PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.2. Kết quả nghiên cứu quan hệ di truyền bằng kỹ thuật RAPD
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 300ng/μl và tiến hành các phản ứng RAPD với 7 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây.
39
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng 7 mồi ngẫu nhiên (OPU4, OPU5, OPU9, OPB6, OPB12, OPC9, OPD2) để phân tích mối quan hệ di truyền của 22 mẫu Dầu rái.
Sản phẩm RAPD – PCR với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 2.5% để phân tích tính đa hình DNA của 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu.
Hình 4.2: Sản phẩm PCR của mồi OPB12
Chú thích: giếng 2,3,4,5 tương ứng BD1, BD2, BD3, BD4.
Giếng 8, 9,10, 11 tương ứng BT1, BT2, BT3, BT4
Hinh 4.3: Sản phẩm PCR của mồi OPU9
Chú thích: giếng 5 , 6, 7, 8 tương ứng CP1, CP2, CP3, CP4 Giếng 10, 11, 12 tương ứng ES1, ES2, ES3
40
Phân tích RAPD với 7 mồi ngẩu nhiên kết quả thu được, số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 60 đến 112 band. Kích thước các band DNA được nhân bản trong khoảng từ 500bp đến 1500bp.
Tổng số band DNA nhân bản được của 7 mồi RAPD khi phân tích 22 mẫu Dầu rái là 586 band. Kết quả thể hiện trên bảng 4.2.
Từ bảng 4.2 cho thấy, trong số 7 mồi phân tích, số phân đoạn DNA được nhân bản của 22 mẫu Dầu rái ở mồi OPU5 là nhiều nhất (112 band DNA) và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi OPU9 (60 band DNA).
Đối với từng mẫu thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau. Tổng số band DNA được nhân bản của 22 mẫu Dầu rái dao động từ 19 phân đoạn đến 34 phân đoạn.
Từ phân tích bảng 4.2 cho thấy, mẫu có tổng số band DNA được nhân bản với 7 mồi nhiều nhất là giống CP4 (34 band), và mẫu có tổng số band DNA được nhân bản với 7 mồi ít nhất là mẫu BD4 (19 band).
Bảng 4.2 : Tổng số band DNA của sản phẩm RAPD với 7 mồi ngẩu nhiên Mồi
Giống OPU4 OPU5 OPU9 OPB6 OPB12 OPC9 OPD2 Tổng
CT1 3 5 3 0 2 4 9 26
CT2 1 6 4 2 3 5 9 30
CT3 1 6 4 4 4 2 6 27
CT4 1 4 3 1 3 5 7 24
DMC2 1 6 0 4 1 2 7 21
DMC3 2 6 1 4 1 3 8 25
DMC4 2 4 4 5 2 2 9 28
CP1 4 5 4 4 7 5 3 32
CP2 4 4 4 3 7 4 4 30
CP3 4 3 4 2 6 7 2 28
CP4 4 7 4 9 5 4 1 34
41
ES2 3 5 5 4 6 4 3 30
ES3 3 5 3 3 7 2 2 25
ES5 3 5 4 1 8 5 0 26
BD1 4 6 1 2 5 2 5 25
BD2 5 7 1 2 6 2 4 27
BD3 1 7 2 4 7 3 5 29
ĐD4 3 5 0 0 4 4 3 19
BT1 6 2 1 1 9 3 4 26
BT2 4 5 2 2 6 1 3 23
BT3 1 4 3 7 7 3 2 27
BT4 4 5 3 6 1 2 3 24
Tổng 64 112 60 70 107 74 99 586
Tính đa hình được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các band DNA khi so sánh giữa các mẫu Dầu rái với nhau trong cùng 1 mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ band đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu. Kết quả tổng hợp trên bảng 4.3.
