Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân Đọc thêm thuvienykhoa.vn ppt

coli gây tiêu chảy từ phân Nguyễn Vũ Trung 1 , Lê Huy Chính 1 , Lê Văn Phủng 1 , Andrej Weintraub 2 1 Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội, 2 Khoa Vi sinh -Miễn dịch -Bệnh học Bệnh viện H

Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi

trong chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân

Nguyễn Vũ Trung 1 , Lê Huy Chính 1 ,

Lê Văn Phủng 1 , Andrej Weintraub 2

1 Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội,

2 Khoa Vi sinh -Miễn dịch -Bệnh học Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska-Thuỵ Điển

Kỹ thuật PCR đa mồi lần đầu tiên được nghiên cứu thành công ở Việt nam bằng cách phối hợp

8 cặp mồi để chẩn đoán 5 loại E coli gây tiêu chảy (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC) từ phân trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy Kỹ thuật này cho phép chẩn đoán chính xác 5 loại E coli gây tiêu

chảy chỉ bằng một phản ứng PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu gần 100% và tiết kiệm nguyên vật liệu, thời gian gấp 5 lần so với tiến hành từng phản ứng PCR riêng biệt Qua phân tích 310 bệnh

phẩm phân tiêu chảy, 90 chủng E coli gây bệnh đã được phân lập chiếm 29,04% tổng số các bệnh

phẩm Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm 18,71%, ETEC 2 chủng (0,65%), EPEC 24 chủng (7,7%), và EIEC 6 chủng (1,94%)

i Đặt vấn đề

Tiêu chảy là một vấn đề sức khoẻ toàn cầu

Bệnh hay gặp ở trẻ em ở các nước đang phát

triển, có ít nhất 1 tỷ trường hợp tiêu chảy hàng

năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu Trung bình

một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy Tại

Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy, số lần

bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ

2,2 – 6 Tại các nước công nghiệp phát triển,

tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em, người già

và các khách du lịch đến các nước đang phát

triển Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy

Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò quan trọng

Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy, E coli

hiện nay là căn nguyên nổi trội, thu hút được sự

quan tâm của các bác sĩ lâm sàng, nhi khoa, vi

sinh vì nó là căn nguyên của 1/3 số trường hợp

tiêu chảy Việc chẩn đoán gặp khó khăn vì các

triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu Có 5 loại

E coli gây tiêu chảy, được phân loại theo các

cơ chế gây bệnh khác nhau dựa trên các gien

nằm trong tế bào vi khuẩn mã hoá cho các yếu

tố độc lực: Enteropathogenic E coli (EPEC),

enterohemorrhagic E coli (EHEC),

enterotoxigenic E coli (ETEC), enteroinvasive

E coli (EIEC) và enteroaggregative E coli

(EAEC) [3, 4] Hiện nay có bốn phương pháp

được dùng để chẩn đoán các E coli này:

• Dựa vào các tính chất sinh vật hoá học

• Định týp huyết thanh

• Các thử nghiệm dựa trên những đặc

điểm về độc lực

Các phương pháp này hầu như không thể chẩn đoán được hoặc rất tốn kém

• Các phương pháp sinh học phân tử:

+ Hiện nay chủ yếu là hai phương pháp: Mẫu dò ADN (ADN probe) và phản ứng chuỗi (Pylymerase Chain Reaction - PCR) Tuy nhiên độ nhạy của phương pháp mẫu dò ADN

