kl le quoc thinh 062322s

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY DẦU RÁI Dipterocarpus Alatus Roxb BẰNG KỸ THUẬT RAPD TÓM TẮT Chọn giống và nhân giống cây rừng là một trong những khâu quan trọng quyết định cả về số l

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

CÂY DẦU RÁI (Dipterocarpus Alatus

Roxb) BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 01/2011

Để có được kết quả như ngày nay, con xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc, chân thành đến cha mẹ, anh chị và em gái mọi người là chỗ dựa vững chắc cho con và luôn tạo điều kiện để con học tập tốt

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, đến quý thầy cô trong khoa Khoa Học Ứng Dụng cùng thầy cô từng giảng dạy tôi đã cho tôi hiểu biết về những kiến thức chuyên môn, về nghề mà tôi đã chọn và học

Với sự biết ơn sâu sắc em gửi lời cảm ơn đến ThS.Trương Quốc Ánh, anh đã hướng dẫn tận tình, động viên và luôn tạo điều kiện để em thực hiện tốt luận văn này

Em xin gửi đến cô, ThS.Nguyễn Ngọc Hồng, ThS.Nguyễn Thị Thu Sang, TS.Trần Thị Dung Cô là người thầy, là người bạn luôn động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình học tập

để em vượt qua những khó khăn

Xin gửi lời cảm ơn đến đến sự giúp đỡ và hướng dẫn của các bạn, anh chị cùng làm việc tại Phòng Thí nghiệm sinh học phân

tử - viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam

Cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn lớp 06SH1D, các bạn đã sát cánh bên tôi cùng học tập giúp đỡ tôi rất nhiều trong những năm qua

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 Tháng 01 năm 2011

LÊ QUỐC THỊNH

LỜI CẢM ƠN

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY DẦU RÁI

(Dipterocarpus Alatus Roxb) BẰNG KỸ THUẬT RAPD

TÓM TẮT

Chọn giống và nhân giống cây rừng là một trong những khâu quan trọng quyết định cả về số lượng lẫn về chất lượng của rừng trồng 22 mẫu lá Dầu lấy từ 22 cây trội dự tuyển thu thập ở sáu tỉnh thuộc ba vùng địa lý Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ

và Tây Nguyên được phân tích nhằm xác định nguồn gốc và mối quan hệ di truyền bằng kỹ thuật RAPD, với 7 mồi khác nhau trong phản ứng PCR-RAPD thuộc các nhóm khác nhau Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Doyle và cộng sự (1987) có cải tiến cho phù hợp với đối tượng cây Dầu rồi thực hiện phản ứng PCR – RAPD Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 7 mồi chọn phản ứng đều cho băng đa hình

rõ rệt Tổng số có 25 loại băng có kích cỡ khác nhau, 100% các băng cho đa hình Từ

đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ phát sinh chủng loại về mối quan hệ di truyền của 22 mẫu giống Dầu rái Sự tương đồng di truyền của 22 giống Dầu rái nằm trong phạm vi từ 0.50 đến 1.00, chứng tỏ các giống Dầu rái của Việt Nam là rất đa dạng và phong phú, chúng được chia thành 5 nhóm nhỏ khác nhau thuộc 3 nhóm lớn Trong đó các giống có mối quan hệ di truyền khá gần gũi nhau, một số mẫu giống thuộc các nơi khác nhau nhưng hệ số tương đồng di truyền cao, nằm ở cùng một nhóm có thể thuộc cùng một loài nhưng do ngăn cách địa lý lâu dài nên có sự biến động di truyền, các giống đó sống trong vùng đệm giữa hai vùng địa

lý

MỤC LỤC

TỰA ĐỀ i

TÓM TẮT iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮC vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

PHẦN 2 : TỔNG QUAN 4

2.1 Cây Dầu Rái 4

2.1.1 Nguồn gốc 4

2.1.2 Đặc tính thực vật học của cây Dầu Rái 5

2.1.3 Cách trồng và khai thác Dầu Rái 6

2.1.4 Thành phần hóa học Dầu Rái 8

2.1.5 Giá trị kinh tế của cây Dầu Rái 8

2.2 Các khái niệm về đa dạng di truyền 9

2.3 Phản ứng chuỗi polymerase PCR 10

2.3.1 Lịch sử 10

2.3.2 Nguyên tắc chung 10

2.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 12

2.4 Vai trò của Marker phân tử đối với chọn giống thực vật 14

2.4.1 Marker phân tử có tính chất di truyền 14

2.4.2 So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử trong chọn giống thực vật 19

2.5 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền 20

2.5.1 Sơ lược về RAPD marker 20

2.5.2 Các bước thực hiện chủ yếu của kỹ thuật RAPD 21

2.6 Một số công trình nghiên cứu khoa học có liên quan 22

2.6.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 22

2.6.2 Một số nghiên cứu trong nước 22

PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 24

3.2 Vật liệu 24

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.2.2 Hóa chất dụng cụ 25

3.2.3 Thiết bị - dụng cụ 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Chọn và thu mẫu cây trội dự tuyển và cây trội 27

3.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA 29

3.3.3 Phản ứng PCR 30

3.3.4 Quy trình điện di 31

3.4 Phương pháp phân tích số liệu 32

3.4.1 Một số công thức dung trong đánh giá đa dạng di truyền 32

3.4.2 Phương pháp chạy chương trình NTSYSpc vesion 2.1 33

PHẦN 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Sản phẩm DNA sau ly trích 36

