3: Phân loại phô mai theo quy trình sản xuất - Phô mai tươi - Phô mai có qua giai đoạn ủ chín - Không qua giai đoạn ủ chín - Hệ vi sinh vật trong giai đoạn ủ chín: Vi khuẩn Vi khuẩn và
TỔNG QUAN
Giới thiệu về phô mai
1.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển của phô mai [8], [9], [10]
Theo định nghĩa của FAO/WHO, phô mai là protein của sữa được đông tụ, tách bớt whey ở dạng tươi hoặc đã qua ủ chín
Việc xác định nguồn gốc chính xác của phô mai vẫn gặp khó khăn, vì phô mai có lịch sử phức tạp và đa dạng trên nhiều nền văn hóa Tuy vậy, các nghiên cứu khảo cổ cho thấy phô mai đã được sản xuất từ thời tiền sử, ước tính vào khoảng 7000 năm trước Công nguyên.
Hiện nay trên thế giới có hàng trăm loại phô mai với sự đa dạng về cấu trúc, mùi vị và màu sắc, cùng các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh khác nhau Quy trình sản xuất phô mai rất đa dạng, cho phép sử dụng nhiều nguyên liệu sữa và các giống vi sinh vật khác nhau để tạo ra các sản phẩm phô mai đa dạng.
Phân loại theo hàm lượng nước trong phô mai:
Hàm lượng nước trong phô mai thường được biểu diễn bằng tỷ lệ phần trăm nước so với tổng khối lượng phô mai sau khi loại bỏ chất béo, được ký hiệu MFFB (Moisture on Fat Free Basis) MFFB cho biết lượng nước có trong phô mai trên cơ sở khối lượng phô mai không chứa chất béo và được tính bằng công thức: MFFB = (nước / phô mai béo tự do) × 100% Việc đo MFFB giúp đánh giá chất lượng, kết cấu và khả năng bảo quản của phô mai, đồng thời là tham số quan trọng trong kiểm soát chất lượng và thiết lập tiêu chuẩn sản phẩm MFFB có thể khác nhau giữa các loại phô mai do thành phần và quy trình sản xuất, ảnh hưởng đến độ ẩm, độ mềm và tính ổn định của sản phẩm Do đó, MFFB được dùng để tối ưu quy trình sản xuất, đánh giá đồng nhất sản phẩm và đáp ứng yêu cầu an toàn thực phẩm và ghi nhãn phù hợp.
Bảng 1 1: Phân loại phô mai theo hàm lượng nước
Loại sản phẩm Giá trị MFFB (%) Phô mai rất cứng
Phô mai cứng Phô mai bán cứng Phô mai bán mềm Phô mai mềm
Phân loại theo hàm lượng chất béo trong phô mai:
Trong ngành phô mai, hàm lượng chất béo thường được biểu diễn bằng phần trăm chất béo trên cơ sở khô, hay còn gọi là Fat on Dry Basis (FDB) FDB cho biết chất béo chiếm bao nhiêu phần trăm trên khối lượng khô của phô mai, giúp so sánh mức độ béo giữa các sản phẩm phô mai có độ ẩm khác nhau Việc nắm bắt FDB hỗ trợ người tiêu dùng và nhà sản xuất đánh giá thành phần dinh dưỡng và tối ưu hóa công thức phô mai.
Bảng 1 2: Phân loại phô mai theo hàm lượng chất béo
Loại sản phẩm Giá trị MFFB (%)
Phô mai được phân loại theo hàm lượng béo, từ rất cao đến gầy: phô mai có hàm lượng béo rất cao cho hương vị đậm đà và chất béo bão hòa nổi bật; phô mai có hàm lượng béo cao vẫn mang lại độ ngậy dễ chịu cho nhiều món ăn, phô mai có hàm lượng béo trung bình cân bằng giữa hương vị và dinh dưỡng, phô mai có hàm lượng béo thấp phù hợp cho người muốn giảm lượng chất béo, và phô mai gầy là lựa chọn ít calo và ít chất béo cho chế độ ăn kiêng hoặc kiểm soát cân nặng Hiểu rõ các mức béo này giúp bạn chọn đúng loại phô mai cho món ăn và mục tiêu dinh dưỡng của mình.
Phô mai được phân loại dựa trên hai tiêu chí chính: quy trình công nghệ sản xuất có quá trình ủ chín hay không, và hệ vi sinh vật tham gia các biến đổi trong giai đoạn ủ chín của sản phẩm Theo tiêu chí đầu tiên, phô mai được chia thành loại đã qua ủ chín và loại chưa qua ủ chín, từ đó ảnh hưởng đến hương vị, kết cấu và thời gian bảo quản Theo tiêu chí thứ hai, sự tham gia của các hệ vi sinh vật như vi khuẩn lactic, nấm mốc và nấm men trong quá trình ủ chín quyết định biến đổi của phô mai và hình thành các nhóm dựa trên đặc tính sinh học và thành phần hương vị Như vậy, phô mai được chia thành hai nhóm chính dựa trên sự có mặt của quá trình ủ chín và tác động của hệ vi sinh vật trong quá trình lên men, giúp xác định đặc tính, mục đích sử dụng và thời gian trưởng thành của từng loại.