thấp, thao tác phức tạp và đòi hỏi một số lượng

lớn vi sinh vật trong bệnh phẩm

+ PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic

trong ống nghiệm Trong đó, một đoạn ADN

được nhân lên đặc hiệu Trong kỹ thuật này, hai

đoạn oligonucleotid, được gọi là mồi, gắn đặc

hiệu vào đoạn ADN đích và được khuếch đại

theo một số chu kỳ được lặp đi lặp lại Chu kỳ

này gồm việc làm tách hai sợi của đoạn ADN,

gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo

nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn

oligonucleotid dưới tác động của enzym ADN

polymerase Trong PCR, ADN đích được tăng

lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ Sản phẩm

của PCR được phát hiện sau khi điện di trên

agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc

dưới ánh sáng đèn cực tím

PCR là phương pháp đang được áp dụng

rộng rãi vì cho kết quả nhanh, chính xác, độ

nhạy và độ đặc hiệu cao Hiện nay, trên thế

giới, PCR đang được nghiên cứu và ứng dụng

trong chẩn đoán E coli gây tiêu chảy Bình

thường trong một phản ứng PCR, người ta dùng

một cặp mồi để khuếch đại một đoạn gien đặc

hiệu Để chẩn đoán xem trong bệnh phẩm có 1

trong số 5 loại E coli gây tiêu chảy cần ít nhất

6 PCR riêng rẽ Như vậy rất tốn kém Vấn đề

đặt ra là làm sao xác định được vi khuẩn này

mà chỉ cần duy nhất 1 phản ứng PCR ? Nếu

vậy, chúng ta không những tiết kiệm được

nguyên vật liệu và thời gian mà còn tránh được

sự nhiễm trong kỹ thuật này Vì vậy, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu này nhằm hai mục tiêu:

1 Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi trong

chẩn đoán E coli gây tiêu chảy

2 ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán các

E coli gây tiêu chảy từ phân trẻ em dưới năm

tuổi bị tiêu chảy

II đối tượng và Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu Đánh giá một nghiệm

pháp chẩn đoán và nghiên cứu mô tả

PCR chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ

bệnh phẩm phân Chúng tôi sử dụng thường

qui chẩn đoán E coli gây tiêu chảy bằng PCR

theo thường qui của Khoa Vi sinh lâm sàng, Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển Bệnh phẩm phân sau khi thu thập được cấy lên trên môi trường cho

vi khuẩn đường ruột, để ở 370 C sau 18-24 giờ

Vi khuẩn trên đĩa môi trường được hoà vào dung dịch đệm phosphat, đun cách thuỷ ở

1000C trong 20 phút để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn ADN của vi khuẩn được giải phóng Ly tâm dịch này với tốc độ 4000 vòng/phút trong

10 phút Nước nổi sau khi ly tâm dùng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR Các cặp mồi

được thiết kế đặc hiệu với một số đoạn gen của ETEC, EHEC, EPEC, EIEC, EAEC (INTERACTIVA, Đan Mạch)

Sản phẩm của PCR sau đó được điện di trên agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE để tách biệt các ADN đã được khuếch đại Nhuộm gel sau khi điện di bằng Ethidium bromide và nhìn dưới đèn cực tím sẽ cho phép thấy được các băng ADN đặc hiệu So sánh các băng này với các băng của ADN mẫu

Đoạn gen đích

Mồi Vi khuẩn Cỡ sản

phẩm

elt B LTl-r ETEC 322 bp

est A STI2l-r ETEC 147 bp

vt 1 VT1l-r EHEC 130 bp

vt 2 VT2l-r EHEC 298 bp

eae A eae u-l EHEC/ EPEC 376 bp

bfp A bfpA2u-l EPEC 367 bp

pCVD EA1-2 EAEC 630 bp

Tiêu chuẩn tối thiểu:

ETEC: Có gen eltB và/hoặc estA

EHEC: Có gen vt1 và/hoặc vt 2 Có gen

eaeA,EHEC điển hình

EPEC: Có gen bfpA và eaeA

EIEC : Có gen ial

EAEC : Có gen pCVD

Taq polymerase, MgCl2 và Buffer do Hãng

Perkin Elmer, Mỹ cung cấp

Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập, xác

định E coli được tiến hành theo thường qui

Các chủng E coli 5 chủng E coli gây tiêu

chảy chuẩn quốc tế, 238 chủng E coli từ phân

đã được xác định bằng nhiều phương pháp khác

nhau gồm 99 chủng gây tiêu chảy, 139 chủng

không gây tiêu chảy được cung cấp từ Khoa Vi sinh lâm sàng của Bệnh viện Huddinge-Viện Karolinska-Thuỵ Điển, Trung tâm kiểm soát bệnh nhiễm trùng của Thuỵ Điển, Trung tâm lưu giữ chủng của Trường Đại học

