2.4. Vai trò của Marker phân tử đối với chọn giống thực vật
2.4.1. Marker phân tử có tính chất di truyền
Marker phân tử thể hiện sự khác nhau về mặt di truyền giữa các cá thể hay các loài riêng lẻ. Chúng không đại diện cho gene đích nhưng hoạt động như một dấu hiệu và được định vị gần với các gene đích. Những marker như vậy không ảnh hưởng đến kiểu hình của tính trạng quan tâm vì chúng chỉ định vị gần hay liên kết
15
với gene kiểm soát tính trạng. Tất cả các marker phân tử giữ một vị trí chuyên biệt trong genome trên nhiễm sắc thể gọi là “loci”. Có ba loại marker chính:
- Marker hình thái là những tính trạng hay đặc tính về kiểu hình, nhìn thấy được bằng mắt thường như màu sắc hoa, kích thước hạt, màu da.
- Marker hóa sinh bao gồm sự khác nhau về alen của các enzyme gọi là isozyme, là sự khác biệt trong enzyme được phát hiện nhờ điện di và nhuộm màu chuyên biệt.
- DNA marker thể hiện những vị trí khác nhau trong genome được sử dụng rộng rãi nhất nhờ sự phong phú của nó. Chúng xuất phát từ các loại đột biến khác nhau của DNA như đột biến điểm, đột biến chèn hay mất đoạn, hay lỗi trong quá trình sao chép của DNA được lặp lai một cách có thứ tự (Paterson A.H.,1996).
Những marker này trung tính chọn lọc vì chúng luôn định vị trong những vùng không mã hóa của DNA. Không giống với marker hình thái và sinh hóa, DNA marker không bị giới hạn về số lượng và không chịu tác động bởi các yếu tố môi trường hay các giai đoạn phát triển của thực vật. Các DNA marker tách biệt như vậy được sử dụng trong xây dựng bản đồ liên kết gene nhằm ứng dụng trong chọn giống thực vật (Winter P.,and Kahl G., 1995).
Bất lợi chính của các marker hình thái và hóa sinh là chúng bị giới hạn trong số lượng và bị tác động bởi các yếu tố môi trường hay các giai đoạn phát triển của thực vật. Mặc dù có những hạn chế, nhưng các marker hình thái và hóa sinh rất hữu ích trong chọn giống thực vật .
DNA marker được phân chia rộng thành ba nhóm dựa vào phương pháp phát hiện chúng: Marker dựa trên cơ sở của phản ứng PCR và marker dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò, lai DNA và marker dựa trên trình tự DNA. Về bản chất, DNA marker thể hiện sự khác nhau về mặt di truyền có thể xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật điện di và nhuộm màu với chất hóa học (Ethidium bromide hay bạc) hay phát hiện với phóng xạ hay probe nhuộm màu. DNA marker có công dụng đặc biệt nếu chúng thể hiện sự khác biệt giữa các cá thể cùng loài hay khác loài. Những marker này gọi là marker đa hình, ngược lại những marker không phân biệt giữa các kiểu gen được gọi là marker đơn hình. Những mô tả này dựa trên khả năng có hay không sự phân
16
biệt giữa đồng hợp tử và dị hợp tử. Codominant marker chỉ ra sự khác biệt về kích thước, ngược lại dominant marker chỉ sự có mặt hay vắng mặt. Nói đúng ra, các dạng khác nhau của DNA marker (như các band kích thước khác nhau trên gel) được gọi là marker “alen”. Codominant marker có thể có nhiều alen khác nhau, ngược lại một dominant marker chỉ có hai alen. (Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005;
Jones N., OughamH., and Thomas h., 1997).
Nguồn: Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005 Hình 2.2: DNA marker giữa các kiểu gene A, B, C, D
Các marker đa hình được đánh dấu bằng mũi tên. Các marker không phân biệt được giữa các kiểu gen được gọi là các marker đơn hình. (a) Các SSR marker thể hiện sự khác biệt về kích thước cho những alen của 4 kiểu gene và thể hiện một locus di truyền đơn. (b) Các marker được tạo thành bằng kỹ thuật RAPD.Những marker này thể hiện sự có mặt hoặc vắng mặt. Thông thường, kích thước của những marker này được xác định dựa vào trọng lượng phân tử của thang DNA chuẩn (molecular weight DNA ladder). Trong 4 maker đa hình, chỉ có hai alen khác nhau.
17
Nguồn: Collard, Jahufer, Brouwer and Pang, 2005 Hình 2.3: So sánh giữa (a) codominant marker và (b) dominant marker.
Codominant marker có thể phân biệt rõ ràng giữa đồng hợp tử và dị hợp tử, ngược lại dominant marker thì không. Kiểu gene tại hai marker loci (A và B) được viết bên dưới bản gel.
Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể. Những tính trạng này được xác định trên nhiễm sắc thể tuỳ thuộc vào mức độ liên kết của nó. Sự sắp xếp một cách độc lập các nhiễm sắc thể giúp cho việc định vị của loci trong các nhóm liên kết gen. Sự xuất hiện của hiện tượng quấn chéo (crossing cover) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự của các loci trong nhiễm sắc thể. Khoảng cách di truyền trên bản đồ được đo bằng tần số tái tổ hợp gen (recombinations). Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ được kiên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được-gen đó có thể xem như là marker gen (Nguyễn Thị Lang, 2005).
18
Bảng 2.2: Các loại DNA markers thông dụng
Markers Tên đầy đủ
RFLP Restriction fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
AFLP Amplified fragment length polymorphism
RAPD Random amplified polymorphic DNA
DAF DNA amplification fingerprinting
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
AP – PCR Arbitrary primer – PCR
SSCP Single strand coformation polymorphism MRDHV - DNA Moderately repeated, dispersed, and highly
variable DNA (minisatellite)
SNP Single nucleotide polymorphism
Nguồn: Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2002
DNA marker đã được chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần “isozyme marker” (Tanksley và ctv. 1980). Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và tương lai sẽ rẻ tiền hơn nhờ sự cải tiến không ngừng của các nhà khoa học.
Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như là một DNA marker. Các DNA markers có thể được chia thành hai nhóm như sau:
- PCR - based: ALP, AFLP, SSR, SSCP.
- DNA/ DNA hybridization-based: RFLP, minisatellite.
Các markers thuộc nhóm PCR-based có thể được chia nhỏ thành:
MAAP
Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP – PCR.
DAF, AFLP.
Và amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP
19