CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH sắc ký

đề tài các phương pháp sắc kí trong nghiên cứu

BÀI GIẢNG

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

Dr Nguyen Ngoc Vinh

Sample Mobile phase

Sample Mobile phase

Khoa Công Nghệ Hóa Học– Bộ môn Hóa Phân Tích

ĐH Công Nghiệp – TP.HCM

 Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) là một phương pháp phân tích công cụ quan trọng trong phân tích thành phần, cấu trúc chất

 Bắt đầu từ cuối thế kỷ XIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy rằng một chùm tia ion dương có thể tách ra khỏi nhau dưới tác dụng của một điện trường và từ trường

nguyên tử khác nhau (isotope) là 20 và 22 (g/mol), ông cũng sử dụng máy phổ khối lượng trong phân tích hóa học, xác định khối lượng phân tử và nguyên tử

tích hormon/steroid (1950) Sự kết hợp GC/MS thực hiện năm

1960 và LC/MS năm 1970 Sau đó nhiếu kỹ thuật mới trong MS nhanh chóng phát triển như FAB, TS, tứ cực, TOF, MALDI…

 Có phạm vi ứng dụng rất rộng lớn trong các ngành hóa hữu cơ, hóa sinh, vô cơ và nguyên tố đồng vị

1 Sắc ký khí ghép khối phổ

 Cơ sở của phương pháp MS đối với các hợp chất hữu cơ là sự bắn phá các phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dương, hoặc phá vỡ các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử mang năng lượng cao:

 Năng lượng bắn phá phân tử thành ion phân tử khoảng 10eV, sự phá vỡ này phụ thuộc cấu tạo chất, phương pháp và năng lượng bắn phá  quá trình ion hóa Ion phân tử có số khối (m/e) ký hiệu

là M + Có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau như va chạm electron, va chạm electron, ion hóa photon, ion hóa trường, bắn phá ion, bắn phá nguyên tử nhanh

 Phương pháp khối phổ chính là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng chất đó

 Thiết bị khối phổ đầu tiên đƣợc J Thomson (Anh) chế tạo năm

1912 và đƣợc hoàn thiện hơn vào năm 1932 Sơ đồ chung:

1 Nạp mẫu và hóa khí mẫu:

Mẫu nạp vào máy có thể ở dạng khí, lỏng, rắn

 Mẫu sau khi biến thành dạng khí đi qua sang buồng ion hóa qua giao diện interface.

2 Cơ sở kỹ thuật của MS

Hóa khí mẫu

ion theo

số khối Nạp mẫu

2 Ion hóa:

các phân tử ở dạng khí phải được ion hóa bằng các pp thích hợp.

Phương pháp va chạm electron (Electron impact - EI): Phương pháp phổ biến, dòng khí của mẫu đi vào buồng ion hóa, va chạm với dòng electron

từ một sợi đốt (catod) chuyển động vuông góc với dòng phân tử mẫu Áp suất buồng ion hóa đạt 0,005 torr, t o 200  0,25 o C.

Các e va chạm với pt trung hoà tạo các mảnh ion, mảnh gốc hay pt trung hòa nhỏ Sau

đó các ion đi qua một điện trường 400 – 4000V để tăng tốc, vận tốc ion tỷ lệ với khối lượng của chúng.

Phương pháp ion hóa hóa học (chemical ionization - CI): Ion hóa hóa học

là cho dòng phân tử khí va chạm với một dòng ion dương hoặc âm để biến pt trung hòa thành ion phân tử hay ion mảnh Dòng ion này được hình thành từ pt dạng khí H 2 , CH 4 , H 2 O, CH 3 OH, NH 3 … qua sự ion hóa như bắn phá chúng bằng dòng electron mang năng lượng cao Mỗi phân tử dạng khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân trong ion hóa hóa học (bảng dưới đây)

H 2

CH 4

H 2 O

CH 3 OH i-C 4 H 10

NH 3 (CH 3 ) 2 CO

Bước 1: pt trung hòa (CH 4 ) va chạm với dòng electron mang năng lượng cao trở thành nguồn ion

Phương pháp ion hóa trường (field ionization):

 sử dụng điện trường mạnh để làm bật ra e từ phân tử Với bề mặt KL anod có hình nhọn hay sợi mỏng và dưới chân không cao (10 -6 torr) sẽ phát sinh lực tĩnh điện đủ làm bật e ra khỏi phân tử mà không đòi hỏi năng lượng quá dư.

 Trong pp ion hóa trường, nguồn ion được tạo ra nhờ một kim nhỏ có d

= vài µm làm anod gắn ngay trước khe vào buồng ion hóa, khe vào chính là catod, còn có khe hội tụ để tập trung nguồn ion

Phương pháp ion hóa photon:

 Nhiều quá trình ion hóa đòi hỏi năng lượng từ 10eV tương ứng với các photon có bước sóng khoảng 83 – 155nm nằm trong vùng tử ngoại chân không do đó có thể thực hiện quá trình va chạm photon.

 khối phổ đạt được cũng tương tự pp va chạm electron Do năng lượng nhỏ hơn nên phổ này chủ yếu cho ion phân tử và một số mảnh có số khối lớn tương tự pp ion hóa trường.

 Người ta cũng sử dụng nguồn laser làm nguồn ion hóa, đó là nguồn đơn sắc (laser rubi) mang năng lượng cao.

