 Giải trình tự Sanger

Các đoạn gen EBNA2-A và EBNA2-B đã

được khuếch đại ở trên được sử dụng để giải

trình tự trên máy SeqStudio bằng bộ kit

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing

của hãng Thermo Fisher Scientific

Thành phần của mỗi phản ứng Sanger

gồm 3.2 pM mồi xuôi hoặc mồi ngược; 50ng

DNA, 1 μl BigDye, 2 μl Buffer và nước

tương ứng trong tổng thể tích 10 μl với chu

trình nhiệt như sau: 96°C - 1 phút; 25 chu kỳ

(96°C - 10 giây, 50°C - 5 phút, 60°C - 4

phút); giữ ở 4°C Sản phẩm được tinh sạch

bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA DNA

thu được đem đi điện di mao quản Trình tự

nucleotid của mỗi đoạn gen được xác định cả

2 chiều (xuôi và ngược) bằng phần mềm

Bioedit Sequence Alignment Editor Các

mẫu được xác định dương tính và định typ

được sử dụng làm chứng dương

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Kết quả chuẩn hoá quy trình phản

ứng Nested-PCR định typ EBV

Phản ứng Nested-PCR được tiến hành 2

vòng:

- Vòng 1: mỗi ống phản ứng có thể tích

12.5 μl trong đó chứa 6.25 μl GoTaq Green Mastermix 2X (Lot.No 0000440041; HSD: 05/2023); 1.75 μl nước; 0.5 μl mỗi mồi EBNA-2F, EBNA-2I, β-globin F và β-globin R; 2.5 μl DNA template

Dựa vào nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi, phản ứng PCR được thực hiện với dải gradient nhiệt độ gắn mồi từ 50-60℃ và dựa vào kết quả phản ứng này, nghiên cứu lựa chọn được 52℃ làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất Phản ứng này được lặp đi lặp lại 3 lần

và kết quả các lần thực hiện là đồng nhất Chu trình nhiệt đã thực hiện với phản ứng vòng 1:

kỳ

25

- Vòng 2: mỗi ống phản ứng có thể tích

12.5 μl gồm 6.25 μl GoTaq Green Mastermix 2X; 4.25 μl nước; 0.5 μl mỗi mồi EBNA-2C, EBNA-2G, EBNA-2B; 1.0 μl sản phẩm PCR vòng 1

Tương tự như phản ứng PCR vòng 1, dựa

trên nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi,

phản ứng PCR vòng 2 cũng được thực hiện

với dải gradient nhiệt độ gắn mồi từ 50-60℃

và dựa vào kết quả, nghiên cứu lựa chọn

được 52℃ làm nhiệt độ gắn mồi tối ưu nhất

Chu trình nhiệt vòng 2:

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

35

Sau phản ứng Nested-PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 3%, trên các mẫu xuất hiện băng 250bp và 300bp (tương ứng với kích thước đoạn gen EBNA2-A và EBNA2-B mà nhóm nghiên cứu đã thiết kế) Ngoài ra, các mẫu đều xuất hiện băng 119bp (tương ứng kích thước đoạn gen β-globin đã thiết kế), chứng tỏ quy trình tách chiết DNA được thực hiện đảm bảo chất lượng, tránh hiện tượng âm tính giả

2 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm EBV và định typ trên các nhóm đối tượng

Kết quả xác định mẫu mắc EBV và định typ trên nhóm nam giới khoẻ mạnh:

Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm Nested-PCR trên gel agarose 3% của các đối tượng

thuộc nhóm nam giới khoẻ mạnh

- : Chứng âm + : Chứng dương

1-91: Các mẫu nhóm nam giới đã được đánh số từ 1 đến 91

Kết quả xác định mẫu mắc EBV và định typ trên nhóm nữ giới khoẻ mạnh:

Hình 2: Kết quả điện di sản phẩm Nested-PCR trên gel agarose 3%

của các đối tượng thuộc nhóm nữ giới khoẻ mạnh

- : Chứng âm + : Chứng dương

1-50: Các mẫu nhóm nữ giới đã được đánh số từ 1 đến 50

Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm EBV và tỷ lệ từng typ trong mẫu nước bọt nhóm khoẻ mạnh