Goterborg-Thuỵ Điển, dự án nghiên cứu về E coli gây

tiêu chảy giữa Thuỵ Điển và Nicaragua

Bệnh phẩm phân 310 mẫu phân từ trẻ

dưới 5 tuổi bị tiêu chảy được thu thập ở 3 bệnh viện tại Hà Nội

III Kết quả

1 Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi

Chúng tôi đã phối hợp thành công 8 cặp mồi trong một phản ứng để chẩn đoán cùng một lúc

5 loại E coli gây tiêu chảy trong phân

PCR đơn mồi PCR đa mồi

1 Nước cất : 11,5 àl

2 Đệm ì10 : 2,0 àl

3 dNTPs (1,25mM) : 1,6 àl

4 MgCl2 25 mM : 1,2 àl

5 Mồi 2,5 àM : 1,6 àl

6 Taq 5 UI/ àl : 0,1 àl

7 ADN từ vi khuẩn : 2,0 àl

1 cặp mồi trong một phản ứng

Thể tích: 20,0 àl

1 Nước cất : 6,7 àl

2 Đệm ì 10 : 2,0 àl

3 dNTPs (1,25mM) : 1,6 àl

4 MgCl2 25 mM : 1,2 àl

5 Mồi 2,5 àM : 6,4 àl

6 Taq 5 UI/ àl : 0,1 àl

7 ADN từ vi khuẩn : 2,0 àl

8 cặp mồi trong một phản ứng

Thể tích: 20,0 àl

Bảng 1 Ưu điểm cuả PCR đa mồi

ADN mẫu 2,0 àl 12,0 àl 2,0 àl 10,0 àl

Thể tích 20,0 àl 120,0 àl 20,0 àl 100,0 àl Qua bảng trên chúng tôi thấy, kỹ thuật PCR đa mồi cho phép tiết kiệm thời gian và nguyên vật liệu (khoảng 5 lần) so với chạy riêng rẽ từng PCR

1 2 3 4 5 6 7

1636

1018

506,517

396

344

298

220

201

154

134

Hình ảnh điện di kết quả PCR đa mồi với các chủng E coli chuẩn (kích cỡ bp)

1 E coli 2 EIEC 3 EHEC 4 ETEC 5 EAEC 6 EPEC 7 ADN mẫu

+ Kỹ thuật PCR đa mồi đ−ợc thực hiện với các chủng E coli chuẩn và cho kết quả rất tốt Chúng tôi đã thực hiện phản ứng này rất nhiều lần để kiểm tra độ ổn định của phản ứng trên các chủng E

coli chuẩn quốc tế và các chủng đ−ợc cung cấp, độ lặp lại là 100%

Bảng 2 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR đa mồi

E coli

PCR

Gây tiêu chảy (n = 99) Không gây tiêu chảy (n = 139)

Tổng số

(n = 238)

= 99 / 99 = 100%

Số E coli gây tiêu chảy dương tính với PCR đa mồi

Độ nhạy =

Tổng số E coli gây tiêu chảy

Số E coli không gây tiêu chảy âm tính với PCR đa mồi

Tổng số E coli không gây tiêu chảy

= 139 /139 = 100%

Độ đặc hiệu =

Bảng 3 Phân bố các E coli gây tiêu chảy phân lập được từ phân

Bảng 3 cho thấy, khoảng 30% số các bệnh phẩm phân tiêu chảy có E coli thuộc một trong 5 loại

E coli gây tiêu chảy, trong đó chiếm đa số là EAEC

Kết quả PCR một số chủng E coli gây tiêu chảy từ phân

1636

1018

506, 517

396

344

298

220, 201

154, 134

1 2 3 4 5 6 7

1 ADN marker 2 EIEC 3 EPEC 4 ETEC 5 EAEC

6 Chứng (+) EIEC 7 Chứng (-) E coli không gây tiêu chảy Kích cỡ (bp)

Bảng 4: So sánh E coli gây tiêu chảy xác định bằng PCR với nuôi cấy phân lập (NCPL) từ 310 mẫu phân

