TCNCYH 22 2 - 2003 Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi multiplex trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy Trần Trí Tuệ 1 , Lê Văn Phủng 2 1 Trung tâm Y tế dự phòn
Trang 1TCNCYH 22 (2) - 2003
Góp phần nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex) trong phân loại Escherichia coli gây tiêu chảy
Trần Trí Tuệ 1 , Lê Văn Phủng 2
1 Trung tâm Y tế dự phòng Lào cai
2 Đại học Y Hà Nội
Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi trong xác định các chủng E coli gây tiêu chảy đã được nghiên cứu chi tiết Sự phân bố của 300 chủng E coli phân lập từ các bệnh phẩm: phân (150), nước tiểu (40), máu (30), dịch mật (40), mủ (40) cũng đã được xác đinh bằng PCR đa mồi dùng trong tiêu chảy
ADN được tách chiết từ các chủng E coli và các chủng chuẩn khác thuộc Enterobacteriaceae, sau đó tiến hành phản ứng PCR với 8 cặp mồi Kết quả như sau:
1 Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) so với chủng chuẩn là 100%
2 Độ đặc hiệu của phản ứng PCR với 8 cặp mồi đã chọn từ các vi khuẩn: Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwasdsiella tarda, Escherichia coli ATCC 25922 là 100%
3 Không phân biệt được EIEC với Shigella bằng phản ứng PCR với bộ mồi đã thiết kế cho EIEC Jal
4 Các chủng E coli gây tiêu chảy được phân lập từ trẻ em khoẻ mạnh là 10% (EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%)
5 Các chủng E coli gây tiêu chảy được phân lập từ mủ, dịch mật, máu, nước tiểu là 1,33% và có
sự phân bố không đồng đều theo vị trí gây bệnh
I Đặt vấn đề
Tiêu chảy là một bệnh khá phổ biến ở các
nước trên thế giới, đặc biệt tại các nước đang
phát triển Tỷ lệ mắc và tử vong do tiêu chảy
rất cao ở trẻ em Theo ước tính của Tổ chức Y
tế thế giới (WHO), hàng năm có trên 1 tỷ lượt
trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy với gần 5 triệu
trẻ tử vong [5] ở nước ta, tiêu chảy là nguyên
nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng, là nguyên
nhân gây tử vong đứng hàng thứ 2 ở trẻ em (chỉ
xếp sau nhiễm khuẩn đường hô hấp)
Nhiều tác nhân vi sinh vật khác nhau có thể
gây ra tiêu chảy, trong đó Escherichia coli
thường chiếm tỷ lệ cao Theo nghiên cứu của
các tác giả trên thế giới tỷ lệ E coli gây tiêu
chảy ở trẻ em từ 21-60%, còn ở Việt Nam tỷ lệ
này là 23,4 - 44,8% [1, 2, 3, 7, 9, 10]
Nhiều phương pháp chẩn đoán E coli gây
tiêu chảy đã được áp dụng Ngay từ những năm
40, người ta đã sử dụng phương pháp định type huyết thanh Sau này các phương pháp chẩn
đoán khác như ELISA, thử độc tính trên nuôi cấy tế bào, các tính chất sinh hoá, sự ly giải bởi phage đã được áp dụng Song, chúng cũng đều
là các phương pháp gián tiếp và đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp, nên ít được ứng dụng trong
phân loại các E coli gây tiêu chảy
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều phương pháp chẩn đoán mới đã ra đời cho phép phát hiện được các gien
đặc hiệu, quyết định khả năng gây bệnh của E coli, trong đó 2 phương pháp, PCR và lai ADN,
được áp dụng phổ biến nhất
Trang 2TCNCYH 22 (2) - 2003
ở Việt Nam, việc chẩn đoán E coli gây tiêu
chảy, chỉ sử dụng phương pháp quai ruột và
định type huyết thanh và cũng chỉ dừng lại ở
ETEC (Enterotoxingenic E coli) và EPEC
(Enteropathogenic E coli), EIEC