4.2 Kết quả nghiên cứu quan hệ di truyền bằng kỹ thuật RAPD 38

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮC

- AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

- Al: Allele

- ALP: Amplicon length polymorphism

- AP –PCA: Arbitrary primer – PCR

- CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

- DAF: DNA amplification fingerprinting

- DMC: Dương Minh Châu

- dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

- EB: extraction buffer

- EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

- ES: Easup

- MAAP: Multiple arbitrarily primed PCR

- NN & PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

- OD: Optical density

- PCR: Polymerase Chain Reaction

- RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

- RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

- SNP: Single Nucleotide Polymorphic

- SSR: Simple Sequence Repeats

- STS: Sequence Tagged Site

- Ta: Annealing temperature

- TBE: Tris – Boric acide - EDTA

- Tm: Melting temperature

- UPGMA: Unweighted pair – ground method with arithmetic mean

- WB: Washing bufer

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Chỉ số chất lượng Dầu Rái 8

Bảng 2.2: Các loại DNA markers thông dụng 18

Bảng 2.3: So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 19

Bảng 3.1: Thông số mẫu Dầu rái trội được chọn phân tích 24

Bảng 3.2: Danh sách mồi RAPD 26

Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho một mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR 30

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 30

Bảng 3.5 Thông số điều kiện điện đi 32

Bảng 4.1 Giá trị OD của 22 giống Dầu rái dung để chạy PCR với 7 mồi RAPD 37

Bảng 4.2 Tổng số band DNA của sản phẩm RAPD với 7 mồi ngẩu nhiên 40

Bảng 4.3 Tỉ lệ số band đa hình của sản phẩm RAPD với 7 mồi ngẩu nhiên 41

Bảng 4.4: Thông tin đa hình PIC của 22 giống Dầu rái 42

Bảng 4.5: Hệ số tương đồng của 22 giống Dầu rái nghiên cứu 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Hoa và quả Dầu Rái 4

Hình 2.2: DNA marker giữa các kiểu gene A, B, C, D 16

Hình 2.3: So sánh giữa (a) codominant marker và (b) dominant marker 17

Hình 2.4: Phản ứng PCR RAPD 21

Hình 3.1: Cửa sổ chương trình NTSYSpc, mục Similarity 34

Hình 3.2: Cửa sổ chương trình NTSYSpc, mục Clustering 35

Hình 4.1: Kiểm tra mậu DNA ly trích bẳng gel Agarose 1% 36

Hình 4.2: Sản phẩm PCR của mồi OPB12 39

Hình 4.3: Sản phẩm PCR của mồi OPU9 39

Hình 4.4: Sơ đố biểu diền quan hệ di truyền 22 giống Dầu rái 45

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Chọn giống và nhân giống cây rừng là một trong những khâu quan trọng quyết định cả về số lượng lẫn về chất lượng của rừng trồng Việc sử dụng giống được cải thiện và áp dụng các biện pháp trồng rừng thâm canh khác ở nước ta trong những năm qua đã góp phần đáng kể tăng nhanh năng suất rừng trồng bình quân từ 5–6m3/ha/năm lên 10-15m3/ha/năm, nhiều khu rừng thí nghiệm đạt trên 30 m3/ha/năm (Lê Đình Khả và cộng sự, 2000) Tuy nhiên, các nghiên cứu về chọn tạo giống và nhân giống trong thời gian qua chỉ tập trung chủ yếu vào một số loài cây nhập nội, mọc nhanh như: Bạch Đàn, Keo, Tràm, Thông, Lát Hoa và Phi Lao mà chưa chú ý đến việc cải thiện các giống gỗ lớn bản địa Bên cạnh đó, diện tích rừng cây gỗ lớn bản địa đang ngày càng bị thu hẹp mà trường hợp rừng cây họ Dầu là một ví dụ điển hình ( Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2002)

Theo số liệu thống kê cho thấy diện tích rừng cây họ Dầu tại vùng Đông Nam

Bộ giảm từ 49% năm 1959 xuống còn 34% năm 1968 và 18% năm 1982 (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2002) Với tình trạng khai phá như hiện nay, nhiều rừng Dầu còn lại sẽ

có nguy cơ biến mất trong tương lai (Lê Quốc Huy và Tạ Minh Hòa, 1998) Chính vì thế mà việc bảo tồn loài và rừng cây họ Dầu ngày càng trở nên cấp bách hơn bao giờ hết

Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb.), thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae), là

loài cây bản địa lớn, thường xanh, có giá trị kinh tế cao, chiếm ưu thế trong rừng mưa nhiệt đới, từng có quần thụ lớn trước đây giờ đang được xếp vào loài bị suy thoái nghiêm trọng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005) Vì vậy cho nên, loài này được xếp vào loại ưu tiên cho trồng rừng phòng hộ đầu nguồn và trồng rừng cảnh quan, đô thị và khu công nghiệp (Bộ NN & PTNT, 2004) Đến năm 2005, Bộ NN & PTNT quyết định đưa Dầu Rái vào danh mục các loài cây chủ yếu tiên phong cho trồng rừng sản xuất tại 3 vùng sinh thái lâm nghiệp Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và Nam Trung Bộ

Theo Nguyễn Hoàng Nghĩa (2001), hai yếu tố quyết định tới thành công và năng suất rừng trồng hiện đang được các nhà nghiên cứu quan tâm giải quyết, đó là giống có năng suất cao, kháng sâu bệnh hại và các biện pháp thâm canh đồng bộ, quản lý rừng trồng Bên cạnh đó, các chương trình nhân giống phải gắn kết chặt chẽ với chương trình chọn giống và chỉ nên sử dụng các dòng vô tính tốt nhất vào sản xuất đại trà

Thế nhưng, các nghiên cứu về chọn giống Dầu Rái ở nước ta hiện nay chỉ mới dừng lại ở mức xây dựng các khu rừng giống chuyển hóa từ rừng tự nhiên và rừng trồng ( Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005) Gần đây, Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng mới bắt đầu tiến hành điều tra vùng phân bố tự nhiên ở miền Nam, chọn một số cây trội và thu hài hạt (Hà Huy Thịnh, 2007) Vấn đề nhân giống bằng hạt và kỹ thuật gây trồng Dầu Rái đã được hướng dẫn trong quy trình, quy phạm kỹ thuật trồng rừng Dầu Rái và Sao đen (Bộ Lâm Nghiệp, 1988 Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam, 2005)