Bảng 4.3 : Tỉ lệ số band đa hình của sản phẩm RAPD với 7 mồi ngẩu nhiên
Stt Primer Tổng số phân đoạn
Số phân đoạn đa
hình
Kích thước band (bp)
Tỷ lệ phân đoạn đa hình %
1 OPU4 11 11 800 – 1500 100
2 OPU5 12 12 500 – 1350 100
3 OPU9 9 9 800 – 1400 100
4 OPB6 13 13 700 – 1400 100
5 OPB12 18 18 400 – 1400 100
6 OPC9 15 15 500 – 1500 100
7 OPD2 14 14 500 – 1500 100
Tổng 92 92
42
Qua phân tích bảng 4.3 nhận thấy, tổng số band DNA của 22 mẫu Dầu rái khi phân tích 7 mồi ngẫu nhiên là 92 phân đoạn, trong đó 92 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 100%) và không đa hình là 0 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 500 đến 1500 bp. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng từ 9 đến 18 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạn DNA nhất là mồi OPU9 (9 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi OPB126 (18 phân đoạn).
Bảng 4.3 cũng cho thấy, tất cả 7 mồi ngẩu nhiên đều cho tỉ lệ đa hình rất cáo, tỉ lệ đa hình ở tất cả các mổi đều 100%
Giá trị PIC (Polymophism Information Content) được sử dụng khi phân tích thông tin đa hình. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại.
Bảng 4.4 : Thông tin đa hình PIC của 22 giống Dầu rái
Stt Mổi PIC PIC
trung bình
1 OPU4 0.845
0.877
2 OPU5 0.901
3 OPU9 0.818
4 OPB6 0.873
5 OPB12 0.914
6 OPC9 0.885
7 OPD2 0.905
Tính đa hình của các mồi RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại. Từ bảng 4.4 cho thấy, giá trị PIC dao động từ 0,818 (mồi OPU9) đến 0,914 (mồi OPB12), trong đó, tất cả 7 mồi RAPD đều cho kết quả đa hình cao, với giá trị PIC > 0,5, (số liệu bảng 4.4 phù hợp với tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA được nhân bản ở bảng 4.3). Sự đa hình của
43
các mồi tỷ lệ thuận với số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản. điều này cho thấy mức độ đa dang kiểu gen 22 mẫu Dầu rái chúng tôi nghiên cứu là rất cao.
44
45
Coefficient
0.49 0.59 0.70 0.80 0.90 1.00
DMC1MW
CT1 DMC2 DMC3 CT2 CT3 CT4 DMC1 CP1 ES2 CP2 CP4 CP3 ES3 ES1 BD1 BD2 BD3 BT1 BT3 BD4 BT2 BT4
Hình 4.4: Sơ đố biểu diền quan hệ di truyền 22 giống Dầu rái
Sơ đồ hình cây tính theo thuật toán Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA đã chỉ ra mức độ sai khác di truyền giữa 22 mẫu Dầu rái. Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các mẫu. Các mẫu có hệ số di truyền giống nhau tương tự sẽ được xếp thành một nhóm, giữa các nhóm lại có sự liên hệ với nhau.
Phân tích kết quả từ bảng 4.5 và hình 4.4 cho thấy hệ số tương đồng di truyền của 22 mẫu Dầu rái với 7 mồi ngẫu nghiên dao động từ 0.45 đến 1. Ba mẫu BD1, BD2, BD3 cùng ở Bình Định có hệ số di truyền cao nhất là 1.
III
II
I
II B
IIA IIIA IIIB
46
Biểu đồ hình cây tạo được khi phân tích 22 mẫu Dầu rái với 7 mồi ngẩu nhiên chia làm 3 nhóm chính:
Nhóm I: Bao gốm 2 mẫu BT2 và BT4 đều có xuất sứ tại Bình thuận, hai mẫu này có hệ số tương đồng là 0.72 và có hệ số sai khác di truyền so với các mẫu thuộc nhóm II là 47% (1-0.53) và nhóm III là 50% (1-0.50).