(Enteroinvasive E coli), EHEC
(Enterohaemorrhagic E coli) PCR chẩn đoán
E coli trên thế giới đã được dùng phổ biến
nhưng các tác giả đều chỉ dùng đơn thuần một
cặp mồi cho một phản ứng, do vậy tốn kém vật
liệu và thời gian Bởi vậy, việc nghiên cứu áp
dụng một kỹ thuật phù hợp với nhiều cặp mồi,
nhằm phát hiện nhiều loại E coli gây tiêu chảy
trong một phản ứng là hết sức cần thiết và có ý
nghĩa thiết thực Trước tình hình đó chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu:
1 Tìm hiểu độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng PCR đa mồi trong xác định E coli
gây tiêu chảy
2 Tình hình phân bố các chủng E coli có
khả năng gây tiêu chảy phân lập từ phân, máu,
nước tiểu, mủ và mật
II Đối tượng, vật liệu và phương
pháp nghiên cứu
1 Đối tượng
- Chủng E coli mẫu gồm: ETEC ATCC
35401, EHEC ATCC 43890, EHEC ATCC
43889, EPEC ATCC 43887, EIEC ATCC
43893, EAEC ATCC 130C2 do Viện
Karolinska Thụy Điển cung cấp
- Chủng chuẩn của họ vi khuẩn đường ruột:
- Chủng Shigella flexneri, Shigella boydii,
Shigella dysenteriae, Citrobacter freundii,
Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella
pneumoniae, Enterobacter aerogenes,
Edwardsiella tarda, Escherichia coli ATCC
25922 do Trung tâm lưu trữ nguồn gene vi sinh
vật gây bệnh, bộ môn Vi sinh vật trường Đại
học Y Hà Nội cung cấp
- Chủng E coli từ bệnh phẩm: phân (150),
nước tiểu (40), máu (30), mật (40), mủ (40) đã
được xác định bằng các phương pháp thông thường
2 Vật liệu
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey, DCA
- Môi trường dùng trong chẩn đoán gồm: KIA, ure-indol, mannitol - di động, Citrat Simmons
- Môi trường cấy vi khuẩn chuẩn bị cho tách chiết ADN: thạch thường đĩa
- Sinh phẩm, máy móc dùng trong PCR: + 8 cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 5 loại
E.coli gây tiêu chảy: LT l-LT r, STI2 l-STI2 r,
VT1 l-VT1 r, VT2 l-VT2 r, eae u-eae l, SHIG 1-SHIG 2, bfp2 u-bfP2 l, EA L-EA U
+ Máy ly tâm lạnh (Beckman Avanti TM 30), máy điều nhiệt tự động Thermal Cycler (Eppendorf Đức), bộ điện di ngang (Advance Co.LTD, Nhật Bản), máy chụp ảnh gel và phim
ảnh Kodak cỡ 667
3 Phương pháp
- Từ các chủng E.coli mẫu, các chủng thuộc
họ vi khuẩn đường ruột đã kể ở trên và các chủng vi khuẩn, bệnh phẩm được tách chiết ADN bằng nhiệt theo quy trình của Viện Krolinska Thụy Điển
- Sau đó tiến hành chạy phản ứng PCR đa mồi (8 cặp mồi) với chu kỳ như sau: 1 chu kỳ
96oC/4"; 30 chu kỳ: 94oC/20", 50oC/20",
72oC/10"; 1 chu kỳ: 72oC/7" giữ ở 4oC
- Sản phẩm của phản ứng PCR đa mồi được tiến hành điện di trên thạch agarose 1,5% Từ
các chủng E.coli mẫu để xác định độ nhạy, các
chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột
để xác định độ đặc hiệu còn các chủng từ bệnh phẩm để xác định tình hình phân bố các chủng
E coli gây tiêu chảy
Trang 3TCNCYH 22 (2) - 2003
III Kết quả
1 Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi
Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ 5 chủng E.coli mẫu
1 Chứng âm 2 EIEC (320 bp) 3 EHEC (130, 298, 376 bp) 4 ETEC (147, 322 bp)
5 EAEC (630 bp) 6 EPEC (367, 376 bp) 7 Thang ADN chuẩn
2 Độ đặc hiệu của PCR đa mồi
Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi với các vi khuẩn
có quan hệ di truyền gần gũi với E coli