Phân loại và đánh giá mức độ đa dạng của thực vật dựa vào hình thái mất nhiều thời gian và độ chính xác hạn chế Để khắc phục những nhược điểm đó trong những năm gần đây, sự phát triển trong lĩnh vực sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ hữu hiệu cho phân tích di truyền, nó đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật chỉ thị phân tử khác nhau như: kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR v.v… Các chỉ thị này có vai trò quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, sự phát sinh và xác định các loài (Nghuyễn Đức Thành, 1999)

Chính vì những nguyên nhân trên, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng

di truyền của cây Dầu Rái (Dipterocapus alatus Roxb) bằng kỹ thuật RAPD” là

một nghiên cứu cơ bản bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền, mối quan hệ họ hàng và phân biệt các cá thể Dầu Rái trội dự tuyển Trên cơ sở đó phục vụ cho các

Nghiên cứu chọn, nhân giống và kỹ thuật gây trồng Dầu Rái (Dipterocapus alatus

Roxb) nhằm có định hướng đầy đủ cho phát triển giống cây trồng lâm nghiệp, kết

hợp với tác động kỹ thuật lâm sinh nhằm nâng cao năng suất và nâng cao hiệu quả rừng trồng

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền, mối quan hệ họ hàng các cá thể Dầu Rái trội dự tuyển Trên cơ sở đó phục vụ cho các Nghiên cứu chọn và nhân giống cây

Dầu Rái (Dipterocapus alatus Roxb) nhằm nâng cao năng suất và nâng cao hiệu quả

rừng trồng

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Chọn lọc một số cá thể Dầu Rái có đặc tính tốt từ các quần thể tự nhiên ở ba vùng Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, Nam Trung Bộ làm cây trội dự tuyển

- Ứng dụng marker phân tử để đánh giá sự liên kết di truyền của các quần thể Dầu Rái

- Ứng dụng phần mềm NTSYSpc version 2.1 phân nhóm di truyền theo kiểu gen các quần thể Dầu Rái nhằm xác định các quần thể Dầu Rái có đặc tính tốt

để làm vật liệu ban đầu phục vụ cho công tác lai tạo giống có năng suất cao trong tình hình hiện nay

PHẦN 2 : TỔNG QUAN

2.1 Cây Dầu Rái

2.1.1 Nguồn gốc

Tên khoa học: Dipterocarpus Alatus Roxb Ex G.Don, 1831

Tên đồng nghĩa: Dipterocarpus Phillipiensis Forw 1911

Hình 2.1: Hoa và quả Dầu Rái

Tại Việt Nam, họ Dầu hiện có trên 40 loài thuộc 6 chi (Anisoptera,

Dipterocarpus, Hopea, Parashorea, Shorea và Vatica) Trong đó, chi Dipterocarpus

có 12 loài (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005) Vùng phân bố tự nhiên chính của cây họ dầu là ở miền nam Việt Nam và Tây Nguyên Tuy nhiên cũng có một số loài có thể tìm thấy ở miền Bắc nước ta (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2002)

 Việt Nam

Cây phân bố rộng ở các tỉnh từ Thừa Thiên - Huế trở vào Nam; trên các đảo Phú Quốc (Kiên Giang) và Côn Đảo (Bà Rịa - Vũng Tàu) cũng có Dầu rái mọc Tập

trung nhất ở các tỉnh Đông Nam Bộ: Đồng Nai, Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh Hiện nay được trồng ở nhiều tỉnh phía Bắc như Hà Nội, Nghệ An, Thanh Hóa

 Thế giới

Dầu rái phân bố ở các nước Nam và Đông Nam Á Các nước có Dầu rái phân

bố nhiều là: Lào, Thái Lan, Philippine, Malaysia, Indonesia

2.1.2 Đặc tính thực vật học của cây Dầu Rái

Dầu Rái (Dipterocarpus alatus Roxb) hay còn gọi là Dầu Rái Trắng, Dầu

nước, là loài cây gỗ lớn thường xanh, cao 35 – 45m, có khi đến 70m, đường kính có thể đạt 2m hay hơn, đoạn thân dưới cành lớn hơn 15m Thân thuôn, thẳng, tròn, phân cành cao, tán hẹp, gọn, dầy Vỏ lúc non dày, màu xám trắng, khi già mỏng, màu xám nâu, nứt dọc nhẹ Cành màu nâu đỏ, có vết vòng lá kèm và có lông màu xám hay hung đỏ

Lá đơn mọc cách, mặt trên màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới xanh nhạt có lông mịn, phiến lá hình bầu dục thuôn, kích thước 16-25x5-15cm, đầu nhọn, gốc tù hay hình tim

Ở cây non lá có lông, sau nhẵn; gân bên 18-31 đôi, nổi rõ ở mặt dưới; cuống lá dài 4-8cm, mảnh; lá kèm bao chồi búp màu đỏ dài 15-20cm, rộng 2-4cm, phía ngoài

có lông

Cụm hoa mọc ở nách lá, dạng chùm đơn, có lông, dài 10-18cm, mang 6-8 hoa không cuống Lá đài có ống dài 17mm, phía ngoài có 5 gờ dọc, cánh hoa màu hồng, nhẵn, dài 5cm, nhị nhiều (khoảng 30)

Quả có ống đài bao bọc toàn phần, dài 3-4cm, rộng 2,5-2,8cm, có 5 gờ lớn chạy dọc, khi non màu xanh; trên đầu mang các cánh do lá đài phát triển, với 2 cánh lớn dài 20- 23cm, rộng 3-4cm, có 3 gân gốc màu đỏ, khi già quả và cánh chuyển sang màu cánh gián

Ở nhiều tỉnh miền Nam, nhân dân địa phương thường dùng tên dầu rái để chỉ một số loài cây cho nhựa dầu Ba loài thường bị nhầm lẫn là:

1 Dầu rái (Dipterocarpus alatus Roxb.) đã giới thiệu ở trên

2 Dầu mít hay Dầu cát (Dipterocarpus costatus Gaertn.) Thân giống như dầu rái

nhưng lá nhỏ hơn (chiều dài chỉ 8-14cm, rộng 5-7cm); quả cũng nhỏ hơn và chỉ

có 5 gờ nhỏ chạy dọc theo quả

3 Dầu song nàng hay Dầu nước (Dipterocarpus dyeri Pierre) Có lá rất to, dài đến

40cm hay hơn, quả cũng lớn hơn quả dầu rái và chỉ có 5 gờ ở phần trên của quả, chứ không chạy dọc suốt chiều dài của quả như ở dầu rái và dầu mít

(Nguyễn Quang Bình, 2002)

2.1.3 Cách trồng và khai thác Dầu Rái

2.1.3.1 Trồng và chăm sóc

Trồng rừng Chọn các vùng có đất đỏ nâu trên đá ba zan, đất xám, đất granit

và phù sa cổ dưới rừng thứ sinh nghèo kiệt để trồng rừng là thích hợp Tùy thuộc vào

độ tuổi của cây con (3 tháng tuổi hoặc 14 tháng tuổi) mà áp dụng các biện pháp kỹ thuật khác nhau:

- Trồng cây con 3 tháng tuổi phải áp dụng phương thức nông lâm kết hợp, phát dọn hoặc đốt toàn diện thực bì trước tháng 4 Cày hoặc cuốc toàn diện Hố đào kích thước 30x30x30cm, cự ly 3x4m; mật độ 800-850 cây/ha; giữa 2 hàng Dầu rái trồng xen lúa, đỗ, lạc hoặc sắn Cách gốc Dầu rái 0,5m cần gieo 2 hàng đậu thiều hoặc cốt khỉ để làm cây phù trợ và tăng thêm nguồn đạm cho đất

- Với cây giống 14 tháng tuổi phải trồng theo rạch Chặt bỏ tầng cây phía trên, tận dụng củi và dọn thực bì theo băng, giữ lại lớp thảm tươi cao không quá 4-5m Mở rạch có chiều rộng bằng chiều cao của lớp thảm tươi Kích thước hố 40x40x40cm Mật độ trồng 500-800 cây/ha

Thời vụ trồng sớm nhất vào 15 tháng 7 và kết thúc chậm nhất là 30 tháng 7 (đối với cây con 3 tháng tuổi) Nếu trồng cây con 14 tháng tuổi thì thích hợp nhất vào tháng 5 và tháng 6

Sau khi trồng phải chăm sóc ít nhất 3 năm đầu Năm thứ nhất: hai lần, lần 1 sau khi trồng 2 tháng, lần 2 vào mùa khô, cần làm cỏ và vun gốc Năm thứ hai 3 lần: đầu, giữa và cuối mùa mưa Năm thứ ba: 2 lần vào giữa và cuối mùa mưa Sau khi

trồng 8-10 năm tiến hành tỉa thưa lần đầu

2.1.3.2 Khai thác và chế biến

Dầu con rái hay "dầu trong" ở Việt Nam được khai thác chủ yếu từ loài Dầu rái Đồng bào ở các địa phương phía Nam nước ta đã có tập quán khai thác Dầu rái từ rất lâu đời Khi khai thác, người ta dùng rìu bổ chéo vào thân cây, sâu độ 15-20cm, chiều cao cũng khoảng đó rồi dùng rìu chặt ngang để tách mảng gỗ ra Sau khi nhựa chảy ra sẽ làm bít ống dầu Để cho dầu tiếp tục chảy phải định kỳ đẽo sâu xuống hoặc đốt lửa để kích thích nhựa chảy ra Phương pháp chích nhựa này rất lạc hậu và ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của cây Cần cải tiến phương pháp và kỹ thuật chích nhựa để vừa lấy được nhiều nhựa, vừa có thể duy trì việc chích nhựa lâu năm trên cây

Một cây Dầu rái trưởng thành đường kính 30-40cm, trung bình cho 6-7 kg nhựa/mùa khai thác Mùa chích nhựa là mùa khô

Ở Thái Lan, kỹ thuật khai thác Dầu rái như sau:

Thời gian thu hái: Có thể thu hái quanh năm, nhưng trừ mùa mưa và thời kỳ cây rụng lá (tháng 3-4)

Khu vực khai thác: Do cây Dầu rái thường mọc rải rác nên người thu hái phải chọn khu vực khai thác và đánh dấu các cây mà họ đang và sẽ khai thác Số cây một người có thể nhận khai thác từ 50-500 cây

Chất lượng nhựa: Chất lượng nhựa khai thác được phụ thuộc vào lượng mưa trong khi khai thác, thời gian khai thác và vào các hố khai thác Mỗi lần khai thác, có thể thu được khoảng 10 lít nhựa một cây Trong mùa mưa chỉ thu 6-9 lít.Trung bình mỗi người có thể khai thác đến 432 lít nhựa trong một năm

Kỹ thuật dùng lửa kích thích: Người khai thác dùng rìu đục một hố sâu trên thân cây khoảng 13cm (vào phần gỗ); vết đục không được sâu đến ruột thân Nếu cây

gỗ có đường kính dưới 2m, chỉ được đục 1 lỗ Nếu cây Dầu rái có đường kính lớn hơn 2m, có thể đục 2 lỗ Với cây đục 2 lỗ, thì hố ở trên có thể thu dầu trước 2-5 ngày

và không cần đốt lửa

(Bùi Đoàn, 2002)

2.1.4 Thành phần hóa học Dầu Rái

Dầu rái là loài cây cho loại dầu nhựa (oleo-résin) chủ yếu ở các nước Đông Dương, trong đó có Việt Nam Chất dầu nhựa của Dầu rái chứa 50-70% tinh dầu và 30-40% chất nhựa (resin) Nếu để ở trạng thái tĩnh sẽ phân thành 2 lớp, lớp trên lỏng, màu nâu, trong suốt, lớp dưới đặc quánh có màu trắng đục