Nhóm đối

Nam giới khoẻ

mạnh

100%

(91)

46,15%

(42)

35,16%

(32)

6,59%

(6)

4,39% (4)

Nữ giới

khoẻ mạnh

100%

(50)

48%

(24)

32%

(16)

8%

(4)

10% (5) Nhóm người

khoẻ mạnh

100%

(131)

50,38%

(66)

36,64%

(48)

7,63%

(10)

6,87% (9)

IV BÀN LUẬN

Sau khi xây dựng quy trình Nested-PCR,

nhóm nghiên cứu tiến hành chạy trên các

mẫu nghiên cứu Kết quả kiểm tra sản phẩm

Nested-PCR bằng điện di agarose 3% cho

thấy chúng tôi đã khuếch đại được các đoạn

gen có kích thước như đã thiết kế (250bp và

300bp) Để xác định các sản phẩm có kích

thước 250bp và 300bp là các đoạn gen EBNA2-A (typ 1) và EBNA2-B (typ 2) đã được khuếch đại, nhóm nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự trên một số mẫu đại diện Các băng sản phẩm Nested-PCR sau khi được kiểm tra bằng điện di sẽ được đem giải trình tự theo nguyên lý Sanger để so sánh

Hình 3: Kết quả giải trình tự Sanger sản phẩm khuếch đại gen EBNA2-B:

(A): Mồi EBNA2-C; (B): Mồi EBNA2-B

Kết quả giải trình tự cho thấy các peak

của sản phẩm đều rõ ràng, trừ một số

nucleotide tại phần đầu của trình tự do vị trí

mồi bắt cặp gây tín hiệu không rõ ràng Các

trình tự nucleotid vùng này sẽ được hiệu

chỉnh bằng các trình tự bắt cặp bổ sung

tương ứng trên đoạn nucleotid đã được giải

trình tự bằng mồi ngược lại Đoạn trình tự

sau hoàn thiện được kiểm tra mức độ tương

đồng bằng chương trình BLAST Kết quả,

trình tự thu nhận được có độ tương đồng cao

với trình tự gen EBNA2-A và EBNA2-B của

human herpes virus 4 (HQ827839) Như vậy,

quy trình phản ứng Nested-PCR định typ

EBV đã được nhóm nghiên cứu chuẩn hoá

và hoàn thiện thành công

Tỷ lệ nhiễm EBV trong quần thể trên thế

giới là khoảng 97% (theo De The G và cộng

sự) Tại Đài Loan – một nước khá gần gũi về

vị trí địa lý và văn hoá, tỷ lệ lây nhiễm EBV

là 100%[7] Tại Việt Nam, xác định tỷ lệ

nhiễm EBV bằng kỹ thuật huyết thanh học

cho kết quả là 95,7% [8] Trong nghiên cứu

của chúng tôi, thông qua mẫu nước bọt, tỷ lệ

nhiễm EBV chỉ 50,38% Sự khác biệt này là

do phương pháp phát hiện EBV bằng

Nested-PCR trên mẫu nước bọt chỉ phát hiện

sự có mặt của EBV tại thời điểm lấy mẫu, trong khi phương pháp huyết thanh học có thể xác định được cả những đối tượng đã từng nhiễm EBV mà tại thời điểm lấy mẫu không còn tồn tại EBV trong cơ thể

Về typ EBV lây nhiễm, trong hầu hết các quần thể trên thế giới, EBV typ 1 là chủng lây nhiễm chủ yếu, ngoại trừ quần thể người Châu Phi với tỷ lệ nhiễm EBV typ 1 và typ 2

là gần như ngang nhau Tại Việt Nam, Trần Thị Chính và cộng sự đã tiến hành xác định

tỷ lệ nhiễm các chủng EBV trên 32 mẫu máu người khoẻ mạnh, kết quả cho thấy EBV typ