Bảng 1 3: Phân loại phô mai theo quy trình sản xuất
Loại sản phẩm Đặc điểm
- Phô mai có qua giai đoạn ủ chín
- Không qua giai đoạn ủ chín
- Hệ vi sinh vật trong giai đoạn ủ chín:
Vi khuẩn và nấm mốc
- Các biến đổi trong giai đoạn ủ chín diễn ra chủ yếu: Trên bề mặt khối phô mai
Trong bề sâu khối phô mai
Phân loại phô mai dựa trên tác nhân đông tụ của casein là enzyme rennet hay axit; có một số loại phô mai vừa đông tụ bằng axit vừa bằng rennet, ví dụ phô mai cottage.
Ngoài ra, còn có một loại phô mai đặc biệt khác được gọi là phô mai nấu chảy được sản xuất từ một số loại phô mai khác
1.1.3 Thành phần dinh dưỡng của phô mai [10]
Phô mai chứa lượng protein lớn và chất béo ở mức cao, nên có độ sinh năng lượng tương đương với thịt lợn (khoảng 2500–4500 Kcal cho mỗi kilogram) Ví dụ, 100 g phô mai Roquefort cung cấp khoảng 368 Kcal, tương đương với lượng calo có trong thịt lợn Trong khi đó, sữa tươi, thành phần chính để làm phô mai, chỉ cung cấp khoảng 65 Kcal mỗi 100 g.
Các protein, chất béo trong phô mai đều ở dạng cơ thể dễ hấp thu, có đầy đủ các axit amin không thay thế, các vitamin, các chất khoáng
Phô mai có lượng protein vượt trội so với sữa tươi và thịt: Roquefort 21,5%, Camembert 17,5%, Cheddar 25%, trong khi sữa tươi 3,5% và thịt 13,6% protein trên mỗi 100 g sản phẩm Đặc biệt, lượng canxi và phốt pho trong phô mai rất dồi dào, với Roquefort 315 mg canxi và Cheddar 750 mg canxi trên 100 g phô mai thành phẩm, so với 118 mg canxi ở sữa tươi.
Về các loại vitamin, vitamin A đạt đến 1240 IU ở Roquefort và 1310 IU ở Cheddar Ngoài ra, hàm lượng B1, B2, PP ở phô mai cũng rất đáng kể
1.1.4 Công dụng của phô mai [8], [9], [10]
Phô mai có mùi vị thơm ngon, kích thích quá trình tiết dịch tiêu hóa, làm tăng khả năng đồng hóa thức ăn cho cơ thể
Phô mai có thể ăn liền hoặc được dùng kết hợp trong nhiều món ăn khác nhau Bạn có thể thưởng thức phô mai như một món ăn trực tiếp hoặc dùng làm lớp phủ cho pizza, ăn kèm với bánh mì nướng giòn và rượu vang đỏ, hoặc kết hợp với mì Ý để tạo nên những bữa ăn đậm đà, hấp dẫn Hương vị béo ngậy của phô mai làm nổi bật các món từ pizza đến mì Ý, và sự hòa quyện với rượu vang đỏ giúp cân bằng hương vị cho bữa ăn Với sự linh hoạt này, phô mai mang lại sự đa dạng và chiều sâu cho ẩm thực hàng ngày.
Phô mai là nguồn cung cấp chất đạm, canxi, phốt pho cao, rất bổ dưỡng và tốt cho xương
1.1.5 Quy trình sản xuất phô mai
1.1.5.1 Sơ đồ quy trình sản xuất phô mai [8]
Hiện nay trên thế giới có nhiều loại phô mai được sản xuất theo các quy trình khác nhau với thông số kỹ thuật đa dạng Trong bài viết này, chúng tôi giới thiệu quy trình sản xuất phô mai có qua giai đoạn ủ chín, bắt đầu từ xử lý sữa và lên men cho đến hình thành khuôn, ủ và trưởng thành để cho ra những sản phẩm phô mai có hương vị và chất lượng phù hợp với từng mục đích sử dụng.