Bảng 2.1 Chỉ số chất lượng Dầu Rái

(Nguồn: Tài liệu Lâm sản ngoài gỗ Việt Nam, 2007)

2.1.5 Giá trị kinh tế của cây Dầu Rái

Dầu nhựa được khai thác để dùng trong kỹ nghệ hóa mỹ phẩm, làm sơn, dầu bóng, vec ni, công nghệ in, xảm thuyền và làm đuốc thắp sáng Gỗ màu nâu hồng, có

tỷ trọng 0,62-0,90, dùng đóng đồ và trong xây dựng nhà cửa (Đặng Vũ Hỷ, 1962), Dầu rái đã được cư dân tại một vài địa phương ở miền Nam dùng bôi lên chân để đề phòng bệnh sán vịt khi phải làm việc nhiều ở dưới nước Dầu rái là một cây trồng làm bóng mát rất quan trọng của các tỉnh phía Nam Nhiều thành phố lớn như Thành phố

Hồ Chí Minh, Cần Thơ, Thủ Dầu Một, Buôn Ma Thuật có những đường phố với 2

hàng cây Dầu rái rất đẹp Từ đầu thế kỷ XX, Dầu rái đã được người Pháp mang ra trồng ở Hà Nội (trong vườn Bách Thảo) Sau này những cây Dầu rái trồng ở Miền Bắc, chủ yếu cũng lấy giống từ các cây đó

Một cây Dầu rái trưởng thành đường kính 30-40cm, trung bình cho 6-7 kg nhựa/mùa khai thác Mùa chích nhựa là mùa khô

Đầu thế kỷ XX, hàng năm các tỉnh phía Nam nước ta đã khai thác khoảng 1.000 tấn nhựa Dầu rái

Sau năm 1975, nghề khai thác nhựa Dầu rái vẫn tiếp tục Nhưng một số năm gần đây, số lượng nhựa giảm rất nhanh; nhiều địa phương không còn cây để khai thác

Năm 1998 giá thu mua tại rừng khoảng 0,28 USD/lit dầu; nhưng các công ty sau khi loại bỏ bớt tạp chất đã bán lại giá 1-1,4 USD/lit

(Tài liệu Lâm sản ngoài gỗ Việt Nam, 2007)

2.2 Các khái niệm về đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể

thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng

một loài và giữa các loài khác nhau là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền

trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền

Một biến dị gen xuất hiện ở một cá thể do đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể, ở các sinh vật sinh sản hữu tính có thể được nhân rộng trong quần thể nhờ tái tổ hợp Người ta ước tính rằng, số lượng các tổ hợp có thể giữa các dạng khác nhau của các trình tự gen ở người cũng như ở ruồi giấm đều lớn hơn số lượng các các nguyên tử trong vũ trụ Các dạng khác của đa dạng di truyền có thể được xác định tại mọi cấp

độ tổ chức, bao gồm cả số lượng DNA trong mỗi tế bào, cũng như số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể

Tập hợp các biến dị gen trong một quần thể giao phối cùng loài có được nhờ chọn lọc Mức độ sống sót của các biến dị khác nhau dẫn đến tần suất khác nhau của các gen trong tập hợp gen Điều này cũng tương tự trong tiến hoá của quần thể Như vậy, tầm quan trọng của biến dị gen là rất rõ ràng: nó tạo ra sự thay đổi tiến hoá tự nhiên cũng như chọn lọc nhân tạo

Chỉ một phần nhỏ (thường nhỏ hơn 1%) vật chất di truyền của các sinh vật bậc cao là được biểu hiện ra ngoài thành các tính trạng kiểu hình hoặc chức năng của sinh vật; vai trò của những DNA còn lại và tầm quan trọng của các biến dị gen của nó vẫn chưa được làm rõ

Ước tính cứ 109 gen khác nhau phân bố trên sinh giới thì có 1 gen không có đóng góp đối với toàn bộ đa dạng di truyền Đặc biệt, những gen kiểm soát quá trình sinh hóa cơ bản, được duy trì bền vững ở các đơn vị phân loại khác nhau và thường ít

có biến dị, mặc dù những biến dị này nếu có sẽ ảnh hưởng nhiều đến tính đa dạng của sinh vật Đối với các gen duy trì sự tồn tại của các gen khác cũng tương tự như vậy

(Di truyền y học, 2008; Tổng cục môi trường, 2011)

2.3 Phản ứng chuỗi polymerase PCR

2.3.1 Lịch sử

Phản ứng chuỗi polymerase được viết tắt PCR (polymerase chain reaction) là tiến bộ kỹ thuật đã được ứng dụng rộng rãi trong những năm đầu tiên của thập niên

1990 Kary Mullis người có công lớn trong phát hiện này, đã được nhận giải thưởng

Nobel năm 1993 (Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.3.2 Nguyên tắc chung

Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền

Người ta còn gọi nó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro Ngày nay, PCR được dùng rất

phổ biến trong nhiều lĩnh vực thuộc về sinh học

PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hoá di truyền DNA bằng cách phát

triển primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất (denature) của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo ba trình tự như sau:

Bước 1: Biến tính (Denature):

Thực hiện ở nhiệt độ cao 94 - 950C trong vòng 30 – 60 giây làm cho phân tử DNA mạch kép tách hoàn toàn thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò

là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung

Bước 3 : Kéo dài (Extension)

Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ – 3’ của 2 primer

nhờ hoạt động của polymerase Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA

polymerase hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của

trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Ba giai đoạn này được lặp lại nhiều lần, để tạo mức độ cao trong khuếch đại

Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (940C, 550C, 720C) nên máy nhân gen (themalcycler) phải có tính chất tự động hóa một cách chính xác với sự trợ giúp của Taq (Nguyễn Thị Lang, 2005)

Ba giai đoạn này được lập lại nhiều lần, để tạo mức độ cao trong sự khuyếch đại Sản phẩm PCR được tính theo công thức :

Tổng số DNA khuyếch đại = m x 2 n Trong đó

n là số chu kỳ

m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra

(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Enzym này được chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt độ cao sống ở suối nước nóng (750C) là Thermophilus aquaticus, có hoạt tính tối ưu ở 700C, song nó có thể bền vững tới 940C (Lê Trần Bình và cộng sự, 1997)

2.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR

2.3.3.1 Chọn lựa Primer

Thông thường, người ta cần có mồi (primer) với chuỗi trình tự dài từ 18 nucleotide trở lên Tuy nhiên, tùy theo loại mồi tương hợp với mục tiêu lựa chọn maker phân tử trong xét nghiệm PCR, người ta có những mồi của các maker có tính ngẫu nhiên như RAPD rất ngắn (10-16 mers), hoặc STS maker cần mời có độ dài 20-

24 mers Tuy nhiên, DNA không phải là một chuỗi mã của những nucleotide một cách ngẫu nhiên, mà nó còn có đặc tính của những họ gen (gene families), những nguyên tố có tính lập lại, sự lập đoạn đơn giản hay những chuỗi mã lập lại phức tạp Tùy theo loài sinh vật, và tùy theo cách thể hiện của chuỗi dây đơn làm nền (template), người ta sẽ thiết kế chuỗi trình tự của mồi và kiểm tra chuỗi trình tự rất cẩn thận so với dữ liệu lưu trữ trước đây, nhằm loại trừ các sai sót về kỹ thuật (Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.3.3.2 Khuông DNA

Khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, khi các đoạn khuôn không sạch còn lẫn protein, hiệu quả PCR giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn (Nguyễn Cao Quan Bình, 2007)

2.3.3.3 Nhiệt độ trong quá trình annealing

Lê Đình Lương và Quyền Đình Thi (2004) đã đề nghị một công thức để ước đoán nhiệt độ “Tm”, mà ở nhiệt độ ấy, một nửa các mồi sẽ được phản ứng annealing

với chuỗi trình tự mục tiêu Công thức được sử dụng trong điều kiện mồi có khoảng

20 oligonucleotide

Tm = 4 (G + C ) + 2 (A + T ) Trong đó: A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide

Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nhận tần suất đa hình cao

nhất

2.3.3.4 Phản ứng dung dịch đệm

Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định là nồng độ Mg2+, kể cả về tác dụng chuyên biệt và kết quả PCR Môi trường có tính chất ion như vậy làm cho dung dịch đệm trở nên năng động hơn rất nhiều Do đó nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra ảnh hưởng rất khác nhau trong phản ứng PCR Nồng độ cao của Mg2+ sẽ làm cho phân tử DNA dây đôi ổn định hơn, và ngăn ngừa sự biến chất hoàn toàn (sự

mở dây để cho dây đơn) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho kết quả PCR ít đi Lượng dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng “annealing giả” xảy ra tại những vị trí không đúng của dây đơn, cho ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn, nhưng mức độ chuyên tính rất thấp (Oste 1989 )(trích từ Nguyễn Thị Lang, 2005)

Môi trường đệm KCl đã và đang được áp dụng rộng rãi, cũng có thể là buffer rất hữu dụng cho kỹ thuật PCR Tuy nhiên, trong một vài loci, người ta thấy môi trường đệm này rất khó dùng cho khuyếch đại sản phẩm, chỉ trừ Mg2+ đã được lựa chọn

PH của dung dich đệm cũng được xem xét trong kỹ thuật PCR Hầu hết các dung môi phản ứng được đệm trong môi trường 10-50 mM Tris-HCL ở pH = 8,3, nhiệt độ 200C Tuy nhiên, pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng Theo chu kỳ nhiệt độ của PCR, pH sẽ thay đổi từ 7,8 đến 6,8 Với khoảng giá trị như vậy, pH được xem như tạm chấp nhận (Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.3.3.5 Nồng độ dNTP (deoxyribonucleotic triphosphate)

Người ta đã khuyến cáo rằng mỗi deoxynucleotide được sử dụng là 200 µM Lượng thừa đầu tiên của deoxynucleotide tương ứng theo 100 ng DNA của dây đơ) nồng độ của nó phải là một hằng số không đổi (constant) Nồng độ ban đầu là 200

µM, nồng độ dNTP sau cùng sẽ tạo thành một lượng thừa, ngay cả khi 50 % của nó bị phân hủy trong quá trình chuyển biến của chu kỳ nhiệt Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ tất cả các deoxynucleotide bằng nhau để tránh sự kết gắn nhầm lẫn (Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.3.3.6 Nồng độ primer

Lượng dư thừa của mồi tương ứng với dây nền (template) là nồng độ mồi cần thiết, nó phải là hằng số 95 % các phân tử đầu tiên của mồi vẫn còn duy trì sau 30 chu kì Trong hầu hết các ứng dụng PCR, hai primer F và R đều phải có nồng độ bằng nhau Nồng độ sau cùng của mỗi primer là 0,1 µM Nồng độ này phải được điều chỉnh thành 0,5 µM, tùy thuộc vào locus nào đó cần được khuếch đại (Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.3.3.7 Tỷ lệ primer : template

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo của primer

và template Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimers sẽ xuất hiện, giống như trường hợp mẫu DNA quá loãng Nếy tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều

Hầu hết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không vượt quá giá trị 0,5 µM, không tính đến biến động template DNA để tránh hiện tượng

primer-dimers (Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.4 Vai trò của Marker phân tử đối với chọn giống thực vật