Nếu chỉ dùng phương pháp nuôi cấy phân lập đơn thuần, chúng ta không xác định được các

chủng E coli gây tiêu chảy từ phân

Bảng 5 Một số tính chất sinh vật hoá học chính của các chủng E coli gây tiêu chảy

so sánh với các chủng E coli không gây tiêu chảy

Lên men đường

Di

động

Sinh hơi

Sinh

urease

Sinh

H2 S

Indole

E coli* TK (-) + + +/- +/- +/- - - +

E coli** TK (-) + + +/- +/- +/- - - +

*, E coli gây tiêu chảy ; **, E coli bình thường trong đại tràng

Qua bảng 5 chúng ta thấy không thể phân

biệt các E coli gây tiêu chảy với các E coli

thuộc thành phần khuẩn chí bình thường bằng

các tính chất sinh vật hoá học thông thường

iv Bàn luận

Cho đến nay, vẫn chưa có dấu ấn đặc trưng

nào dựa trên tính chất sinh vật hoá học cũng

như kháng nguyên có thể dùng để phân biệt

các chủng E coli gây bệnh với các chủng E

coli thuộc vi hệ bình thường trong đại tràng

Nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều có

chung một nhân xét rằng PCR là phương pháp

đơn giản, dễ thực hiện và có độ nhậy cao hơn

hẳn các phương pháp khác Độ nhậy và độ đặc

hiệu của phương pháp này đạt tới 90-100% [2]

PCR giúp chẩn đoán một cách nhanh chóng các

tác nhân gây bệnh trên lâm sàng Đối với chẩn

đoán E coli gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân,

lúc đầu các tác giả dùng từng cặp mồi riêng rẽ

để phát hiện từng gien đích Về sau, nhiều cặp

mồi đã được phối hợp để chẩn đoán một hoặc

nhiều loài E coli gây tiêu chảy Jan Olsvik và

Sandrinsa Tacyphipps đã thành công trong việc

dùng 2 cặp mồi LTI và STII trong 1 phản ứng để chẩn đoán ETEC với độ nhạy 100% James B

và cộng sự sử dụng 4 cặp mồi trong một phản ứng kết quả độ nhậy 98,9% Akioabe đã phối hợp 5 cặp mồi trong một phản ứng và kết quả

cho thấy độ nhậy 100% [2, 8] Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sử dụng 8 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR có độ nhậy và độ đặc hiệu gần 100% Qua nghiên cứu, chúng tôi thấy PCR đa mồi dựa trên sự phối hợp 8 cặp mồi đảm bảo

được độ tin cậy về độ nhạy và độ đặc hiệu

trong chẩn đoán 5 loại E coli gây tiêu chảy

Ngoài ra, sử dụng 8 cặp mồi trong một phản ứng giúp tiết kiệm về thời gian và nguyên vật liệu gấp 5 lần so với dùng riêng rẽ từng cặp mồi Thêm nữa, khi giảm số lần tiến hành các phản ứng PCR chúng ta sẽ làm giảm sự nhiễm của phản ứng này Một vấn đề đáng lo ngại của

kỹ thuật PCR

Khi tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi trên các bệnh phẩm phân ở trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu

chảy, chúng tôi đã phân lập được 90 chủng E

coli gây bệnh chiếm 29,04% tổng số các bệnh

phẩm Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm

18,71% Điều đáng nói ở đây là, chúng tôi đã

phát hiện và phân lập được 4 loại E coli gây

tiêu chảy với các tỷ lệ khác nhau Nhiều nhất là

EAEC (18,71%) và ít nhất là ETEC (0,65%)

