PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Chọn và thu mẫu cây trội dự tuyển và cây trội 3.3.1.1. Chọn lâm phần rừng
Chọn lâm phần rừng có Dầu Rái phân bố tự nhiên hoặc rừng trồng tập trung hay rải rác và kể cả những cây đường phố: yêu cầu có nguồn gốc địa lý rõ rang, đang trong thời kỳ sinh trưởng tốt, sức sống khỏe, độ tuổi từ 15 – 80 năm tuổi thuộc các tỉnh thành đại diện cho 3 vùng sinh thái Đông Nam Bộ, Nam Trưng Bộ, Tây Nguyên.
3.3.1.2. Chọn cây trội
Số lượng cây trội dự kiến là 60 cây. Phương pháp điều tra chọn cây trội dựa vào các tiêu chuẩn chọn cây trội trong “Quy phạm xây dựng rừng giống, vườn giống (QPN 15 – 93) của Bộ NN & PTNT (1993)”
Tiêu chuẩn đánh giá cây trội là cây ở tuổi thành thục công nghệ, sinh trưởng nhanh, đoạn thân dưới cành dài, thân cây thẳng tròn đều, không xoắn vặn, cành nhánh nhỏ, gốc phân cành lớn, tán lá phát triển cân đối, khỏe mạnh, không bị sâu bệnh (cây trội dự tuyển)
28
Cây trội chính thức: Đối với rừng đều tuổi thì cây trội là cây có chỉ tiêu chọn giống trực tiếp theo mục tiêu kinh tế vượt trị số trung bình của đám rừng hoặc các lâm phần ít nhất là 1,5 - 2 lần độ lệch chuẩn (tức X bình quân >= 1,5 đến X bình quân + 1).
Riêng đối với rừng tự nhiện và cây phân tán khác tuổi, cây trội sẻ được đánh giá theo phương pháp quan sát.
Quản lí cây trội: Cây trội sẻ được ghi chép đầy đủ thông tin vào phiếu theo mẫu chung, được đánh dấu sơn, đánh số theo hệ thống chung và quản lí cây trội bằng sơ đồ.
3.3.1.3. Chọn xuất xứ khảo nghiệm:
Số lượng xuất xứ chọn là 6 xuất xứ, nơi thu mẫu vật liệu giống để khảo nghiệm xuất xứ là các tỉnh có Dầu Rái phân bố tự nhiên (ưu tiên rừng tự nhiện), phải đại diện cho vùng sinh thái, trong đó yếu tố quan trọng được chú ý là độ cao, kinh dộ, vĩ độ. Kết cấu lâm phần rừng càng đồng nhất càng tốt, tỷ lệ cây trong lâm phần tương đối lớn, điều kiện lập địa không có những biến đổi lớn, tuổi cây không sai khác nhau nhiều.
Tại mỗi lâm phần rừng được chọn , chọn những cây tốt nhất để làm giống (cây mẹ), mỗi lâm phần rừng chọn từ 3 cây mẹ trở lên, khoảng cách giữa các cây lấy giống không được quá gần nhau.
3.3.1.4. Ly trích DNA
Quy trình ly trích DNA được tiến hành theo phương pháp của Doyle and Doyle và cộng sự (1987), được cải biên một số thành phần hóa chất cho phù hợp với đối tượng là cây Dầu theo Li J. T. và cộng sự (2007).
- Cân lượng mẫu khoảng 100mg
- Nghiền mịn mẫu với nitơ lỏng bằng bộ cối chày rồi cho vào tip 1.5ml
- Thêm 600l dung dịch đệm rửa WB, lắc liên tục trong đá trong 5 phút. Sau đó li tâm lạnh 40C 10000v/phút trong 10phút, lấy phần cắn.
- Thêm 600l dung dịch đệm chiết EB, ủ lắc ở 600C trong 1giờ.
- Ly tâm lạnh 40C 10000v/phút trong 10phút, sau đó lấy dịch nổi sang tip mới.
29
- Thêm đồng lượng 600l Chloroform: Isoamylalcohol=24:1 , lắc mạnh trong 1 phút.
- Ly tâm lạnh 40C 10000v/phút trong 10phút, sau đó lấy dịch nổi sang tip mới.
- Thêm đồng lượng 600l Chloroform: Isoamylalcohol=24:1 , lắc mạnh trong 1 phút.
- Ly tâm lạnh 40C 10000v/phút trong 10phút, sau đó lấy dịch nổi sang tip mới - Cho vào 2/3 thể tích isopropanol , lắc đều, ủ ở -200C trong 1giờ, sau đó li tâm
lạnh 40C 12000v/phút trong 30phút, rồi bỏ isopropanol lấy phần cắn.