2.4.1 Marker phân tử có tính chất di truyền

Marker phân tử thể hiện sự khác nhau về mặt di truyền giữa các cá thể hay các loài riêng lẻ Chúng không đại diện cho gene đích nhưng hoạt động như một dấu hiệu và được định vị gần với các gene đích Những marker như vậy không ảnh hưởng đến kiểu hình của tính trạng quan tâm vì chúng chỉ định vị gần hay liên kết

với gene kiểm soát tính trạng Tất cả các marker phân tử giữ một vị trí chuyên biệt trong genome trên nhiễm sắc thể gọi là “loci” Có ba loại marker chính:

- Marker hình thái là những tính trạng hay đặc tính về kiểu hình, nhìn thấy được bằng mắt thường như màu sắc hoa, kích thước hạt, màu da

- Marker hóa sinh bao gồm sự khác nhau về alen của các enzyme gọi là isozyme, là sự khác biệt trong enzyme được phát hiện nhờ điện di và nhuộm màu chuyên biệt

- DNA marker thể hiện những vị trí khác nhau trong genome được sử dụng rộng rãi nhất nhờ sự phong phú của nó Chúng xuất phát từ các loại đột biến khác nhau của DNA như đột biến điểm, đột biến chèn hay mất đoạn, hay lỗi trong quá trình sao chép của DNA được lặp lai một cách có thứ tự (Paterson A.H.,1996) Những marker này trung tính chọn lọc vì chúng luôn định vị trong những vùng không mã hóa của DNA Không giống với marker hình thái và sinh hóa, DNA marker không bị giới hạn về số lượng và không chịu tác động bởi các yếu tố môi trường hay các giai đoạn phát triển của thực vật Các DNA marker tách biệt như vậy được sử dụng trong xây dựng bản đồ liên kết gene nhằm ứng dụng trong chọn giống thực vật (Winter P.,and Kahl G., 1995)

Bất lợi chính của các marker hình thái và hóa sinh là chúng bị giới hạn trong

số lượng và bị tác động bởi các yếu tố môi trường hay các giai đoạn phát triển của thực vật Mặc dù có những hạn chế, nhưng các marker hình thái và hóa sinh rất hữu ích trong chọn giống thực vật

DNA marker được phân chia rộng thành ba nhóm dựa vào phương pháp phát hiện chúng: Marker dựa trên cơ sở của phản ứng PCR và marker dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò, lai DNA và marker dựa trên trình tự DNA Về bản chất, DNA marker thể hiện sự khác nhau về mặt di truyền có thể xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật điện di và nhuộm màu với chất hóa học (Ethidium bromide hay bạc) hay phát hiện với phóng xạ hay probe nhuộm màu DNA marker có công dụng đặc biệt nếu chúng thể hiện sự khác biệt giữa các cá thể cùng loài hay khác loài Những marker này gọi

là marker đa hình, ngược lại những marker không phân biệt giữa các kiểu gen được gọi là marker đơn hình Những mô tả này dựa trên khả năng có hay không sự phân

biệt giữa đồng hợp tử và dị hợp tử Codominant marker chỉ ra sự khác biệt về kích thước, ngược lại dominant marker chỉ sự có mặt hay vắng mặt Nói đúng ra, các dạng khác nhau của DNA marker (như các band kích thước khác nhau trên gel) được gọi là marker “alen” Codominant marker có thể có nhiều alen khác nhau, ngược lại một dominant marker chỉ có hai alen (Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005; Jones N., OughamH., and Thomas h., 1997)

Nguồn: Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005

Hình 2.2: DNA marker giữa các kiểu gene A, B, C, D

Các marker đa hình được đánh dấu bằng mũi tên Các marker không phân

biệt được giữa các kiểu gen được gọi là các marker đơn hình (a) Các SSR marker thể hiện sự khác biệt về kích thước cho những alen của 4 kiểu gene và thể hiện một locus

di truyền đơn (b) Các marker được tạo thành bằng kỹ thuật RAPD.Những marker này thể hiện sự có mặt hoặc vắng mặt Thông thường, kích thước của những marker này được xác định dựa vào trọng lượng phân tử của thang DNA chuẩn (molecular

weight DNA ladder) Trong 4 maker đa hình, chỉ có hai alen khác nhau

Nguồn: Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005

Hình 2.3: So sánh giữa (a) codominant marker và (b) dominant marker

Codominant marker có thể phân biệt rõ ràng giữa đồng hợp tử và dị hợp tử, ngược lại dominant marker thì không Kiểu gene tại hai marker loci (A và B) được viết bên dưới bản gel

Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể Những tính trạng này được xác định trên nhiễm sắc thể tuỳ thuộc vào mức độ liên kết của nó Sự sắp xếp một cách độc lập các nhiễm sắc thể giúp cho việc định vị của loci trong các nhóm liên kết gen Sự xuất hiện của hiện tượng quấn chéo (crossing cover) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự của các loci trong nhiễm sắc thể Khoảng cách di truyền trên bản

đồ được đo bằng tần số tái tổ hợp gen (recombinations) Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ được kiên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được-gen đó có thể xem như là marker gen (Nguyễn Thị Lang, 2005)

Bảng 2.2: Các loại DNA markers thông dụng

RFLP Restriction fragment length polymorphism

AFLP Amplified fragment length polymorphism

SSR Simple sequence repeat (microsatellite)

SSCP Single strand coformation polymorphism

MRDHV - DNA Moderately repeated, dispersed, and highly

variable DNA (minisatellite)

Nguồn: Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2002

DNA marker đã được chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần “isozyme marker” (Tanksley và ctv 1980) Việc

áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và tương lai sẽ rẻ tiền hơn nhờ sự cải tiến không

ngừng của các nhà khoa học

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như là một DNA marker Các

DNA markers có thể được chia thành hai nhóm như sau:

- PCR - based: ALP, AFLP, SSR, SSCP

- DNA/ DNA hybridization-based: RFLP, minisatellite

Các markers thuộc nhóm PCR-based có thể được chia nhỏ thành:

2.4.2 So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử trong chọn giống thực vật

Các loại marker phân tử thường được sử dụng trong chọn giống thực vật là:

- RFLP là marker có tính chất đồng trội và rất đáng tin cậy Kỹ thuật này sử dụng cDNA hoặc thể probe, được đánh dấu bằng phóng xạ, và sự phân cắt hạn chế của enzyme

- RAPD là một dạng marker DNA được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR Mức độ khuếch đại cao nhờ mồi cặp mồi đơn giản, ngắn, được thiết kế ngẫu nhiên (10 mer) Đây là marker có tính trội (dominant)

- STS là marker được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20 – 24 mer), có tính chất đồng trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đôi khi nó cũng thể hiện tính trội Đây là phương pháp có thể phải sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp sự

đa hình không thể hiện rõ

- Microsatellite hoặc SSR là marker được thiết kế từ những vệ tinh có chuỗi

ký tự giản đơn, lặp lại nhiều lần Cặp primer được thiết kế từ trước và sau những vệ tinh như vậy Marker có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá nhạy, với các kiểu lặp lại “dinucleotide” hoặc “trinucleotide” (GA, GT, CAT, CTT)

- AFLP là một dạng trong những marker dựa trên cơ sở PCR, theo cách chọn lọc của hai adaptor (là những enzyme phân cắt hạn chế) Nó phối hợp cả hai tính chất của RFLP và RAPD, nên có khả năng phát hiện đa hình rất tốt Nhưng nó thường có tính chất trội nên gặp hạn chế khi thể hiện alen lặn

Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể như những ưu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể được so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí sau:

Bảng 2.3 : So sánh một số kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử

Khả năng đáng tin cậy Cao Cao Biến đổi Cao Cao

(Nguồn: Nguyễn Thị Lang, 2005)

2.5 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền

2.5.1 Sơ lược về RAPD marker

Hình 2.4: Phản ứng PCR RAPD

(Nguồn: David James and Henri Loréal, 2005)

2.5.1.2 Ưu nhược điểm của phương pháp RAPD marker

Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch quá cao Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền

và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Kỹ thuật RAPD có độ chính xác tương đối, ít ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy thấp Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp

2.5.2 Các bước thực hiện chủ yếu của kỹ thuật RAPD

- Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu

- Thực hiện phản ứng nhân gen qua PCR với các mồi đặc trưng cho các đoạn

đơn giản

- Điện di kết quả trên gel agarose và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và

khác nhau giữa các đoạn lặp DNA

- Xử lí số liệu bằng phần mềm map marker progam, SYSTAT, NTSYSpc,…lập

bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại (dendrogram)

2.6 Một số công trình nghiên cứu khoa học có liên quan

2.6.1 Một số nghiên cứu trên thế giới

Yanti Rachmayanti và ctv đã nghiên cứu thành công qui trình ly trích DNA

tổng số từ cây họ Dầu (Dipterocarppaceae) (2006)

Lee và cộng sự sử dụng chỉ thị Isoenzyme cho loài Shorea lepprosula dựa trên

8 quần thể tự nhiên có phân bố khắp malaysia và 9 locus đồng men cho thấy mức độ

đa dạng di truyền đặc biệt cao (2000) Và một số nghiên cứu khác của Lee và cộng sự

cũng trên đối tượng Shorea lepprosula và một số đối tượng khác như Hopea

bilitonensis và S parvifolia…

Lee và cộng sự đã so sánh hai loại chỉ thị RAPD và isozyme để đánh giá đa

dạng di truyền cho loài Shorea leprosula và cho thấy có sự tương đồng và khác biệt

khi sử dụng hai loại chỉ thị này Đây cũng là nhận xét có ý nghĩa giúp các nhà nghiên cứu lý giải đúng hơn về các kết quả thu được

Lee và cộng sự, 2004, đã chiết tách và mô tả thành công 15 locus

microsatellite đa hình cho loài cây Hopea bilitonensis

Đối với cây họ Dầu, việc sử dụng chỉ thị AND genome váo nghiên cứu đa dạng di truyền và phát sinh loài củng đã được một số tác giả công bố (Daynandan S,

Ashton P.S, 1999, Lee S.L, , 2001)

2.6.2 Một số nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thúy Hạnh, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005, Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus ( họ Dipterocapaceae) trong đó có cây Dầu rái dựa trên chỉ thị phân tử là RAPD, và DNA lục lạp đã cho kết quả là tất cả 12 loài đều có độ đa hình trên 64% ( kết quả khi phân tích bằng RAPD), còn kết quả khi phân tích bằng DNA lục lạp thì mức độ đa hình thấp Từ đó tính được

mức độ tương đồng di truyền giao động từ 0,18 – 0,41

Nguyễn Hoàng Nghĩa và cộng sự, 2005, Mối quan hệ di truyền của một số loài cây họ Dầu tại Việt Nam dực vào RAPD và phân tích cpDNA được nghiên cứu trên

17 cây họ Dầu thuộc 6 chi của Dipterocarpaceae Kết quả đạt được: Dựa vào sự đa hình hệ gene DNA của các loài sử dụng RAPD cho thấy từ 68,97% đến 83,78% các band là những band đa hình, và đều có tỉ lệ đa hình cao hơn 68% Cùng với phân tích cpDNA, kết quả cho thấy các loài họ dầu được nghiên cứu rất khác nhau về di truyền

Những hoạt động gần đây là phát hiện và nghiện cứu các giống lai tự nhiên, tạo giống lai nhân tạo, nhân giống hom và nuôi cấy mô phân sinh, cũng như ứng dụng chỉ thị phân tử vào cải thiện giống cây rừng Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung vào

các giống cây nhập nội, mọc nhanh như keo (Accia), keo lai (Acacia hybrid), bạch đàn (Eucalyptus), lát hoa (Chukrasia), thong (Pinus), (Lê Đình Khả và công sự,

2000)