Sơ đồ 1.1: Quy trình công nghệ sản xuất
1.1.5.2 Giải thích quy trình [8] Đồng hóa
Mục đích của quá trình đồng hóa trong công nghệ chế biến sữa là để ổn định hệ nhũ tương, chống lại sự tách pha dưới tác dụng của trọng lực
Cấy giống vi sinh vật
Vi khuẩn lactic thường được nhân giống hay hoạt hóa trên môi trường sữa tái chế với hàm lượng chất khô 10- 11% Để thực hiện quá trình lên men, người ta thường cấy giống vi khuẩn lactic vào sữa với tỷ lệ 1÷3% (v/v)
Sữa tươi Đồng hóa Cấy giống Lên men Đông tụ Tách sơ bộ huyết thanh sữa Đổ khuôn và tách huyết thanh
Huyết thanh sữa Nhân giống Ướp muối Ủ chínBao góiNaCl
Sau khi cấy giống, hỗn hợp sữa và canh trường giống được khuấy đều để đảm bảo độ đồng nhất Quá trình lên men lactic diễn ra ở các nhiệt độ khác nhau tùy thuộc vào tổ hợp vi sinh vật được sử dụng Thông thường, trong sản xuất phô mai bán cứng, nhiệt độ lên men dao động từ 37°C đến 45°C vì người ta thường sử dụng hệ vi khuẩn lactic ưa nhiệt để lên men.
Sau 1÷2 giờ lên men, khi giá trị pH sữa giảm xuống, người ta bơm hỗn hợp qua bồn đông tụ và cho enzyme vào Đông tụ
Đông tụ sữa được thực hiện với hoạt tính đông tụ 1:10000, với lượng chế phẩm rennet sử dụng 5–10 g/100 kg sữa Rennet được hòa vào nước theo tỉ lệ 1:10, sau đó đưa vào bồn đông tụ để bắt đầu quá trình đông tụ Nhiệt độ đông tụ được duy trì theo nhiệt độ lên men để đảm bảo hiệu quả đông tụ và chất lượng sản phẩm.
Ngoài ra còn bổ sung CaCl2 (5-20 g/100 kg sữa) để hỗ trợ đông tụ
Quá trình đông tụ kết thúc sau khoảng 30- 60 phút Tại thời điểm kết thúc đông tụ, giá trị pH giảm xuống 4.5÷4.55
Khối đông được cắt thành khối vuông cạnh 3- 15 mm nhằm tăng diện tích khối đông để tách huyết thanh hiệu quả hơn
Cần gia nhiệt khối đông lên từ từ đến khoảng 35- 36 0 C đồng thời khuấy đảo nhẹ để thúc đẩy sự tách huyết thanh
Sau đó, khối đông tụ được đem đi ướp muối Đổ khuôn và ép
Giới thiệu về sữa tươi tiệt trùng
Sữa tiệt trùng là sữa phải được xử lý ở nhiệt độ rất cao (trên 100 0 C), nhờ đó toàn bộ hệ vi sinh vật và enzyme trong sữa bị vô hoạt
Sữa tiệt trùng được bảo quản ở nhiệt độ phòng Thời gian bảo quản sản phẩm có thể kéo dài từ 3 đến 6 tháng
Hình 1.9: Một số loại phô mai của Pháp
Phô mai Gorgonzola Phô mai Pecorino từ sữa cừu Phô mai Mozzarella
Hình 1.8: Một số loại phô mai của Italia
Hình 1.3: Một số loại phô mai tươi
Hình 1.2: Phô mai Président Hình 1.1: Phô mai của công ty Vinamilk- Việt Nam
Trong sản xuất sữa tiệt trùng, nguyên liệu đầu vào phải có chất lượng rất tốt để đảm bảo an toàn và chất lượng sản phẩm Bên cạnh các chỉ tiêu vi sinh, hóa lý và cảm quan, người ta thường chú ý đến thành phần serum-protein trong sữa tươi Hàm lượng serum-protein dao động từ 0,1 đến 0,4 g/l.
Các biến đổi trong quá trình tiệt trùng:
Vitamin B1, B2 và Vitamin C dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao Khi gặp nhiệt độ cao, các hợp chất khử như lactose có thể tham gia phản ứng Maillard với các chất chứa nhóm -NH2, hình thành các sản phẩm khử và hợp chất màu, từ đó ảnh hưởng đến chất lượng và màu sắc của thực phẩm.
Một số protein trong sữa có thể bị biến tính một phần khi trải qua quá trình xử lý nhiệt Tuy nhiên, biến đổi này không ảnh hưởng xấu đến giá trị dinh dưỡng của sữa tiệt trùng.
Sau quá trình tiệt trùng, màu sắc của sữa sậm hơn khi ta so sánh với sữa tươi Sản phẩm thoảng có mùi caramel và mùi nấu.
