do an chuyen mon pdf

MỞ ĐẦUCông nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên vòm lá với hàng nghì

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên vòm lá với hàng nghìn quả đó là các loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y học, năng lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường

Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán và điều kiện nghèo phân bón Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và khắc phục được

sự tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian Kỹ thuật tái tổ hợp AND và các kỹ thuật in vitro mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền

Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt

Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế Ý thức được triển vọng to lớn của ngành khoa học hiện đại này, chúng tôi xin giới thiệu quyển sách công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các cơ quan có liên quan

Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể Kỹ thuật này ra đời nhanh chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây trồng Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) Vì thế nuôi cấy mô tế bào

còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá

phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp Từ những thực tế nêu trên tôi chọn đề tài: “Tìm hiểu về tổng quan các phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống cho cây thân gỗ”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

1.1 Khái niệm nuôi cấy mô và nhân giống cây thân gỗ

Nuôi cấy mô là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo ở điều kiện môi trường

Nhân giống in vitro hay còn gọi vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho việc

ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác

Thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy

mô thay đổi cho nhau để chỉ cho mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện

vô trùng Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro.

Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture) Vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây thân gỗ Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng mà không đề cập các nội dung khác

Nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên Ví dụ: cây

mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt) Vì thế nuôi cấy mô còn là biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp Mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp,

giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp

Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau 4-

8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985) Điều đó chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ như cây mọc từ hạt

1.2 Lịch sử phát triển

Năm 1838, nhà thực vật học Matthias Jacob Schleiden và năm 1839 nhà động vật học Theodor Schwann mới chính thức xây dựng học thuyết tế bào Học thuyết khẳng định rằng: Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thể của tế bào Theo ông mỗi tế bào bất kì của một thể sinh vật đa bào đều có tiềm tàng để phát triển nhanh thành một cá thể hoàn chỉnh Năm 1898 Ông bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn tách từ nhu mô

lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật nhưng không thu được kết quả nào Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ Nhưng sự sinh trưởng này chỉ diễn ra trong một thời gian rồi chậm dần và ngừng hẳn mặc dù đã chuyển sang môi trường mới Cùng trong thời gian này, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 hormone thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công Năm 1955, Miller và cs đã phát minh

cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin- một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng

độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng khác nhau Năm 1952, Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công Kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng phương pháp vô tính khác nhau, đặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh Năm 1960, Morel đã thực hiện kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật

Năm 1960, Cocking tách được tế bào trần Năm 1971, Takebe và cs đã tái sinh được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá Năm 1972, Carlson và cs lần đầu tiên thực hiện lai tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfii Năm 1978, Melchers và cs tạo được cây lai soma "Cà chua Thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này Đến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x), cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai)

Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy

mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm Năm 1977, Noguchi và cs đã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20,000 lít Năm 1978, Tabata và cs đã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Họ đã chọn lọc được dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn Năm 1985, Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn đã được thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất sinh dược

1.3 Nguyên lý thực hiện

1.3.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào

1.3.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genome) Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào

Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ

1.3.1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào

sự phân hoá

Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của

mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá

có thể diễn như sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng

Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,chúng lại

có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994)

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năngcủa tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin

và Cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo

ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở sơ đồ bên Theo sơ

đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA, NAA,

2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus).

1.2 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau:

1.2.1 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem

là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng

và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Cho đến nay, đã có nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất quan trọng Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể

Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:

+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991) Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994)

+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+ và NO3-(nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4+ Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất + Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg, Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng

ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường được thuận lợi

Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựachọn

sử dụng Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình thànhchồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l) Việc lựa chọn thành phầnvà hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóngvai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952) Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ

mô và giai đoạn nuôi cấy Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994)

+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, cà rốt, chối, khoai tây được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích

sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy

1.4.2 Các chất điều hoà sinh trưởng

Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy

+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6- Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi Trong nuôi cấy

mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6- 10-4 (Lê Văn Chi, 1992)

+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất là GA3 (Gibberellin acid 3) GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973) Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật

và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây

+ Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy, khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (lê Văn Chi, 1992)

+ Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn Trong một số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyên, 1993)

Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường Sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây Nếu pH thấp (<4,5) hặc (>7,0) đều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro Nên việc xác định được độ

pH ban đầu của môi trường cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mô cấy là cần thiết Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 -6

1.4.3 Môi trường vật lý

Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ

+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các

mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng

Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ

1000 - 7000 lux (Moresin, 1974) Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo

Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin,

do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200C/150C hoặc 200C/180Ctỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn Ở nhiệt độ trung bình thì

hoạt động trao đổi chất tốt hơn Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không

có tổ chức Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ

25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô

1.2.4 Vật liệu nuôi cấy

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân giống in vitro Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công Thực tế cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non,

tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995)

1.4.5 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy in vitro Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ

bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại

Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh

Phương tiện khử trùng

• Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm, 120 -1300C)

• Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy

• Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường

sử dụng các dung dịch như HgCl2 (clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit natri),

Ca (0Cl)2 (Hypoclorit canxi), H202 (ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy

• Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng Hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào

• Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ Buồng phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu đèn tử ngoại

• Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác

1.2.6 Buồng nuôi cấy

Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy Buồng cấy cần phải đảm bảo các điều kiện:

- Nhiệt độ: 25 - 300C

- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux

- Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài

1.3 Mục đích nuôi cấy mô

1.3.1 Ưu điểm của vi nhân giống

Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để

loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo

ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau

có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ

Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ

1.3.2 Hạn chế của vi nhân giống

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy

và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo

Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHO CÂY THÂN GỖ

2.1 Đặc điểm cây thân gỗ

Nhân giống nuôi cấy mô để cho cây thân gỗ ở Việt Nam còn mới, một số cây thân gỗ như: cây thông đỏ, cây bạch đàn, cây keo lai, cây tre… Mục đích đem lại của việc tạo là thường tạo ra để chống xói mòn, sạt lở đất do thiên tai hay lấy nguồn gỗ cho nhiều nguồn có giá trị kinh tế cao.

Cây thân gỗ là sống lâu năm, thường một số cây nhân giống có nguồn gốc xuất

xứ từ các nước du nhập vào trong nước, như cây keo lai có nguồn gốc ở Australia được trồng phổ biến ở Đông Nam Á, ở Việt Nam cây được trồng rộng rãi trên toàn quốc trong những năm gần đây Cây thân gỗ mọc tốt ở hầu hết các dạng đất, thích nghi cao, thường tận dụng các loại đất bạc màu, khô cằn Bằng các kỹ thuật hiẹn đại các nhà nhân giống thường tạo ra các giống cây để thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt của khí hậu

Trên thực tế cây thân gỗ cho năng suất còn rất thấp, sản phẩm tạo ra không những ít mà còn phát triển cũng khó khăn Nguyên nhân là do phần gỗ quá nhiều làm

tế bào thiếu nước, trong cây thường chứa nhiều chất hạn chế quá trình phản phân hóa chủa tế bào Khi thực hiên nuôi cấy trên cây thân gỗ cần nghiên cứu chính xác từng loại cây để taaoj ra năng suất như mong muốn

2.2 Phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống

2.2.1 Vi nhân giống cây thân gỗ còn non

Cây còn non là cây trồng từ hạt được một năm tuổi Nhân giống thông qua hai con đường nuôi cấy cơ quan và nuôi cấy phôi Thông dụng là nuôi cấy cơ quan nuôi cấy cơ quan và nuôi cấy phôi khác nhau ở chỗ phát sinh chồi ngọn hay chồi bên đầu tiên và sau đó phát triển rễ, cây hoàn chỉnh được tái tạo

Trong nuôi cấy phôi thì phôi phát sinh đầu tiên sau đó hình thành lá mấm và rễ,

là giai đoạn nảy mầm thành cây hoàn chỉnh

2.2.1.1 Nuôi cấy cơ quan

Các bước nhân giống và môi trường 4 bước

- Hình thành chồi từ mẫu cây đưa vào nuôi cấy

- Vươn thân và nhân giống

- Tạo rễ