Các phương pháp phân tích ADN pdf

Các phương pháp phân tích ADN PGS.TS.. Tinh chế acid nucleic  Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn – Gradient liên tục / không liên tục của cesium chloride CsCl... Các enzym biến đổ

Trang 1

Các phương pháp

phân tích ADN

PGS.TS Trần Cát Đông

Trang 2

Chiết tách vâật liêậu di truyền

 Nguyên tắc chung: 3 bước

– Phá vỡ tế bào: vâật lý, hóa học

– Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform

– Kết tủa acid nucleic: cồn tuyêật đối

 Các trường hợp cụ thể:

– Plasmid: mục tiêu loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước

– ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid

– Tế bào Thực vâật: phá tế bào bằng cách nghiền

– Tế bào Đôậng vâật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy

– ARN: bất hoạt RNase, tủa bằng LiCl 8M, loại ADN bằng DNase

– Tủa lượng ADN nhỏ: đôận bằng tARN

– Tủa bằng isopropanol, tert-butanol,…

 Các kỹ thuâật khác

– Loại carbohydrat, lipid bằng CTAB Thu hồi ADN bằng sắc ký hấp phụ

Trang 3

Tinh chế acid nucleic

 Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn

– Gradient liên tục / không liên tục của cesium chloride (CsCl)

Trang 4

Định tính - định lượng acid nucleic

 Quang phổ kế: OD260nm

– 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi

– 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn

– 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base)

– Kiểm tra đôậ tinh khiết bằng tỷ lêậ OD260/230 hoăậc

OD260/280, OD320nm

 Điêận di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điêận trong gel

– Định tính theo kích thước

– Định lượng bằng so sánh với chuẩn

Trang 5

Điêận di

Trang 6

Các enzym biến đổi acid nucleic

 Enzym cắt hạn chế / methylase

– Cắt ADN tại vị trí xác định

– Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù

– Lưu ý tính tương thích khi cắt nối

 Polymerase

– ADN polymerase phụ thuộc ADN

– Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN)

– ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu

– ARN polymerase phụ thuộc ADN

 Ligase

– Nối hai đoạn ADN

Trang 7

Kỹ thuâật lai acid nucleic

 Là sự bắt căập bổ sung đăậc hiêậu của hai phân tử acid nucleic mạch đơn

G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T

G-T-A-G-T-C-C

T-C-A-G-G-T

+

 Các yếu tố ảnh hưởng

– Nồng độ ADN và thời gian phản ứng

– Nhiệt độ

– Độ dài của các trình tự

– Lực ion

Trang 8

Kỹ thuâật lai acid nucleic

 Southern Blot: lai ADN

 Northern Blot: lai ARN

 Lai tại chỗ (in situ)

Trang 9

Kỹ thuâật PCR

 Nguyên lý: sao chép ADN in vitro

– Trong điều kiện có sẵn nucleotid

– Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống

 Kỹ thuật PCR gồm 3 bước:

– biến tính dsADN thành các sợi đơn nhờ nhiêật đôậ,

– ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN,

– enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu

Trang 10

PCR

Trang 11

PCR - Các yếu tố kỹ thuâật

 Chương trình PCR

– Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút

– Chu kỳ nhiêật: gồm 3 bước lăập lại 25-40 lần

 Biến tính: 94-95 o C / 30’-vài phút

 Gắn mồi: 40-70 o C (< Tm của mồi) / 30’-60’

 Kéo dài: 65-74 O C / thời gian tùy theo đôậ dài khuôn

– Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài

 Thành phần phản ứng: 20-100 µl

– Khuôn mẫu

– Mồi (oligo 15-30 nucleotid, được thiết kế đăậc hiêậu)

Trang 12

Ưu nhược điểm và các biến thể

 Ưu

– Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đăặc hiêặu

 Nhược

– Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi

– Ngoại nhiễm  mất tính đăậc hiêậu

– RT-PCR: khuôn mẫu ARN

– Realtime-PCR: PCR song song với phát hiêận sản phẩm

– ……

Trang 13

Ứng dụng PCR

 Tạo đoạn ADN mong muốn

 Giải trình tự

 Gây đôật biến

 Chẩn đoán, Phát hiêận và định danh sinh vâật

 Xác định quan hêậ di truyền

 Nhâận dạng tôậi phạm,…

Trang 14

Phương pháp giải trình tự Sanger

 Phương pháp enzym/dideoxy: dựa vào sự

ngừng tổng hợp ADN khi găập phải dideoxy nucleotid (Frederick Sanger)

– Mỗi ống sản phẩm được nạp vào môật giếng điêận di

– Kết quả điêận di được đọc  trình tự

Trang 15

Đọc kết quả Phương pháp Sanger

5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’

ddG ddA ddT ddC

3’

Trang 16

Kỹ thuâật tự đôậng mới nhất (Harold Swerdlow)

 Các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau

 Thực hiêận môật phản ứng PCR duy nhất với sự hiêận diêận của các dNTP và ddNTP

 Sử dụng điêận di mao quản để tách sản phẩm

 Đọc kết quả bằng đầu dò laser

Trang 17

Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert

 Phương pháp hóa học: dựa vào sự thủy giải

đặc trưng của ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert)

 Qui trình:

– Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự

– Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu

– Thực hiêận 4 (hoăậc 5) ống phản ứng riêng biêật:

1. G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa

2. AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị methyl hóa

3. TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin

4. C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin

Trang 18

Tạo sợi ADN đơn Đánh dấu bằng P 32

Cắt tại các base đăậc hiêậu

Phản ứng tại

G

Phản ứng tại

C

Phản ứng tại

A/T

Phản ứng tại

T/C

ADN cần giải trình tự

Trang 19

3’

Tách theo kích

thước Kích thước

của sản

phẩm (số

nucleotid)

Điêận di Phóng xạ ký

Trang 20

Ưu nhược điểm của Maxam-Gilbert

– Năng suất thấp

– Không tự đôậng hóa được

Trang 21

Pyrosequencing

Ronaghi tại Royal Institute of Technology, Thụy Điển, năm 1996

pyrophosphate khi nucleotide được gắn vào

luciferase và apyrase,

Định dạng
Số trang	21
Dung lượng	2,8 MB