Giới thiệu về vi khuẩn lactic
1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic [5]
Phổ biến nhất trong sản xuất phô mai là dùng vi khuẩn lactic Nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm (Topt ≈ 25–35°C) và ưa nhiệt (Topt ≈ 37–45°C) tham gia lên men lactic đồng hình hoặc dị hình, sản sinh axit lactic và góp phần đông tụ casein trong sữa cũng như tạo độ chua cho khối đông Ngoài ra, chúng còn tạo ra các sản phẩm phụ từ quá trình lên men như CO2, acetaldehyde, diacetyl Một số chủng vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình chuyển hóa axit citric và phân giải protein để hình thành giá trị cảm quan và các chỉ tiêu hóa lý đặc trưng cho phô mai thành phẩm.
1.3.2 Quá trình lên men lactic đồng hình [5]
Vi khuẩn lactic điển hình có khả năng phân hủy đường theo con đường EMP (đường phân glycolysis) để tạo ra axit lactic Quá trình chuyển hóa đường thành axit lactic diễn ra qua giai đoạn lên men dẫn đến hình thành pyruvat, sau đó pyruvat được khử bởi enzyme lactate dehydrogenase nhờ NADH, tạo thành axit lactic và NAD+ Nhờ cơ chế này, vi khuẩn lactic sử dụng đường thành axit lactic thông qua phản ứng khử pyruvat, đóng vai trò quan trọng trong chu trình lên men và sản xuất axit lactic.
Tất cả các vi khuẩn lên men đồng hình tiến hành quá trình lên men lactic theo cơ chế chung:
Sơ đồ 1.2: Cơ chế lên men lactic đồng hình
1.3.3 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ( L acidophilus ) [5], [14]
Chỳng thuộc loại trực khuẩn, rộng 0.6ữ0.9 μm, dài 1.5ữ6 àm
Trong thiên nhiên, chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn
Chúng thuộc nhóm Gram dương và có khả năng di động
Nhiệt độ phát triển tối ưu là 45÷50 0 C
2-photphoglicerinic axit Photphonol pyruvic axit
Có thể lên men nhiều loại đường như: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose,… để tạo axit lactic
Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rahamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inositol
Trong quá trình lên men, chúng tạo ra cả 2 đồng phân quang học của axit lactic
1.3.4 Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus ( L bulgaricus ) [5], [14]
Chúng thuộc nhóm trực khuẩn dạng que dài 5÷20 àm, thường kết thành chuỗi
Là vi khuẩn Gram dương, không có khả năng di động, không tạo bào tử
Phát triển tốt ở 50 0 C và sinh sản tốt ở nhiệt độ
Trong quá trình lên men, chúng có thể tạo ra hàm lượng axit cao, khoảng 3–3,5% Quá trình này cũng sinh ra một lượng axit bay hơi nhỏ và anđehit, góp phần tạo nên mùi vị đặc trưng cho sản phẩm.
Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, lactose, galactose
Chúng không lên men được đường xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, manitol, dextrin, inulin
Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrat.
Tác nhân đông tụ sữa
Đông tụ casein trong sữa là quá trình chuyển casein từ trạng thái keo sang khối đông có cấu trúc gel Quá trình này được thực hiện theo hai phương pháp chính: đông tụ enzym và đông tụ axit Đông tụ enzym thường dùng enzyme như rennet để cắt chuỗi casein và hình thành mạng lưới gel, cho sản phẩm có đặc tính đàn hồi và độ đặc nhất định Đông tụ axit xảy ra khi pH của sữa giảm xuống mức gần điểm đông tụ của casein (khoảng pH 4,6), khiến casein kết tủa và hình thành khối đông có cấu trúc gel Mỗi phương pháp mang lại đặc tính khác nhau về thời gian đông, độ mịn và độ rắn của sản phẩm, vì vậy lựa chọn phương pháp phù hợp tùy mục đích chế biến trong công nghiệp sữa.
Chỉnh giá trị pH của sữa về điểm đẳng điện của casein là phương pháp được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất phô mai tươi, như Cottage và Quarg Khi pH của sữa đạt khoảng 4.6, đúng điểm đẳng điện của casein, lực hút tĩnh điện giữa các phân tử tăng lên khiến casein chuyển sang trạng thái không hòa tan và hình thành khối đông tụ trong sữa Quá trình đông tụ này tạo mạng lưới protein, cho sữa kết lại thành phôi phô mai tươi và ảnh hưởng tới kết cấu, độ ẩm của sản phẩm Nhờ việc kiểm soát pH và quá trình đông tụ, người ta có thể tối ưu chất lượng phô mai tươi, đạt được đặc tính mềm mại, mịn màng và hương vị mong muốn.