Nhóm II: Gốm 13 mẫu ( CP1, CP2, CP3, CP4, ES1, ES2, ES3, BD1,BD2, BD3, BD4, BT1, BT3) chia thành hai nhóm phụ gồm phụ (IIA, IIB).
o Nhóm phụ IIA: Gồm gồm 6 mẫu (BD1, BD2, BD3, BD4, BT1, BT3) thuộc hai tỉnh Bình Định và Bình Thuận là các mẫu đươc chọn đại diện cho vùng địa lý Nam Trung Bộ chia thành 2 cụm
- Cụm I: Chỉ gồm một mẫu BD4 có hệ sồ tương đổng di truyền với cụm II là 0.61
- Cụm II: Gồm 5 mẫu là BT1, BT3 và BD1, BD2, BD3 được chia thành hai cặp có hệ số tương đồng cao trong đó 3 mẫu BD1, BD2, BD3 có hệ số tương đồng di truyền là 1. Hai mẫu BT1 ,BT2 có hệ số tương đồng di truyền là 0.95.
o Nhóm phụ IIB: gốm 7 mẫu ( CP1, CP2, CP3, CP4, ES1, ES2, ES3) thuộc hai tỉnh Gia Lai và Đắk Lắk là các mẫu được chọn đại diện cho vùng địa lý Tây nguyên. Các mẫu này có hệ số tương đồng di truyền với nhau cao trong khoảng từ ( 0.80 đến 0.94).
Nhóm III: Gốm 7 mẫu (CT1, CT2, CT3, CT4, DMC1, DMC2, DMC3) thuộc hai tỉnh Đồng Nai và Tây Ninh, là các mẫu đại diện cho vủng địa lý Đông Nam Bộ. các nhóm này được phân nhóm thành một nhóm riêng có hệ số sai khác di truyền so với nhóm I và nhóm II là 50% (1 -0.50) được chia thành hai nhóm phụ IIIA và IIIB.
o Nhóm phụ IIIA: chỉ gốm một mẫu DMC1 có hệ số sai khác di truyền so với nhóm phụ IIIB là 42% (1 -0.58).
o Nhóm phụ IIIB: Gồm 6 mẫu (CT1, CT2, CT3, CT4, DMC2, DMC3) được chia thành hai cụm .
47
- Cụm I: Gồm hai mẫu là CT3 và CT4 có hệ số tương đồng di truyền là 0.67 và có hệ số sai khác di truyền với cụm II là 34% (1 – 0.66).
- Cụm II: Gồm 4 mẫu CT1, DMC2, DMC3, CT2 có hệ số tương đồng di truyền lần lược là 0.88, 0.72, 0.69.
Qua phân tích kết quả phân nhóm chùng tôi nhận thấy 22 mẫu dầu rái nghiên cứu được chia ra thành 3 nhóm riêng biệt đại diện cho 3 vùng địa lý khác nhau. Vùng Đông Nam Bộ được phân ra thành một nhòm Riêng với độ sai khác di truyền vời các nhóm khác là 50%. Vùng Tây Nguyên được phân ra thành một nhóm riêng biệt tuy nhiên có hệ số tương đồng gần với nhiều mẫu thuộc vùng Nam Trung Bộ hệ số di truyền nằm trong khoản (0.58 – 0.76). Vùng Nam Trung Bộ có hai mẫu (BT2, BT4) có độ sai khác lớn so với các vùng khác củng được phân ra thành một nhóm riêng.
Từ kết quả phân nhóm trên chúng tôi nhận thấy tính đa hình của 22 mẫu Dầu rái nghiên cứu trong phạm vi phân tích 7 mồi ngẫu nhiên bằng phản ứng RAPD – PCR đã chứng minh cho sự khác nhau trong cấu trúc DNA giữa các mẫu Dầu rái được chon nghiên cứu. Dầu rái là cây tự thụ phấn cho nên hệ gen rất bảo thủ, tuy vậy hệ số sai khác giữa các giống nghiên cứu tương đối thấp nên ta có thể dùng các mẫu này làm giống, thiết kế các tộ hợp lai phục vụ cho việc lai tạo giống mới theo nguyên tắc lấy các giống có hệ số sai khác di truyền xa nhau dùng lai với nhau sử dụng ưu thế lai.
48