1 Chứng âm 2 Edwardsiella tarda 3 K pneumoniae 4 P vulgaris
8
2030 (bp)
1636
1018 506,517
396
344
298
220
201
154
134
9 10
2036 (bp)
1636
1018
506, 517
396
344
298
220
201 154
Trang 4TCNCYH 22 (2) - 2003
5 C Freundii 6 S typhi
7 E coli ATCC 25922
8 Chứng dương ETEC (147, 322 bp)
9 Chứng dương EAEC (630 bp)
10 Thang ADN chuẩn
3 E coli gây bệnh ở đường tiêu hoá
Bảng 1: Kết quả phát hiện các chủng E
coli có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ
phân trẻ em < 5 tuổi (n = 150)
4 E coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt
ở ngoài đường tiêu hoá
Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng E coli
có khả năng gây tiêu chảy phân lập từ các bệnh
phẩm ngoài đường tiêu hoá (n = 150)
IV Bàn luận
Về độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi: kết
quả độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi của các
chủng E coli mẫu là 100% Mặc dù sử dụng
nhiều cặp mồi hơn song chúng tôi thấy rằng
không có hiện tượng ức chế lẫn nhau giữa các
cặp mồi trên Kết quả của chúng tôi phù hợp
với kết quả nghiên cứu của các tác giả trước
như Katsuaki Hoshino Or Jan Olsvik, Akioabe,
Sandrinsa Tacyphipps mặc dù chúng tôi sử
dụng nhiều cặp mồi hơn Chúng tôi cũng tiến
hành thử nghiệm độ lặp lại (100 lần) với các
chủng E coli mẫu Kết quả độ lặp lại của PCR
trong các chủng E coli mẫu là 100% (trừ
EIEC) Như vậy độ tin cậy của kết quả này rất cao
PCR đa mồi cũng được dùng để xác định
các chủng E coli có khả năng gây tiêu chảy từ
các bệnh phẩm lâm sàng Các chủng này đã
được xác định bằng phương pháp PCR đơn mồi
là chắc chắn có gien gây bệnh, chúng được coi như những chủng chuẩn Kết quả của chúng tôi cho thấy bằng phương pháp PCR đa mồi có khả năng phát hiện tất cả các chủng này Với kết quả này, chúng ta có thể áp dụng kỹ thuật trên
để chẩn đoán nhanh, chính xác các chủng E coli có khả năng gây tiêu chảy
Về độ đặc hiệu của PCR đa mồi: PCR đa mồi cũng được dùng để tiến hành thử nghiệm
độ đặc hiệu với 7 chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột, chúng có mối quan hệ chặt
chẽ với E coli có khả năng gây tiêu chảy về
nhiều mặt Xét về mặt di truyền học, chất liệu
di truyền của chúng tương đối giống với E coli
gây tiêu chảy Thậm chí chủng thử nghiệm là
E coli ATCC 25922 giống hệt E coli gây tiêu
chảy về hình thái, tính chất sinh vật hoá học, kháng nguyên và tính chất di truyền không mấy khác biệt, vậy mà, độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi vẫn là 100% Tiến hành thử nghiệm lặp lại, độ đặc hiệu cho kết quả 100% Như vậy với độ đặc hiệu cao, PCR đa mồi là
phương pháp chẩn đoán E coli gây tiêu chảy
đáng tin cậy, rất hữu ích khi đưa vào áp dụng thực tế chẩn đoán
Tiến hành xác định độ đặc hiệu của phản
ứng PCR với các chủng Shigella thì thấy rằng không thể phân biệt được các chủng Shigella với E coli bằng PCR với các cặp mồi đã thiết
kế cho EIEC Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của các tác giả trên thế giới vì Shigella và
EIEC rất giống nhau về mặt di truyền học Để phân biệt chúng cần phải thiết kế một số cặp mồi đặc hiệu hơn
E coli gây bệnh ở đường tiêu hoá: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng tỷ lệ E coli
có khả năng gây tiêu chảy ở đường tiêu hoá là 10% Kết quả này tương đương với nghiên cứu