Sử dụng enzyme đông tụ sữa: enzyme được thu nhận và tinh sạch từ nhiều nguồn gốc, được thương mại hóa với nhiều tên gọi khác nhau
Giới thiệu về chanh dây
Giới thiệu chung về chanh dây
Tên khoa học: Passiflora edulis
Họ: Passifloraceae (họ Chùm Bao)
Chi Passiflora hiện có trên 400 loài, trong đó khoảng 60 loài cho trái ăn được Chanh dây có nguồn gốc từ Nam Brazil và đã được đưa vào trồng ở Úc và châu Âu từ thế kỷ 19 Trái chanh dây là một loại quả giải khát thơm ngát, hơi chua nhờ hàm lượng vitamin C cao, thường được dùng làm nước uống và vì thế được gọi là chanh dây.
Chanh dây được chia làm 2 dạng, tùy theo màu quả:
Dạng trái tím có vỏ màu tím đến tím sậm; quả nhỏ, đường kính khoảng 4–5 cm, có tua dây, nhánh và gân lá xanh Dạng này phổ biến ở vùng khí hậu mát và cho hương vị trái ngon nhất.
Dạng trái vàng (flavicarpa): Vỏ trái màu vàng chanh Trái lớn hơn dạng trái tím (6-
Quả có kích thước khoảng 12 x 4-7 cm, có tua dây, nhánh và gân lá ửng đỏ tím Hoa lớn, tràng màu tím sậm hơn ở dạng trái tím, đồng thời dây leo mọc mạnh hơn ở dạng này Đây là dạng chịu nóng, thích nghi với vùng có cao độ thấp (0-800 m) Đặc điểm sinh học của loài thể hiện sự thích ứng mạnh với điều kiện nhiệt độ cao và ánh sáng mặt trời, với sự phát triển của dây leo bám chắc, hoa và quả mang màu tím đặc trưng, phù hợp cho trồng làm cảnh và sử dụng ở khu vực khí hậu nóng ẩm.
Chanh dây là nhóm dây đa niên, nửa gỗ, dài đến 15 m
Thân tròn cạnh, xanh, mang tua dài và lá ở mỗi đốt
Lá mọc xen, mang lá kèm ở mỗi đốt Cuống lá dài 2-5 cm, phiến lá có 3 thùy dài, kích thước lá 10-15 x 12-25 cm, bìa phiến có răng cưa nhỏ, tròn đầu
Hoa đơn độc mọc từ nách lá, đẹp và thơm với đường kính 7,5–10 cm và cuống dài 2–5 cm Hoa có năm cánh và năm đài màu trắng mọc xen kẽ; phía trên là hai lớp tràng với các sợi trắng dài 2–3 cm, ửng tím ở gốc Mỗi hoa mang năm nhị đực với năm chỉ dính nhau thành ống ở đáy và tách rời ở phần mang bao phấn.
Trái có hình cầu đến hình bầu dục, ngoại quả mỏng nhưng cứng; phần trung quả màu xanh và nội quả màu trắng Trái mang nhiều hột, cơm mềm và có mùi thơm đặc trưng.
Bảng 1 6: Thành phần dinh dưỡng của chanh dây tươi
Thành phần dinh dưỡng / 100g thịt quả
30 mg 700- 2410 IU (Nguồn Coronel, 1986, Promising Fruits ò the Philippines, CA-UPPLB, trang 502, USDA Handbook)
Hình 1 14: Dạng chanh dây vàng
Hình 1 13: Dạng chanh dây tím Hình 1 12: Hoa chanh dây
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Công nghệ Sinh học, thuộc Khoa Khoa học Ứng dụng và Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, TP Hồ Chí Minh Đây là không gian nghiên cứu và giảng dạy về công nghệ sinh học, nơi các hoạt động thử nghiệm và ứng dụng các phương pháp công nghệ sinh học được tiến hành nhằm hỗ trợ tiến bộ khoa học và giáo dục tại địa phương.
Luận văn này được thực hiện từ tháng 10 năm 2010 đến tháng 1 năm 2011.
Vật liệu thí nghiệm
Sữa tươi tiệt trùng có đường- sản phẩm của Công ty Cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk- mua tại các siêu thị trong thành phố
Chanh dây mua tại chợ Võ Thành Trang quận Tân Phú, Tp Hồ Chí Minh
Chủng Lactobacillus acidophilus phân lập từ túi AnniBio được sản xuất bởi
Công ty TNHH Công nghệ Intechpharm
Chủng Lactobacillus bulgaricus được cung cấp bởi Phòng Công nghệ Sinh học và Chuyển hóa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Để thuận tiện cho việc nghiên cứu và khảo sát, tôi đã đặt tên cho hai chủng này.