- Rửa cắn với 600l ethanol 70%, sau đó ly tâm lạnh 10000v/phút trong 5 phút,thực hiện rửa cắn 2 lần, để khô cồn.
- Hoà tan cắn trong 50l dung dịch bảo quản đệm TE0.1
3.3.2. Kiểm tra chất lượng DNA 3.3.2.1. Kiểm tra bằng gel
Kiểm tra dịch chiết DNA bằng điện di trên gel 1% và đọc kết quả dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và xem qua máy đọc gel. Mẫu DNA có độ nguyên vẹn cao khi trên bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với khích thước lớn. (Nguyễn Thị Lang, 2002).
3.3.2.2. Kiểm tra bằng đo OD
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu.
- Hỳt 1àl dịch chiết DNA, pha loóng với 90àl nước cất, tiến hành đo quang ở bước song 260nm và 280nm.
- Cứ một Đơn vị OD260nm tương ứng nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.
- Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau:
CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha loãng.
30
- Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm).Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số :
OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 – 2 3.3.3. Phản ứng PCR
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với các SSR primer RAPD tuyển chọn được, dựa trên chương trình nhiệt và các thành phần hóa chất được nêu ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất cho một mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Dung tớch (àl)
PCR buffer 10X 1X 2.5
DNTP 10mM 0.3 mM 0.75
Taq polymerase 5U/àl 1U 0.2
Primer 10mM 0.8mM 2
MgCl2 25mM 3mM 3
DNA 300ng/àl 1
Nước cất hai lần 15.55
Tổng cộng 25
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Hoạt động Số chu kỳ
95 2 Tách 2 sợi DNA 1
95 37 72
1 3
Tách 2 sợi DNA Gắn đoạn mồi Sinh tổng hợp
35
72 10 Sinh tổng hợp 1
4 Trữ mẫu
31
Sản phẩm PCR được kiểm tra kích thước bằng điện di trên gel agarose 2.5%, trong dung dịch đệm TBE 0.5X, dưới hiệu điện thế 200V trong 90 phút. Sau đó, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút và các băng DNA được quan sát dưới tia UV.
3.3.4. Quy trình điện di 3.3.4.1. Chuẩn bị gel
Khay điện di được đặt lược sẳn ở một đầu khay. Sử dụng lược có số răng là 15.
Khay được đặt ở nơi bằng phẳng.
Gel sử dụng chạy điện di sản phẩm PCR với nồng độ 3%.
Gel sử dụng kiểm tra DNA với nồng độ 1%
Cân agrarose cho vào chai thủy tinh, thêm Bufer TE, Lắc chai cho agrarose hòa tan vào Buffer TE, sau đó đem nấu trong microwave (nấu cho agrarose hòa tan hoàn toàn , agrarose sau khi nấu xong để nguội khoảng 600C rồi đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay dung dịch sẽ tự trải đều khay, gắng lược vào khay. Sau khi gel đặc lại, ta dùng tay lấy lược ra nhưng phải cẩn thận tránh bị bể gel.
Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di phủ mặt gel khoảng 2mm.
Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel 3.3.4.2. Load mẫu
Đầu tiên hút dung dịch loading buffer trong thành phần có chứa glycerol có tỷ trọng cao sẽ kéo DNA nằm trong giếng không bị trôi ra ngoài trong khi load mẫu) và nhỏ thành từng giọt nhỏ 1àl ra giấy paraflim.
Hỳt 5àl dung dịch mẫu DNA trộn đều với dung dịch loading buffer và tiến hành load mẫu vào giếng của gel. Bắt đầu load từ giếng thứ 2, giếng thứ nhất dùng để load thang DNA chuẩn. Tiếp tục load mẫu DNA vào các giếng kế tiếp.
Sau khi load xong ta đậy nấp bể điện di lại và tiến hành chạy điện di.
32
Bảng 3.5: Thông số điều kiện điện đi
Điều kiện Thông số
Hiệu điên thế 200 V
Công xuất 300 W
Cường độ dòng điện 3 A
Thời gian (điện di sản phẩm PCR) 90 phút
Thời gian (điện di DNA mẫu) 30 phút
Điện di trong 90 phỳt. Khi phẩm màu bromophenol blue di chuyển khoảng ắ khoảng cách trên từ giếng, tắt điện, lấy gel ra khỏi hộp điện di.và ngâm vào dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong thời gian 30 phút có tác dụng đánh dấu phân tử DNA, hóa chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất.
rồi chụp hình bằng máy chụp gel