Trang 5TCNCYH 22 (2) - 2003
của các tác giả khác thuộc các nước lân cận
như Lào 11%, ân Độ 9%, Tây Thái Lan 7%,
nông thôn Israel 11% [4, 6, 8, 10] tuy hơi cao
hơn so với kết quả nghiên cứu của một số tác
giả trong nước nghiên cứu trước đây như:
Hoàng Tiến Mỹ 1,6%; Nguyễn Phương Lan
3,5%; Hoàng Thu Thuỷ 5% [1, 2, 3] Trong
nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ nhiễm EAEC là
cao nhất 6,7%, đây là một tác nhân gây bệnh
mới được quan tâm gần đây Tuy nhiên theo
kết quả nghiên cứu của các tác giả trong nước
và các nước lân cận như Lào, Thái Lan [8, 10]
thì chưa phát hiện được các trường hợp nhiễm
EAEC nào Trái lại tỷ lệ này đặc biệt cao ở các
nước Châu Mỹ 15-31% [7, 9]
Chúng tôi không phát hiện được 1 trường
hợp nhiễm EPEC nào, điều này không có nghĩa
là chủng vi khuẩn này không gây bệnh ở Việt
Nam mà có thể do cỡ mẫu của chúng tôi còn
nhỏ nên chưa phản ánh tình hình gây bệnh của
vi khuẩn này Chúng tôi cũng phát hiện được tỷ
lệ nhiễm EHEC là 0,66%, đây là chủng vi
khuẩn ít gặp ở Châu âu, Bắc Mỹ thì ngày nay
đã xuất hiện ở trẻ khoẻ mạnh ở Việt Nam
Chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu tỷ lệ
E coli gây tiêu chảy ở 3 cộng đồng dân cư
khác nhau như Sa Pa (Lào Cai), Thanh Trì (Hà
Nội), Cát Bà (Hải Phòng) với 50 mẫu Kết quả
cho thấy: tỷ lệ E coli có khả năng gây tiêu
chảy ở 3 cộng đồng dân cư là khác nhau Tại Sa
Pa tỷ lệ E coli có khả năng gây tiêu chảy là
20%, cao hơn hẳn Thanh Trì 6% và Cát Bà 4%
Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê
(p<0,05) Tuy nhiên sự khác biệt giữa tỷ lệ E
coli gây tiêu chảy ở Cát Bà và Thanh Trì không
có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
E coli có khả năng gây tiêu chảy có mặt ở
ngoài đường tiêu hoá : tỷ lệ phân lập được E
coli gây tiêu chảy ở ngoài đường tiêu hóa là
1,33%, thấp hơn E coli gây bệnh ở đường tiêu
hoá với 1 tỷ lệ có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Chúng tôi phát hiện được một chủng EAEC
phân lập từ nước mật và một chủng EAEC phân
lập từ mủ Điều này gợi ý cho chúng ta thấy
rằng các chủng E coli ngoài khả năng gây tiêu
chảy còn có khả năng gây bệnh ở những nơi
khác Tỷ lệ E coli gây tiêu chảy gây bệnh ở ngoài đường tiêu hóa thấp hơn E coli gây bệnh
ở đường tiêu hóa với một tỷ lệ có ý nghĩa thống
kê (p < 0,05)
V Kết luận Qua nghiên cứu chúng tôi có một số kết luận sau:
1 Độ nhạy của phản ứng PCR đa mồi (8 cặp) với các chủng chuẩn là 100%
2 Độ đặc hiệu của phản ứng PCR 8 cặp mồi đã chọn
với các vi khuẩn Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda, Escherichia coli ATCC 25922 là 100%
3 Không phân biệt được EIEC với Shigella bằng
phản ứng PCR với cặp mồi (đã thiết kế cho
EIEC) ial
4 Tỷ lệ E coli gây tiêu chảy phân lập ở trẻ
khoẻ mạnh là 10% trong đó EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33% Có sự phân bố không đồng đều giữa 3
địa phương đó là: Sa Pa 20%, Thanh Trì 6%, Cát Bà 4%
5 Tỷ lệ E coli gây tiêu chảy phân lập từ mủ,
mật, nước tiểu và máu là 1,33% và có sự phân
bố không đồng đều giữa các vị trí gây bệnh:
mủ 2,5%, mật 2,5%, máu 0%, nước tiểu 0%
Cảm ơn: Công trình này được thực hiện tại Labo trung tâm Y sinh học và Bộ môn Vi sinh Y học trường Đại học Y Hà Nội
Tài liệu tham khảo