Chủng Lactobacillus acidophilus là chủng L1
Chủng Lactobacilus bulgaricus là chủng L2
Enzyme rennet chiết tách từ nấm mốc Aspergilus oryzea tại phòng thí nghiệm Hóa sinh- Trường ĐH Tôn Đức Thắng, Tp Hồ Chí Minh
Bảng 2 1: Dụng cụ thí nghiệm Đĩa Petri Ống nghiệm
Pipet vạch (1, 2, 5, 10 ml), Pipet Bầu
Becher (50, 100, 250, 500 ml) Erlen (100, 250, 500 ml) Ống đong (100, 250 ml) Phễu, đũa thủy tinh Que cấy (vòng, thuỷ tinh) Đèn cồn
Cối chày sứ Nồi Ống bóp nhỏ giọt, bóp cao su
Bảng 2 2: Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Cân phân tích Máy lắc Kính hiển vi Nồi hấp Bếp điện Bình hút ẩm
2.2.3 Hóa chất, thuốc thử, dung dịch đệm, thuốc nhuộm và môi trường sử dụng
Bảng 2 3: Các hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu
CH3COONa NaCl khan CaCl2 khan Twen 80 Ete
Axit dintrosalicylic DNS Muối tartrat kép KNaC4H4O6.4H2O Xúc tác (CuSO4:K2SO4:Se)
Axit triclo axetic TCA Dung dịch NH3
Bảng 2 4: Thuốc thử, dung dịch đệm, thuốc nhuộm dùng trong nghiên cứu
Dung dịch đệm Đệm Acetace 0.05N pH 5.25 Đệm Acetace 2M pH 5.5 Đệm phosphate citrate pH 6
Bảng 2 5: Các loại môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu (môi trường được hấp ở 121 0 C, 1 atm trong 20 phút)
Nước cất : 1000 ml pH : 6.2 – 6.5 Đối với môi trường đặc bổ sung agar
Môi trường malt – môi trường nhân giống cấp 1
Malt : 200 g Nước cất : 1000 ml pH : 7 Đối với môi trường đặc bổ sung agar
Môi trường nhân giống cấp 2 ẵ mụi trường malt + ẵ sữa tươi tiệt trùng có đường của Vinamilk (tính theo thể tích)
Môi trường nhân giống cấp 2 được hấp tiệt trùng ở 121 0 C trong 15 phút
Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 2 1: Giai đoạn phân lập L acidophilus (chủng L1) từ túi AnniBio Giai đoạn 2
Sơ đồ 2 2: So sánh chủng L1 và L2
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa số tế bào vi khuẩn và độ đục
Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng L1và L2
Nuôi cấy chủng L1 và L2, tiến hành sản xuất phô mai từ 2 chủng để chọn chủng làm phô mai có chất lượng tốt hơn
Tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa Quan sát, chọn khuẩn lạc phù hợp
Làm thuần vi sinh vật, quan sát hình thái, khả năng di động và xác định Gram
Quan sát phản ứng sinh hóa theo bộ kit
ID 32ECấy chuyền Phân lập và giữ giống
Sơ đồ 2 3: Giai đoạn khảo sát một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phô mai bổ sung chanh dây
Sơ đồ 2 4: Giai đoạn sản xuất quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá chất lượng sản phẩm
Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
Chuẩn bị môi trường phân lập
Môi trường dinh dưỡng là môi trường thiết yếu cho quá trình nuôi cấy, tích luỹ và bảo quản giống vi sinh vật Để đảm bảo sự tăng trưởng và duy trì ổn định quần thể, môi trường này phải chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng thiết yếu như nguồn cacbon, nitơ, nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng.
Tôi sử dụng môi trường MRS làm môi trường phân lập, cấy chuyền và giữ giống chủng L1
Kiểm tra một số chỉ tiêu của sản phẩm Sản xuất thử nghiệm phô mai
Chuẩn bị dịch chanh dây cô đặc Nhân giống vi sinh vật
Khảo sát ảnh hưởng của lượng axit, lượng CaCl2, nồng độ enzyme lên quá trình đông tụ sữa
Khảo sát lượng giống bổ sung và thời gian lên men Kiểm tra nguyên liệu chanh dây, sữa
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy MRS, cân đo đúng các thành phần, hòa tan chúng vào nước và điều chỉnh về thể tích pha mong muốn, sau đó chuyển dung dịch vào các dụng cụ chứa và đóng gói thích hợp, đồng thời ghi rõ ngày tháng và tên môi trường để dễ quản lý và tra cứu sau này.
Hấp khử trùng ở 121 o C, trong 20 phút, áp suất 1 atm
Môi trường lỏng không bổ sung agar Đối với môi trường thạch nghiêng, sau khi được hấp khử trùng, các ống nghiệm được để nghiêng sao cho đầu trên của mặt thạch nghiêng không vượt quá hai phần ba chiều dài ống nghiệm, thạch không được chạm vào nút bông.
Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý 0.85%
Hòa bột chứa sinh khối của L1 (lấy từ túi AnniBio) vào nước cất vô trùng, lắc đều, để yên khoảng 5 phút
Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối của chủng L1 trong ống chứa nước muối sinh lý và cấy lên ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS
Các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng Đem các ống thạch nghiêng ủ ở 37 0 C, trong 48 giờ để vi sinh vật phát triển
Vô trùng vị trí cấy bằng cồn 70 o Đốt đèn cồn lên
Trong bài viết về quy trình vi sinh, hai ống nghiệm được mô tả để quản lý một cách an toàn và hiệu quả nhằm giảm tối đa nhiễm chéo Mô tả căn bản cho rằng một ống chứa môi trường nuôi cấy và một ống chứa chất canh vi sinh vật được giữ ở tư thế ổn định, với tư thế cầm nắm được thiết kế để kiểm soát mẫu và hạn chế tiếp xúc không cần thiết Việc đặt ống ở trạng thái phù hợp và tránh làm xáo trộn mẫu giúp bảo vệ vô trùng và đảm bảo an toàn phòng thí nghiệm Tổng thể, nội dung nhấn mạnh tầm quan trọng của kỹ thuật cầm nắm hai ống nghiệm và sắp xếp sao cho quá trình thao tác vi sinh diễn ra thông suốt, an toàn và tuân thủ chuẩn mực.
Tay phải xoay lỏng các nút bông Tay phải cầm que cấy và đốt trên đèn cồn
Đoạn văn này mô tả ở mức khái quát nguyên tắc thao tác vô khuẩn và quan sát vi khuẩn trên nền thạch trong phòng thí nghiệm: người làm việc tập trung vào việc chuẩn bị dụng cụ, xử lý vô khuẩn và ghi nhận sự phân bố của vi sinh vật trên mặt thạch bằng các kiểu bố trí khác nhau như chữ cái, vòng xoắn, vạch ngang, đường thẳng hoặc chấm nhằm phục vụ cho mục đích phân tích dữ liệu Nội dung nhấn mạnh an toàn sinh học và hình ảnh hóa kết quả để người đọc dễ hình dung quy trình mà không đi vào các bước chi tiết, đồng thời tối ưu hóa cho SEO với các từ khóa liên quan đến nuôi cấy vi sinh, phân bố vi khuẩn và thạch nuôi.
Sau đó rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và đậy nút bông lại Đốt que cấy trên đèn cồn rồi gác lên giá
Các ống nghiệm sau khi cấy vi sinh vật được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C Sau 2–4 ngày, sinh khối vi sinh vật sẽ phát triển và được đưa vào bảo quản trong tủ lạnh Sinh khối vi sinh vật có thể dùng được trong 1 tháng, sau đó phải tiến hành cấy chuyền để giữ giống cho chu kỳ nuôi tiếp theo.
2.4.1.1 Tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa MRS [2]
Nguồn phân lập: các ống thạch nghiêng đã cấy chủng L1
Môi trường phân lập: môi trường MRS
Quy trình chuẩn cho môi trường nuôi cấy phân lập gồm chuẩn bị môi trường nuôi và phân bố vào các đĩa Petri vô trùng, để môi trường đông đặc theo tự nhiên Sau thời gian kiểm tra, loại bỏ những đĩa bị nhiễm vi sinh vật lạ để đảm bảo tính sạch và chất lượng của mẫu nghiên cứu.
Mẫu được pha loãng với dung dịch nước muối sinh lý 0.85% và khuấy đều để hòa tan hoàn toàn Sau đó, tiến hành pha loãng theo chuỗi 10 lần liên tiếp cho đến khi đạt được nồng độ mong muốn.
Dùng micropipette hút 0.1 ml dung dịch mẫu cho vào các đĩa petri chứa môi trường MRS, trải đều bằng que trang Ủ các đĩa ở 37 0 C bằng tủ ấm trong 48 giờ
Quan sát các đĩa phân lập Chọn những đĩa có khuẩn lạc tách rời, khuẩn lạc màu trắng, có hình dạng và kích thước đặc trưng
2.4.1.2 Quan sát, chọn khuẩn lạc phù hợp [2], [14]
Quan sát những đĩa petri có khuẩn lạc tách rời nhau và quan sát những đặc điểm: Hình dạng khuẩn lạc
Quan sát sự hình thành sắc tố: tía, đỏ, vàng, … hoặc không màu: trắng, kem,… Kích thước khuẩn lạc: đo đường kính khuẩn lạc
Bề mặt: bóng hay đục
Kết cấu: nhám, xù xì hay trơn nhẵn
2.4.1.3 Làm thuần vi sinh vật, quan sát hình thái, khả năng di động và xác định Gram [2], [14]
Trong quy trình vô trùng, người thực hiện dùng que cấy vòng chấm nhẹ lên khuẩn lạc đặc trưng đã chọn ở bước sơ bộ và sau đó tạo huyền phù trong ống nghiệm chứa nước muối sinh lý vô trùng.