So với một số tác giả khác, như tại ấn Độ tỷ lệ

E coli gây tiêu chảy chiếm 29,5%, Thái Lan

21% thì tỷ lệ phân lập E coli gây tiêu chảy của

chúng tôi cũng giống như nhiều tác giả khác [6,

7] Tuy nhiên, sự phân bố các loài E coli gây

tiêu chảy trong nghiên cứu của chúng tôi có

khác so với một số tác giả Điều này cũng

tương tự như nhiều nghiên cứu trên thế giới vì

tỷ lệ các vi khuẩn này phụ thuộc vào từng vùng

địa lý khác nhau

Khi so sánh các tính chất sinh vật hoá học

chính của các chủng E coli gây tiêu chảy với

các chủng E coli thuộc thành phần khuẩn chí

bình thường, chúng tôi thấy các đặc điểm này

giống nhau Điều này càng khẳng định những

nghiên cứu trước kia của các tác giả cho rằng,

không thể phân biệt các E coli gây tiêu chảy

với các E coli thường bằng các tính chất sinh

vật hoá học và các đặc điểm về hình thể cũng

như bắt màu Gram, đây là phương pháp dùng

phổ biến hiện nay tại các khoa vi sinh của các

bệnh viện Như vậy, kỹ thuật PCR là một

phương tiện chẩn đoán rất có hiệu quả các loại

E coli này

V Kết luận

PCR đa mồi đã được phát triển thành công

trong chẩn đoán E coli gây tiêu chảy

Độ nhạy và độ đặc hiệu đạt gần 100%

Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn

đoán E coli gây tiêu chảy giúp tránh lây

nhiễm, tiết kiệm thời gian, nguyên vật liệu gấp

5 lần so với dùng PCR đơn mồi

Kỹ thuật PCR đa mồi đã được ứng dụng

thành công trong chẩn đoán E coli gây tiêu

chảy trong phân

Tài liệu tham khảo

1 Hoàng Thu Thủy.: Góp phần nghiên cứu

các chủng Escherichia coli gây tiêu chảy cấp ở trẻ em tại Hà Nội, Luận án Phó tiến sỹ y học,

Viện vệ sinh dịch tễ 1988

2 Akio Abe, Hiromi Obata, Shigeru Matsushita, Sumio Yamada, Yasuo Kudoh.: A sensitive method for the detection of

enterotoxigenic Escherichia coli by the

polimerase chain reaction using multiple

primer pairs, Zbl, Bakt 1992, Vol 277:

170-178

3 Bardhan PK, Albert MJ, Alam NH.: Small bowel and fecal microbiology in children suffering from persistent diarrhea in

Bangladesh, J Pediatr Gastroenterol Nutr

1998, 26(1): 9-15

4 James P Nataro and James.B Kaper.: Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiol Revews 1998, 4 :142-210

5 Jan Holmgren and Ann- Mari Svennerholm.: Bacterial enteric infection and

vaccine development, Gastroenterology Clinics

of North America 1992, 21(2): 283-302

Enteropathogenic Escherichia coli diarrhea in children and in young adults, India J pathol

Microbiol 1995, Vol 38(2): 153-8

7 Leutin B, K.Gleier, Peter Echeverria.: Origin and characteristics of enteroinvasive

strain of Escherichia coli (EIEC) isolated in Germany, Epidemiol Infect 1997, 118:

199-205

8 Okeke IN, Lamikaran A, Steinruck H,

Kaper JB.: Characterization of Escherichia coli

from cases of childhood diarrhea in provincial

Southwestern Nigeria, J Clin Microbiol 2000,

Vol 38(1) : 7-12

Summary

Development and application of multiplex PCR to

diagnose diarrheogenic EScherichia coli from feces

A multiplex PCR has been developed successfully for the first time by combining 8 pairs of primers

to diagnose 5 different types of diarrheogenic Escherichia coli (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC,

EAEC) from fecal samples of children under 5 years old The advantages of this technique are that

it allows to diagnose these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100% In addition, it can save reagents 5 times less than separate PCRs 310 fecal samples from children with diarrhea under 5 years old at 3 hospitals in Hanoi were analysed by the multiplex PCR EAEC (18.7%) was the most common causal agent, followed by EPEC (7.74%), EIEC (1.94%) and ETEC (0.65%) The results suggest that a promissing application of multiplex PCR will be used to diagnose

diarrheogenic E coli