3 Tách các Ion theo số khối:

Các ion hình thành có khối lượng m và điện tích e , tỷ số z = m/e gọi là số khối Chúng sẽ được tách ra khỏi nhau nhờ một nam châm có từ trường

H o hoặc kèm theo một điện trường nữa Các loại thiết bị tách gồm có:

 Thiết bị khối phổ hội tụ đơn hoặc còn gọi là khối phổ hình quạt hay lệch

từ (single-focusing magnetic deffection hay sector mass analyser)

 Thông thường nhất là dùng thiết bị từ trường hình quạt field spectrometer) để tách các ion theo khối lượng

(sector- Các ion trước khi ra khỏi buồng ion hóa đã được tăng tốc nhờ một điện trường có thế U, đi qua nam châm hình ống có từ trường H Các ion sẽ chuyển động theo hình vòng cung bán kính

r trong từ trường này Với r:

 Vậy với giá trị U và H nhất định thì số khối m/e tỷ lệ với bán kính r.

Từ biểu thức trên nhận thấy các ion có m/e khác nhau sẽ được tách ra khỏi nhau do r của vòng cung chuyển động của chúng khác nhau Máy hội tụ đơn có độ phân giải thấp (1000 – 5000)

 Thiết bị khối phổ hội tụ kép (double-focusing sector spectrometer): để máy có độ phân giải cao (10.000 – 100.000) người ta chế tạo bộ tách ion gồm 1 điện trường và một từ trường đặt cạnh nhau Các ion trước khi qua từ trường hình quạt, sẽ đi qua 1 điện trường tĩnh điện để tách biệt nhau một lần nữa

 Sơ đồ tandem sector instrument với EBEb ion optic (Jeol HX110, với hệ khối phổ hội tụ 4 lần).

 Thiết bị khối phổ tứ cực (quadrupole): khối phổ tứ cực sử dụng

4 thanh tròn đặt song song nhau thành 1 bó Từng cặp đối diện điện tích âm hay dương của nguồn điện 1 chiều (DC) Ngoài ra thế điện xoay chiều được sử dụng cho cả hai cặp.

 Cả 2 trường đều không làm tăng tốc dòng điện tích dương từ nguồn đi ra nhưng làm chúng dao động quanh trục trung tâm khi chuyển động và chỉ các ion có số khối nhất định mới đến bộ phận thu góp Tần số và thế thay đổi  các ion có số khối khác nhau lần lượt đến bộ phận thu góp.

 Các ion đi vào trường tứ cực theo hướng trục z đồng thời dao động theo hướng trục x, y dưới ảnh hưởng của một trường điện tần số cao Chỉ các dao động của các ion có m/e đặc biệt không tăng lên theo biên độ dao động và có thể đi qua tâm tứ cực dọc theo trục Các ion khác có biên độ dao động tăng sẽ va đập vào thành các điện cực trước khi có thể vượt qua các điện cực đi vào detector Phương trình tổng quát của phổ tứ cực như sau:

V: điện áp tần số cao, r: khoảng cách 2 điện cực đối nhau, f: tần

số dao động ion

 Độ phân giải phổ kế

Rs, nối 2 –

3 bộ tứ cực với nhau như hình dưới (Rs có thể đạt tới 20.000):

4 Detector:

Sau khi ion hình thành và tách khỏi nhau theo số khối, chúng cần đƣợc phát hiện và ghi nhận  nhiệm vụ của detector Các loại detector trong MS gồm có cốc Faraday, nhân electron thứ cấp, tấm kính ảnh nhạy ion, hệ thống đếm ion.

5 Độ phân giải của MS:

Độ phân giải là khả năng tách 2 số khối liền nhau m và m + m Độ phân giải R của MS đƣợc tính theo:

Các máy có R < 1000 đƣợc coi là độ phân giải thấp, R > 10.000 là

có độ phân giải cao

 Các mẫu chất trong phân tích MS phải nằm ở dạng hơi do đó hỗn hợp khí mang và mẫu chất từ GC có thể đưa vào buồng ion hóa của MS nhưng phải giảm tốc độ khí mang từ cột đi ra khoảng < 2ml/min

 Do thế ion hóa của He là 24,58 eV, nên để tăng độ nhạy của máy thông qua việc tăng thế ion hóa của buồng ion hóa lên 70eV, người ta phải tách He ra khỏi dòng khí trước khi vào buồng ion hóa.

 Cấu tạo của GC/MS gồm 2 phần là thiết bị GC và MS được ghép với nhau thông qua bộ kết nối (interface) Nhằm mục đích loại bớt He, N 2 để giảm áp suất dòng khí mang và phân tử mẫu chất

đi vào buồng ion hóa, phần GC dùng cột mao quản và phần MS

sử dụng buồng ion hóa EI hay CI với bộ tách tứ cực và detector khối phổ

3 Sắc ký khí ghép MS

Rotary pump Turbo pump

Phương pháp HPLC được dùng để tách các chất lỏng khó bay hơi, không thể tách được bằng GC Sự kết hợp giữa LC và MS cũng cho những thuận lợi tương tự GC/MS Tuy nhiên interface ở đây đóng vai trò quan trọng và gồm nhiều loại khác nhau.

 Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (direct liquid insertion, DLI)

 Bộ kết nối băng chuyền (moving belt interface)

 Bộ kết nối phun nhiệt (thermospray)

 Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA, Continuous Flow Fast Atom Bombardment)

 Bộ kết nối phun điện

4 Sắc ký lỏng hiệu quả cao ghép MS