Dùng que cấy vòng thu một vòng huyền phù Thực hiện cấy ria trên các đĩa môi trường MRS, cấy 3 lần để làm thuần, ủ ở 37 0 C trong 48 giờ
Quan sát hình thái và khả năng di động
Xác định khuẩn lạc đặc trưng và quan sát bằng kính hiển vi cho tới khi thấy tế bào đồng nhất, có dạng hình que và có khả năng di động Sử dụng tế bào trẻ và nuôi cấy 2–3 ngày để quan sát khả năng di động.
Cấy chủng đã thuần lên ống thạch nghiêng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
Mục đích của quá trình là nhuộm Gram và quan sát bằng kính hiển vi để phân biệt tế bào vi sinh vật nhuộm màu hồng (Gram -) và màu tím (Gram +) Nhuộm Gram giúp quan sát rõ hình thái, kích thước và cách sắp xếp tế bào của vi sinh vật, đồng thời cho phép quan sát được bào tử của vi sinh vật.
Chuẩn bị tiêu bản vi khuẩn là bước thiết yếu để quan sát hình thái và cấu trúc tế bào dưới kính hiển vi Mẫu nước vô trùng được đặt lên phiến kính và được xử lý thành một vết bôi mỏng, sau đó tiêu bản được cố định và tiến hành nhuộm màu bằng một chất nhuộm đặc trưng để làm nổi bật các đặc điểm của vi khuẩn Quy trình này hỗ trợ nhận diện và phân loại vi khuẩn dựa trên kết quả nhuộm và hình thái, mang lại cái nhìn trực quan về sinh học vi khuẩn và các ứng dụng trong y học và nghiên cứu.
1 phút, dùng kẹp gắp bỏ giấy lọc
Tẩy bằng cồn trong 20- 30 giây (để nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi thấy màu vừa hết trong các giọt nước chảy ra)
Nhuộm bổ sung bằng Safranin hay Fushin trong 20- 30 giây
Làm khô, soi dưới kính hiển vi nhúng dầu
Chọn những mẫu cho Gram (+) cấy lên ống thạch nghiêng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
2.4.1.4 Quan sát phản ứng sinh hóa theo bộ kit ID 32E
Mục đích: định danh vi khuẩn hiếu khí
Nguyên tắc: ID 32 E là hệ thống định danh sử dụng 32 thử nghiệm sinh hóa cỡ nhỏ dành cho vi sinh vật hiếu khí
Chuẩn bị dịch huyền phù vi sinh vật bằng cách lấy một ít sinh khối pha trong nước muối sinh lý sao cho dung dịch có độ đục 0.5 McFarland
Dung dịch này chỉ chuẩn bị trước khi thử nghiệm
Dùng micropipette đầu tip đã vô trùng nhỏ dịch huyền phù vào giếng (khoảng 55 μl/ giếng)
Phủ lên test ODC, ADH, LDC, URE, LARL, GAT và 5KG 2 giọt dầu khoáng Đậy nắp, ủ ở 37 ± 2 0 C trong 24 ± 2giờ với điều kiện hiếu khí
Trước khi đọc thử nghiệm IND: thêm một giọt thuốc thử Kovac, chờ 5 phút rồi đọc kết quả
Qua màu sắc quan sát được trên các giếng, tiến hành giải nghĩa theo phụ lục 2 để thu được kết quả phân tích Từ các kết quả này, việc định danh vi khuẩn được thực hiện dựa trên khóa phân loại Bergey, nhằm xác định chính xác chủng hoặc loại sinh vật được khảo sát.
2.4.2.1 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa số khuẩn lạc vi khuẩn và độ đục bằng cách đếm khuẩn lạc [11]
Nguyên tắc Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem khuẩn lạc hình thành từ một tế bào duy nhất
Trong một hệ huyền phù lỏng chứa nhiều chất không tan, các hạt phân tán gây độ đục bằng cách cản ánh và phân tán ánh sáng, làm phân tán chùm tia sáng và làm mờ nền thị giác Khi tế bào vi sinh vật hiện diện trong môi trường, chúng làm cho huyền phù trở nên đục và độ đục tăng lên tương ứng với mật độ tế bào Trong một khoảng thời gian nhất định giữa độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được một quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục, cung cấp cơ sở để ước lượng nhanh nồng độ tế bào vi sinh dựa trên đo độ đục của huyền phù.
Vi khuẩn sau khi nuôi cấy 48 giờ được hòa tan trong nước muối sinh lý để đo độ đục, và dịch huyền phù của vi khuẩn có giá trị OD660nm lần lượt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5.