1 là chủng lây nhiễm chính (66,67%) trong khi EBV typ 2 chỉ 33,33%[9] Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của nhóm với tỷ lệ EBV typ 1 chiếm ưu thế (36,64%), trong khi EBV typ 2 chỉ 6,87%

Tỷ lệ nhiễm EBV ở nhóm đối tượng nam giới khoẻ mạnh là 46,15%; tương đương với

tỷ lệ ở nhóm nữ giới khoẻ mạnh (48%) Về

tỷ lệ nhiễm từng chủng, có sự tương đồng về

tỷ lệ nhiễm giữa hai nhóm: tỷ lệ nhiễm EBV typ 1 ở nhóm nam và nữ lần lượt là 35,16%

và 32%; tương tự với EBV typ 2 là 6,59%

và 8% ở nhóm nam giới và nữ giới khoẻ

mạnh Tỷ lệ đối tượng mắc cả 2 typ EBV có

sự chênh lệch khi ở nhóm nam chỉ có 4,39%

còn nhóm nữ lại cao hơn (10%) Tóm lại,

không có sự khác biệt lớn về tỷ lệ nhiễm

EBV và tỷ lệ nhiễm từng chủng trong mẫu

nước bọt giữa hai giới tính ở thanh niên khoẻ

mạnh trong độ tuổi 18-25

V KẾT LUẬN

1 Đã chuẩn hoá và hoàn thiện quy trình

định typ EBV trong mẫu nước bọt bằng kỹ

thuật Nested-PCR

2 Mẫu nước bọt thanh niên khoẻ mạnh

(18-25 tuổi) có tỷ lệ nhiễm EBV là 50,38%

trong đó: tỷ lệ nhiễm EBV typ 1 là 36,64%;

tỷ lệ nhiễm EBV typ 2 là 7,63% và tỷ lệ

nhiễm cả 2 typ là 6,87%

3 Không có sự khác biệt lớn về tỷ lệ

nhiễm EBV và tỷ lệ từng chủng nhiễm trong

mẫu nước bọt giữa hai giới tính ở thanh niên

khoẻ mạnh (18-25 tuổi)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 CDC - National Center for Infectious

Diseases (2020) About 90% of adults have

antibodies that show that they have a current

or past EBV infection

2 Wei W., Huang Z., Li S., et al (2014)

Pretreatment Epstein-Barr virus DNA load

and cumulative cisplatin dose intensity affect

long-term outcome of nasopharyngeal

carcinoma treated with concurrent

chemotherapy: experience of an institute in an endemic area Oncol Res Treat, 37(3), 88– 95.49

3 Reusch J.A., Nawandar D.M., Wright K.L.,

et al (2015) Cellular differentiation regulator

BLIMP1 induces Epstein-Barr virus lytic reactivation in epithelial and B cells by activating transcription from both the R and Z promoters J Virol, 89(3), 1731–1743

4 Cancer Research UK (2014) Developing a

vaccine for the Epstein–Barr Virus could prevent up to 200,000 cancers globally say experts

5 Khan G, Fitzmaurice C, Naghavi M, Ahmed LA (2020) Global and regional

incidence, mortality and disability-adjusted life-years for Epstein-Barr virus-attributable malignancies, 1990-2017 BMJ Open 10 (8): e037505 doi:10.1136/bmjopen-2020-037505

6 Knipe D M., Howley P M.Rickinson, A B and Kieff, E (2001) Epstein–Barr virus In

(eds.), Fields Virology Lippincott Williams and Wilkins; Philadelphia

7 Kee Ching G., Chen Yi Hsu et al (1994)

Prevalence of Taiwan variant of Epstein-Barr virus in throat washings from patients with head and neck tumors in Taiwan J of Clinical Microbiology, Vol 32, No.1, p28-31

8 Hu L.F (1996) Nasopharyngeal carcinoma

and EBV PhD thesis MTC

9 Chinh.T.T et al (2007) Định týp

Epstein-Barr Virus trong mô sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng bằng kỹ thuật PCR