1 Nguyễn Phương Lan, Nguyễn Thị Kim Tiến,
Lê Xuân Sơn (1998), Tác nhân vi sinh vật trong tiêu chảy kéo dài của trẻ dưới 5 tuổi tại cộng
đồng Tạp chí Vệ sinh phòng dịch,2 (36): 50
2 Hoàng Tiến Mỹ (1997), Khảo sát các vi
khuẩn thường gây tiêu chảy cấp ở mọi lứa tuổi
và tính kháng thuốc Luận án Tiến sỹ Y khoa, Trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh
3 Hoàng Thu Thủy (1988), Góp phần nghiên cứu các chủng Escherichia coli gây tiêu chảy
Trang 6TCNCYH 22 (2) - 2003
cÊp ë trÎ em t¹i Hµ Néi LuËn ¸n Phã tiÕn sü y
häc, ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ
4 Bhan MK, Raj P, Levine MM (1989),
Enteroaggregative Escherichia coli associated
with persistent diarrhea in a cohort of rural
children in India J Infect Dis, 159(6): 1061- 4
5 Jan Holmgren and Ann- Mari Svennerholm
(1992), Bacterial enteric infection and vaccine
development Gastroenterology Clinics of north
America, 21(2): 283-302
6 Lerman Y., Slepon R., Cohen D (1994),
Epidemiology of acute diarrhea disease in
children in a high standard of living rural
settlement in Israel J Pediatrics infect Dis,
13(2): 116-22
7 Paniagua M., Espinoza , Ringman M
(1997), Analysis of incidence of infection with
enterotoxigenic Escherichia coli in a prospective cohort study of infant diarrhea in Nicarago J Clin Microbiol, 35 (6): 1404
-1410
8 Peter Echeverria, Charles W.Hoge (1994), Etiology of diarrhea in a rural community in Western Thailand: Importance of enteric vruses
and enterovirulent Escherichia coli" J infect Dis, 169: 916-9
9 Quiroga M, Oviedo P (2000), Asymptomatic infections by diarrheagenic Escherichia coli in children from Misiones, Argentina, During the first twenty months of their lives Rev Isnt Med Trop Saopaulo, 42 (1): 9-15
10 Yamashiro T, Nakasone N, Higa N (1998), Etiological study of diarrheal patients in Vientiane, Lao People’s Democratic Republic
J Clin Microbiol, 36(8): 2195-9
Summary study on multiplex PCR in diagnosis
of diarrhea-causing E coli The study used 300 E coli strains isolated from specimens: stool (150), urine (40), blood (30), billiary fluid (40), pus (40) to find sensitivity and specificity of multiplex PCR in diagnosis of E coli strains causing diarrhea and distribution of E coli which have ability causing diarrhea in these
specimens
DNA was extracted from E coli control strains, reference strains belong to Enterobacteiaceaer and E coli strains from Karolinska Institute (Sweden) and then carrying out multiplex (8 primer
pairs) PCR reaction The results were showed as following:
1 Sensitivity of multiplex PCR (8 pairs) with standard strains was 100%
2 Specificity of the PCR with the bacteria such as: Citrobacter freundii, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Edwasdsiella tarda, Escherchia coli ATCC
25922 was 100%
3 Unable to differentiate EIEC with Shigella by PCR reaction with the primer-pairs designed for EIEC jal
4 Percentage of E coli strains causing diarrhea isolated from healthy children was 10%
(EAEC 6,7%; EHEC 0,66%; EIEC 1,33%; EPEC 0%; ETEC 1,33%) Having unbalance distribution among 3 studied areas: Sapa 20%, Thanh Tri 6%, Cat Ba 4%
5 Percentage of E coli strains causing diarrhea isolated from pus, billiary fluid, blood, urine
was 1,33%
